第28卷第1期 山东农业大学学报 1997年3月
Vo.l 28№1 Journal of Shandong AgriculturalUniversity M ar. 1997
文·献·综·述
分子标记在植物遗传育种中的应用
沈法富 刘风珍 于元杰
(山东农业大学作物遗传育种研究所)
APPLICATION OFMOLECULAR MARKERS IN PLANT
GENETICS AND BREEDING
Shen Fafu, Liu Fengzhen, Yu Yuanjie
(Institue ofCrop Genetics and Breeding,Shandong Agri.Univ.,Taian,China,271018)
Key words molecularmark; isozyme;RFLP;RAPD;DNA fingerpriting; plantbreeding
【摘 要】 本文介绍了同工酶、RFLP、DNA指纹和PARD 4种分子标记的发展、原理和特
点,对它们在植物遗传图谱构建、基因定位、变异后代的鉴定和选择、杂交育种、回交育种、杂
种优势等研究领域中的应用作一展望和概述。
关键词:分子标记;同工酶;DNA指纹;RFLP;RAPD;植物育种
中图法分类号:Q943
传统的植物育种是在不甚明了基因背景的条件下,通过杂交和各种育种技术,根据分离群体的形态
表现和育种者的经验等对表现型累代选择,从而实现对基因型的改良。由于环境效应较易掩盖基因效
应,因而育种者对目标性状的选择是耗时和费力的。在遵循和应用常规育种原则和程序下,提高植物遗
传育种的效率和精确度是遗传育种发展的关键。分子标记的发展为解决这一问题开创了新的途径。分子
标记是从生物的某些大分子物质(蛋白质和核酸)的多态性为基础的遗传标记,它们能够稳定遗传,且遗
传方式简单,可以反映生物的个体和群体特征。目前应用广泛的分子标记有同工酶( Isozyme)、限制性
酶切片段的多态性(Restriction fragment length polymorphism)、DNA指纹(DNA fingerprinting)和随机
扩增片段的多态性(Random amplified polymorphic DNA)。本文拟对它们的发现、发展、原理、特点以及
在植物遗传育种中的应用作一简要概述。
1 分子标记的发现、原理和特点
遗传学的研究离不开遗传标记,孟德尔首次利用形态标记推导出遗传因子的分离和自由重组规律。
摩尔根利用果蝇的形态标记阐述了基因的连锁和互换规律,从而为遗传学的发展奠定基础。但是,由于
生物形态标记数量少,且大多数突变性状为不利性状,从而限制了形态标记的应用〔3〕。随着生物技术的
发展相继出现了多种分子标记。
1.1 同工酶
1952年Neilands首次结晶出两种类型的乳酸脱氢酶,并证实它们为同工酶,即它们是来源相同、催
收稿日期: 1995—12—26化反应的性质相同而分子结构有差异的酶蛋白分子,它是基因的产物,因而可作为遗传标记。同工酶作
为遗传标记具有以下特点〔4〕,首先,它比较稳定,不受环境因素的影响。其次,它在种子
和幼苗期就可以
鉴定,且所需植物材料少,除进行酶分析外,还可以对其它性状进行观察,直至收获种子。再次,同工酶为
共显性,即来自双亲的一对等位基因可以在杂交后代中同时检测出来。而不象显—隐性状那样,杂交后
代隐性性状被显性性状所掩盖。目前已对30多种植物进行了40多种同工酶分析,许多重要农作物都已
有了比较完整的同工酶图谱。但是,在植物的群体中,仅有10～20种同工酶表现出位点的多态性〔3, 4〕。因
而限制了同工酶的利用。
1.2 RFLP标记
70年代中期,遗传学家发现了DNA水平上的分子标记——RFLP,它是由限制性内切酶酶解样品
DNA,从而产生大量的限制性内切酶片段,通过凝胶电泳将DNA片段按照各自的长度分开。当酶解
DNA产生的酶切片段数量比较多时,电泳虽按片段的长度分开,但实际形成连续一片。因此,需将电泳
的DNA通过Southern转移至支持膜上,利用某一片段DNA作为探针,使酶切片段跟探针杂交,从而显
示出RFLP。当利用同一种限制内切酶,酶解不同品种的DNA时,由于不同品种的DNA既有同源性又
有变异,因而酶切片段就有差异,这种差别就是RFLP(图1)。它是DNA分子水平上变异的反映,它既可
以是内切酶识别序列的改变,也可能涉及部分片段的缺失、插入、易位、倒位等〔5〕。RFLP作为分子标记
具有独特的优点〔6, 7〕。第一,RFLP标记等位基因之间是共显性的(图1),因而不受杂交方式的限制,对隐
性基因更有利。第二,RFLP标记是反映基因型之间的差异,无表型效应,不受环境条件和发育阶段的
影响。第三,RFLP标记的非等位基因之间不存在上位效应以及其它形式的基因互作。因此,RFLP标记
之间无干扰。RFLP标记也有其不足之处,大多数RFLP多态位点信息含量低,其多态性也过分依赖限
制性内切酶的选用。
图1 RFLP直观图及其共显性示意图
Fig.1 Schematic diagram ofRLFP and its codom inace
图上线段为含有RFLP的DNA区段,在基因型为AA的个体中,这段DNA含有3个某种限制性内切酶切点(如
箭头所示)。由于酶切位点核苷酸的变化(如点突变等),中间酶切位点在等位基因型为aa的个体DNA片段上不存在,
当AA和aa两种基因型的DNA片段被这种限制性内切酶消化并与探针杂交时,则分别显示出两种不同长度(10kb
和15kb)限制性酶切片段。而在杂合体Aa个体DNA片段中,既存在3个酶切位点片段,又存在2个酶切位点片段。
因此,在RFLP杂交图中同时存在10kb和15kb片段,即共显性。
·84·山东农业大学学报 28卷1.3 DNA指纹
1980～1984年,人类遗传学家相继发现了人类基因组中存在着高度变异的重复序列,后称为小卫
星DNA(M inisatellite),它是以11-60bp为重复单位,总
长度由几百个到几千个碱基组成的串联重复
序列,因重复的数目不同,而表现总长度的差异,它分布整个基因组中,但主要存在近端粒处。以小卫星
DNA为探针,与众多限制性内切酶酶解核DNA产生的片段杂交,得到了具有个体特异性的杂交图谱,
这个图谱就是DNA指纹,由于DNA指纹具有个体特异性,其遗传方式简单,因此,它是一种遗传标记。
Jeffreys推测人源小卫星DNA是生物进化过程中保留下来的变异较大的DNA序列〔8〕。因此,可以
用它来检测植物的小卫星DNA。事实证明,利用人源的小卫星DNA作探针,成功地区分了黑麦、水稻〔9〕
等多种植物的不同种,DNA指纹表现了品种的特异性。1987年,A li等〔10〕利用人工合成的寡聚核苷酸(2
-4bp为一个单位的多聚体)为探针,检测到了人的DNA指纹,这些寡核苷酸所检测的位点被称为微
卫星DNA(M icrosatellite)。利用寡核苷酸作为探针,也获得了多种生物的DNA指纹〔11〕。DNA指纹作为
一种分子标记具有以下特点〔12〕。第一,多位点性。对许多物种研究表明,其DNA指纹绝大多数是独立遗
传的,因此,一个DNA指纹图实际能够同时检测到基因组中数十个位点的变异。第二,高度变异性。
DNA指纹表现了个体和群体的高度特异性,同一物种两个随机个体的DNA指纹相似系数仅为0. 22,
二者指纹完全相同的概率为三千亿分之一。第三,遗传方式简单稳定。DNA指纹遵循简单的孟德尔遗
传,后代中的每一条带,都可以在双亲之一的指纹中找到,除非基因突变产生的新带。
1.4 RAPD标记
1990年W illiam s等〔13〕和W elsh等〔14〕两个研究小组同时发现一种新的分子标记——RAPD标记。
它是以DNA聚合酶链反应技术为基础,利用人工合成的短核苷酸作为引物,以从组织中分离得到的
DNA作为模板,通过基因扩增仪合成多态性DNA片段。其基本原理如图2所示。由于不同品种DNA序
列存在着差异,其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异,这样经PCR扩增后就产生了
DNA片段的多态性,这就形成了RAPD标记。RAPD标记具有以下特点〔13, 15〕。
第一,RAPD标记数量多,因为RAPD分析所用引物的数量是无限的,因此它可以覆盖基因组中所
有位点。第二,RAPD标记所需模板DNA量小,因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。第三,
RAPD所用引物没有物种限制,一套引物可以用于不同生物基因组分析。第四,RAPD分析方便、快速,
无需克隆制备、同位素标记、Southern转移等复杂的操作。第五, RAPD标记是显性的(图3),因此,
RAPD标记不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。同时,RAPD分析也保留了PCR反应的缺点,易产
生非特异性带。为了克服RAPD分析的不足,在此基础上又发展了许多新技术。DAF(DNA Amplifi
ed
Fingerprinting)是以大于或等于5个碱基的随机核苷酸作为引物,扩增不同个体的DNA分子,通过聚
丙烯酰胺凝胶电泳和银染分析,使之产生更多的多态性带〔16〕。
SCARS(Sequence Characterized Amplified Regions)是对特异的RAPD标记进行克隆测序,并以此
推测出末端14个核苷酸,然后合成一个24bp的寡核苷酸引物,它包括原来RAPD分析所用10bp和
RAPD标记末端的14bp,然后利用此引物进行基因组扩增分子这技术不仅指出了RAPD标记的分子基
础,而且一些由于缺失、插入引起的多态性,难以用RAPD分析,但可以被SCAPS揭示〔17〕。
除了上述所介绍的4种分子标记外,还有AFLP标记和STS标记,它们主要用于特殊位点标记。表
1比较了上述所介绍分子标记的技术特点和标记的遗传特点。图4概述了各种分子标记的生物学基础
以及它们和其它标记的关系。
·85·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用图2 PARD循环示意图
Fig.2 D iagram ofRAPD cycle
当某一双链DNA分子在200～2000个碱基范围内有一小段( 10个碱基)反向对称DNA序列时(IR),通过单一
引物(P)就可合成一段与该序列以内的DNA互补的新链,而这段新链又可作模板合成另一段新链。
IR
IR
IR
IR
IR
IR
IR
IR
IR
BB
bb
Bb
凝胶电泳图
1kb
BB bb Bb
图3 RAPD标记及显性示意图
Fig.3 D iagram ofRAPD marker and its dom inance
图上某一物种DNA片段,在等位基因B中含有一段反向重复序列(IR),假定某一引物与其配对可扩增出1kb的
DNA片段。等位基因b由于IR序列的核苷酸的变化,引物不能与DNA结合,不能扩增出DNA片段。当杂合体Bb
中,由于含有可扩增出1kb片段的序列,电泳结果可以显示出1kb片段,故RAPD标记为显性标记。
·86·山东农业大学学报 28卷图4 各种遗传标记的分子基础及关系
Fig.4 Them ilecular basis and relationship of each geneticmarker
2 分子标记在植物遗传育种研究中的应用
2.1 遗传图谱的构建和基因定位
表1 4种分子标记的比较
Table 1 The comparision of 4molecularmarkers
比较内容
Comparision contents
同工酶
IsozymeRFLP RAPDDNA指纹图DNA fingerprinting
创立者及年代
Founder and generation
Neilands JB
1952
G rodzicker J et al.
1974
W illiams JG et al.
W elsh J et al.
1990
JeffreysAJ et al.
1985
核心技术
Nuclear technique
电泳技术
生化技术
电泳技术
分子杂交
电泳技术
PCR
电泳技术
分子杂交
多态性类型
Polymorphic type
蛋白质合成
加工、产生的
亚基变异
单碱基突变
插入、缺失
易位、倒位
单碱基突变
插入、缺失
易位、倒位
重复序列的
长度与次数
的差异
多态性水平
Polymorphic number低中中高
技术难度
The difficulty
of technique
低中
中中
可靠性
Reliability高高中高
遗传特性
Genetic character
简单孟德尔
遗传
简单孟德尔
遗传
简单孟德尔
遗传
简单孟德尔
遗传
探针或
引物类型
Type of probe of primer
单一序列
探针
10个bp
随机引物重复序列探针
遗传图谱的构建是对基因组系统研究的基础,是植物遗传育种的依据,由于分子标记是反映基因位
·87·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用点的多态性,因此可以用来构建遗传图谱。利用分子标记构建遗传图谱,不象利用形态标记那样选择专
门的亲本,设计杂交方式,并建立专门的群体。利用分子标记构建遗传图谱可以使用不同的分离群体,它
既可以是暂时性分离群体(F2代和回交一代),也可以是永久性分离群体(F1代花药培养获得的双单倍体
及F2代一粒传获得的重组自交系)。利用分子标记构建遗传图谱的原理跟形态标记一样,二点、三点测
交依然是基本程序,不同的是一个分子标记分离的群体中,可以同时获得几十个乃至几百个标记的数
据,这些数据的处理需要专门的计算机程序来完成。由于利用分子标记构建遗传图谱具有方便、快速、密
度大等特点,因而,许多重要农作物、果树、蔬菜、林木的同工酶〔3, 4〕、RFLP〔5, 18〕、RAPD〔5, 13, 14, 15〕遗传图谱
相继建立。
分子标记还可以对某一特定DNA区域内的目标基因进行定位。根据样品的来源,有两种基因定位
的方法。第一,利用近等基因系进行基因定位。近等基因系是由提供目标基因的供体亲本跟轮回亲本杂
交,并经多次回交,多代对目标性状基因的选择而获得,该系除了目标基因外其余基因大部分同轮回亲
本相同,这样就可以对轮回亲本和近等基因系的同工酶或者DNA进行多态性分析,找出两基因组产物
的差异,并以此为标记,利用遗传图谱,就可以对目标性状基因定位〔19〕。第二,利用对目标性状基因有分
离的F2代群体进行基因定位。原理是依据目标性状将F2代群体分为两组,一组是含有目标性状基因的
纯合体(可由F3代分离情况确定F2代单株是纯合体还是杂合体)。另一组是不含目标性状的纯合体。每
组中随机取10～20株,分别提取其DNA并等量混合,这样就构建了两个DNA库(DNA Pool)。在这两
个DNA库中,目标基因所在的DNA区域完全不同,而其余区域的DNA则近似相同。通过分子标记分
析,可以找出同目标区域相连锁的多态性标记,进而进行基因定位〔20〕。利用分子标记,迄今在玉米、水
稻、番茄、大豆、小麦和棉花等各种农作物上已定位了许多重要农艺性状基因,其中包括作物的抗病性、
抗虫性、耐逆性、光周期的敏感性、雄性不育、育性恢复和矮杆等各种
基因〔4, 9, 18, 19, 20, 21, 22〕。
分子标记不仅能对控制质量性状的基因进行定位,而且还可以对数量性状基因定位。过去,数量性
状的遗传分析一直停留在统计水平上,尽管统计方法日趋精细,但数量性状基因依然是一个形式上的单
位。而分子标记则可以将这些数量定位到某个染色体区段上。具体做法是,选择在某个数量性状有较大
差异的两个亲本类型进行杂交,获得一个F2分离群体,对群体内每个植株进行数量性状测定,同时分析
每个染色体片段上的分子标记,通过比较可以发现某个染色体片段的存在与植株的数量性状密切相关,
这样将微效多基因确定到染色体片段上,每个片段都有自己的分子标记为代表,在育种过程中,可利用
分子标记作为微效基因的选择标记。利用分子标记现已成功定位了水稻的粒形、生育期、产量构成因素
等数量性状基因〔1, 2〕、控制番茄果实重、种子重、果实固形物含量、pH值等数量性状基因也进行了定
位〔23〕。分子标记的发展使木本植物遗传学走出低谷,如控制苹果果实大小、色泽、柱形生长、白粉病抗性
等数量性状基因进行了鉴定并定位〔22〕。随着分子标记研究的深入,分子标记将为研究数量性状之间的
基因互作等基础研究提供依据。
2.2 杂交育种
杂交育种是目前植物育种的重要技术,而杂交亲本的选配是杂交育种的关键步骤。亲本选配必须考
虑的一个重要因素是测定亲本的遗传距离,确定其亲缘关系。由于植物受内外环境因素、数量性状遗传
及显性、上等性等因素的制约,传统方法是利用形态特性分析确定其亲缘关系,这难免出现效率偏低。分
子标记由于受环境因素影响小,且数量大,因而可以快速鉴别亲本之间的亲缘关系。利用同工酶已确定
了水稻、小麦、棉花、番茄等多种作物的亲缘关系〔4, 18〕。利用RAPD标记对29个野生花生品种亲缘关系
的研究跟经典方法研究结果一致〔24〕。RFLP和DNA指纹技术也成功地应用于多种植物的亲缘关系研
究中〔25, 9〕。
2.3 回交育种
回交育种的目的是引入供体目标基因后,通过反复回交恢复受体亲本优良的基因型。通常需要多次
回交才能选择到理想的个体,对于目标性状为隐性基因和数量性状基因所控制的,在选择时则比较困
·88·山东农业大学学报 28卷难。由于分子标记既可以标记主基因,又可以标记数量性状基因,因此,利用分子标记辅助回交选择,不
受转移性状类型的限制。据估算,在番茄的回交育种过程中,利用RFLP标记仅需三代即可实现某个优
良目标基因导入受体基因组中。此外,在回交育种过程中,目标基因导入的同时,还带有不
利基因片段,
而利用高密度的分子标记,则可以克服此问题。在番茄的回交育种中,利用RFLP标记经过两代选择,
就可以使与目标基因一起导入的片段缩小至2cM的范围内。而常规育种的方法则需100代〔26〕。
2.4 抗病育种
分子标记在抗病育种中有着独特的作用。第一,不需制备病原菌种,克服接菌的不一致性。有些病原
菌在制备种菌体时,方法复杂,而且由于土壤等因素的影响,易造成接菌不均一,从而使抗病育种的选择
进程受阻。而利用分子标记选择时,则不需接病原菌。在番茄的育种研究中发现,酸性磷酸酶基因座
(APS-1)跟M i基因座的抗线虫基因连锁,许多种子公司利用这一分子标记,将抗线虫的基因转育到育
种材料中〔4〕。第二,可以对外来或作为检疫对象的病原菌进行筛选。有的病原菌易于流行,常禁止人工接
种,而许多情况下,育种家希望对抗性进行选择,借助分子标记选择则是一个可行途径。国际玉米和小麦
改良中心正致力于检测玉米霜霉病和穗条纹抗性连锁的分子标记,以借助分子标记选择使育种材料在
不发病的育种疒甫内,对其抗性进行改良〔3〕。第三,克服环境效应。许多抗性基因的表达是受环境因素强
烈影响的。如豌豆耳突花叶病(PEMV)随着温度的升高,病症消失,温度下降则病症重现。因此,利用自
然病疒甫选择常较困难。后来研究发现抗PEMV基因与一个同工酶位点紧密连锁,故借助标记选择比直
接选择更有效〔6〕。第四,抗病性的早期选择。一些植物抗病性的表现是在发育后期进行表达的,而借助
分子标记早期选择则无需保留大量的植株,对栽培周期长、成本高的植物更有益。
2.5 变异后代的鉴定和选择
遗传变异是植物育种的前提,无论是利用常规杂交方法还是利用现代生物技术的方法都是使植物
产生遗传变异。但是,有些遗传变异性是早期无法鉴定和筛选的(如产量、品质、成熟期等),有些变异性
状则需创造逆境才能知晓的(抗病、抗旱等)。常规育种对这些性状选择时,相当数量的优良性状因群体
和环境条件的限制而早代被淘汰掉。如果利用这些性状跟分子标记的紧密连锁,对这些性状选择不仅能
够早期选择,而且不需创造逆境条件。因此,可以节省大量的人力、物力和时间,提高育种的效率。Cho
等〔27〕发现水稻的半矮杆基因Sd-1与同工酶Est-1、RFLP标记(GR220、GR709)紧密连锁,相距仅为
0. 8um,根据分子标记选择的纯合型植株,在F6代仍表现为矮杆,且Sd-1与分子标记之间无重组。
Stromberg等比较了利用分子标记对玉米产量性状早代选择的材料和利用传统的方法对产量性状选择
的玉米材料,结果表明两种方法对产量性状的选择没有差别〔28〕
。很显然,利用分子标记对产量选择则大
大提高选择的效率。
2.6 品种和品系遗传纯度的测定
培育出的新品种或品系,都有可能由于管理或内外环境因素的影响而出现纯度下降,从而影响品种
的产量和品质。因而,需对品种的遗传纯度进行检测。在育种上,也需了解品系的遗传纯度,而遗传纯度
的测定离不开遗传标记,遗传标记的选用又必须对基因组有代表性。分子标记能够对基因组多个至几十
个基因位点同时标记,且受环境影响较小,对基因组的标记明显高于其它形态性状的标记。因此,利用分
子标记可以快速对品种或品系进行遗传纯度的检测,去杂留纯加强管理,确保新品系和品种的产量和品
质优势。
2.7 品种的鉴别和良种登记
植物的分子标记具有品种的特异性,象小麦、水稻等自花授粉作物以及马铃薯、甘薯等无性繁殖作
物,同一品种不同植株具有相同的遗传背景,因而,任何一植株的分子标记都能代表其所属品种的特性。
Dallas等利用人源33. 6的小卫星DNA为探针,获得6个籼稻品种的DNA指纹,发现同一品种不同植
株的DNA指纹相同,不同品种相同DNA指纹的可能性仅为1. 3×10-17〔9〕。L.F.Quiros利用RAPD标
记成功区别了12个Brocoli和14个向日葵品种〔29〕。以M13作探针,利用DNA指纹技术也区别了不同品
·89·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用种的苹果和草霉〔30〕。利用RAPD标记也可以区别水稻、苹果等多种植物的不同品种〔5, 13, 15〕。因此,分子标
记可以作为识别品种的标记,解决与品种专利有关的问题。
2.8 杂种优势的利用
分子标记可以分析不同品种(系)之间的杂合性,可以根据分子标记位点的杂合性预测各组合之间
的杂种优势。Stuber〔31〕等利用分子标记鉴别了与玉米杂种优势有关的遗传因子,发现与产量性状有关的
基因座,杂合体比纯合体有更高产量优势。Figdore应用RFLP标记分析杂交玉米不同自交系之间的杂
合性,发现染色体上的RFLP位点的杂合性和杂种优势有明显相关性,检测34个RFLP位点后发现,
以产量计算杂种优势与RFLP位点杂合程度的百分比有高度的相关性〔32〕。此外,目前杂优组合的改良
主要是将大量待测品系与亲本杂交,希望能够碰上能够产生较大优势的组合,而分子标记则为利用杂
种优势提供了另一种筛选途径。第一,利用分子标记从潜在的种质中系统鉴别与现有杂交组合的亲本
之一表现为显性互补的其它染色体区域。第二,将这些染色体区域渐渗导入相应的亲本品系。
2.9 基因的分离
长期以来,分子生物学家对基因的认识和克隆的重要依据是基因产物分析,而对基因产物未知的基
因则难以分离。
数量性状基因困难以确定它在染色体上的位置以及与其它基因之间的关系也难以进行
克隆分析。利用分子标记在连锁图上精确定位为产物未知的基因和数量性状基因的克隆开辟了新的途
径,这种以图谱为基础的基因克隆,又称图谱克隆(M ap-based cloning),它从连锁标记出发通过大片段
克隆(酵母人工染色体、细菌人工染色体等)的染色体步移达到靶基因。但是,植物基因组中大量存在的
DNA重复序列是染色体步进难以愈越的障碍。目前利用高密度分子标记,可以获得与靶基因共分离的
分子标记,两者之间的距离在几百kb范围内,最后利用该标记筛选大片段克隆库,可望直接发现含靶基
因的克隆片段,这种战术称为染色体登陆(Chromosome landing)。利用染色体登陆技术已成功分离出番
茄抗细菌病基因PTO〔33〕,拟南芥的抗细菌病基因RPSZ〔34〕等一批植物的过敏性抗病基因。
分子标记为植物遗传育种开辟了新途径,在实际工作中能否应用这些技术,依赖于分子标记与目标
基因的连锁程度,直接选择和分子标记选择的相对花费。分子标记的普遍利用因目前所需成本较高,操
作复杂,因而利用受到很大限制,随着分子生物学的发展,建立有效简单的实验方法是有希望的,而且随
着实验步骤的自动化,分子标记的成本也将会降低。分子标记在植物遗传育种中将发挥越来越重要的作
用。
参 考 文 献
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29 QuirosC F et al. Theor appl genet. 1991, 82: 620～632
30 Nybom H J. Hered. 1990, 113: 17～28
31 StuberCW. Crop sci. 1987, 27: 639～648
32 Figdore S S in 2nd int conf on QuantitantiveGeneticAbstr. 1987, 36
33 BentA F et al. Science. 1994, 265: 1856～1860
34 M artinG B et al. Science. 1993, 262: 1432～1436
作者简介 沈法富,男, 1965年生。讲师,硕士, 1991年毕业于山东农业大学作物遗传
育种专业。现从事利用生物技术创新棉花抗逆种质和棉花抗逆遗传标记辅助育种的研究
工作。利用生物技术创新了6个抗盐、抗病棉花种质,发表研究论文8篇。获校级科技成
果一等奖一项。
·91·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用
第28卷第1期 山东农业大学学报 1997年3月
Vo.l 28№1 Journal of Shandong AgriculturalUniversity M ar. 1997
文·献·综·述
分子标记在植物遗传育种中的应用
沈法富 刘风珍 于元杰
(山东农业大学作物遗传育种研究所)
APPLICATION OFMOLECULAR MARKERS IN PLANT
GENETICS AND BREEDING
Shen Fafu, Liu Fengzhen, Yu Yuanjie
(Institue ofCrop Genetics and Breeding,Shandong Agri.Univ.,Taian,China,271018)
Key words molecularmark; isozyme;RFLP;RAPD;DNA fingerpriting; plantbreeding
【摘 要】 本文介绍了同工酶、RFLP、DNA指纹和PARD 4种分子标记的发展、原理和特
点,对它们在植物遗传图谱构建、基因定位、变异后代的鉴定和选择、杂交育种、回交育种、杂
种优势等研究领域中的应用作一展望和概述。
关键词:分子标记;同工酶;DNA指纹;RFLP;RAPD;植物育种
中图法分类号:Q943
传统的植物育种是在不甚明了基因背景的条件下,通过杂交和各种育种技术,根据分离群体的形态
表现和育种者的经验等对表现型累代选择,从而实现对基因型的改良。由于环境效应较易掩盖基因效
应,因而育种者对目标性状的选择是耗时和费力的。在遵循和应用常规育种原则和程序下,提高植物遗
传育种的效率和精确度是遗传育种发展的关键。分子标记的发展为解决这一问题开创了新的途径。分子
标记是从生物的某些大分子物质(蛋白质和核酸)的多态性为基础的遗传标记,它们能够稳定遗传,且遗
传方式简单,可以反映生物的个体和群体特征。目前应用广泛的分子标记有同工酶( Isozyme)、限制性
酶切片段的多态性(Restriction fragment length polymorphism)、DNA指纹(DNA fingerprinting)和随机
扩增片段的多态性(Random amplified polymorphic DNA)。本文拟对它们的发现、发展、原理、特点以及
在植物遗传育种中的应用作一简要概述。
1 分子标记的发现、原理和特点
遗传学的研究离不开遗传标记,孟德尔首次利用形态标记推导出遗传因子的分离和自由重组规律。
摩尔根利用果蝇的形态标记阐述了基因的连锁和互换规律,从而为遗传学的发展奠定基础。但是,由于
生物形态标记数量少,且大多数突变性状为不利性状,从而限制了形态标记的应用〔3〕。随着生物技术的
发展相继出现了多种分子标记。
1.1 同工酶
1952年Neilands首次结晶出两种类型的乳酸脱氢酶,并证实它们为同工酶,即它们是来源相同、催
收稿日期: 1995—12—26化反应的性质相同而分子结构有差异的酶蛋白分子,它是基因的产物,因而可作为遗传标记。同工酶作
为遗传标记具有以下特点〔4〕,首先,它比较稳定,不受环境因素的影响。其次,它在种子
和幼苗期就可以
鉴定,且所需植物材料少,除进行酶分析外,还可以对其它性状进行观察,直至收获种子。再次,同工酶为
共显性,即来自双亲的一对等位基因可以在杂交后代中同时检测出来。而不象显—隐性状那样,杂交后
代隐性性状被显性性状所掩盖。目前已对30多种植物进行了40多种同工酶分析,许多重要农作物都已
有了比较完整的同工酶图谱。但是,在植物的群体中,仅有10～20种同工酶表现出位点的多态性〔3, 4〕。因
而限制了同工酶的利用。
1.2 RFLP标记
70年代中期,遗传学家发现了DNA水平上的分子标记——RFLP,它是由限制性内切酶酶解样品
DNA,从而产生大量的限制性内切酶片段,通过凝胶电泳将DNA片段按照各自的长度分开。当酶解
DNA产生的酶切片段数量比较多时,电泳虽按片段的长度分开,但实际形成连续一片。因此,需将电泳
的DNA通过Southern转移至支持膜上,利用某一片段DNA作为探针,使酶切片段跟探针杂交,从而显
示出RFLP。当利用同一种限制内切酶,酶解不同品种的DNA时,由于不同品种的DNA既有同源性又
有变异,因而酶切片段就有差异,这种差别就是RFLP(图1)。它是DNA分子水平上变异的反映,它既可
以是内切酶识别序列的改变,也可能涉及部分片段的缺失、插入、易位、倒位等〔5〕。RFLP作为分子标记
具有独特的优点〔6, 7〕。第一,RFLP标记等位基因之间是共显性的(图1),因而不受杂交方式的限制,对隐
性基因更有利。第二,RFLP标记是反映基因型之间的差异,无表型效应,不受环境条件和发育阶段的
影响。第三,RFLP标记的非等位基因之间不存在上位效应以及其它形式的基因互作。因此,RFLP标记
之间无干扰。RFLP标记也有其不足之处,大多数RFLP多态位点信息含量低,其多态性也过分依赖限
制性内切酶的选用。
图1 RFLP直观图及其共显性示意图
Fig.1 Schematic diagram ofRLFP and its codom inace
图上线段为含有RFLP的DNA区段,在基因型为AA的个体中,这段DNA含有3个某种限制性内切酶切点(如
箭头所示)。由于酶切位点核苷酸的变化(如点突变等),中间酶切位点在等位基因型为aa的个体DNA片段上不存在,
当AA和aa两种基因型的DNA片段被这种限制性内切酶消化并与探针杂交时,则分别显示出两种不同长度(10kb
和15kb)限制性酶切片段。而在杂合体Aa个体DNA片段中,既存在3个酶切位点片段,又存在2个酶切位点片段。
因此,在RFLP杂交图中同时存在10kb和15kb片段,即共显性。
·84·山东农业大学学报 28卷1.3 DNA指纹
1980～1984年,人类遗传学家相继发现了人类基因组中存在着高度变异的重复序列,后称为小卫
星DNA(M inisatellite),它是以11-60bp为重复单位,总
长度由几百个到几千个碱基组成的串联重复
序列,因重复的数目不同,而表现总长度的差异,它分布整个基因组中,但主要存在近端粒处。以小卫星
DNA为探针,与众多限制性内切酶酶解核DNA产生的片段杂交,得到了具有个体特异性的杂交图谱,
这个图谱就是DNA指纹,由于DNA指纹具有个体特异性,其遗传方式简单,因此,它是一种遗传标记。
Jeffreys推测人源小卫星DNA是生物进化过程中保留下来的变异较大的DNA序列〔8〕。因此,可以
用它来检测植物的小卫星DNA。事实证明,利用人源的小卫星DNA作探针,成功地区分了黑麦、水稻〔9〕
等多种植物的不同种,DNA指纹表现了品种的特异性。1987年,A li等〔10〕利用人工合成的寡聚核苷酸(2
-4bp为一个单位的多聚体)为探针,检测到了人的DNA指纹,这些寡核苷酸所检测的位点被称为微
卫星DNA(M icrosatellite)。利用寡核苷酸作为探针,也获得了多种生物的DNA指纹〔11〕。DNA指纹作为
一种分子标记具有以下特点〔12〕。第一,多位点性。对许多物种研究表明,其DNA指纹绝大多数是独立遗
传的,因此,一个DNA指纹图实际能够同时检测到基因组中数十个位点的变异。第二,高度变异性。
DNA指纹表现了个体和群体的高度特异性,同一物种两个随机个体的DNA指纹相似系数仅为0. 22,
二者指纹完全相同的概率为三千亿分之一。第三,遗传方式简单稳定。DNA指纹遵循简单的孟德尔遗
传,后代中的每一条带,都可以在双亲之一的指纹中找到,除非基因突变产生的新带。
1.4 RAPD标记
1990年W illiam s等〔13〕和W elsh等〔14〕两个研究小组同时发现一种新的分子标记——RAPD标记。
它是以DNA聚合酶链反应技术为基础,利用人工合成的短核苷酸作为引物,以从组织中分离得到的
DNA作为模板,通过基因扩增仪合成多态性DNA片段。其基本原理如图2所示。由于不同品种DNA序
列存在着差异,其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异,这样经PCR扩增后就产生了
DNA片段的多态性,这就形成了RAPD标记。RAPD标记具有以下特点〔13, 15〕。
第一,RAPD标记数量多,因为RAPD分析所用引物的数量是无限的,因此它可以覆盖基因组中所
有位点。第二,RAPD标记所需模板DNA量小,因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。第三,
RAPD所用引物没有物种限制,一套引物可以用于不同生物基因组分析。第四,RAPD分析方便、快速,
无需克隆制备、同位素标记、Southern转移等复杂的操作。第五, RAPD标记是显性的(图3),因此,
RAPD标记不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。同时,RAPD分析也保留了PCR反应的缺点,易产
生非特异性带。为了克服RAPD分析的不足,在此基础上又发展了许多新技术。DAF(DNA Amplifi
ed
Fingerprinting)是以大于或等于5个碱基的随机核苷酸作为引物,扩增不同个体的DNA分子,通过聚
丙烯酰胺凝胶电泳和银染分析,使之产生更多的多态性带〔16〕。
SCARS(Sequence Characterized Amplified Regions)是对特异的RAPD标记进行克隆测序,并以此
推测出末端14个核苷酸,然后合成一个24bp的寡核苷酸引物,它包括原来RAPD分析所用10bp和
RAPD标记末端的14bp,然后利用此引物进行基因组扩增分子这技术不仅指出了RAPD标记的分子基
础,而且一些由于缺失、插入引起的多态性,难以用RAPD分析,但可以被SCAPS揭示〔17〕。
除了上述所介绍的4种分子标记外,还有AFLP标记和STS标记,它们主要用于特殊位点标记。表
1比较了上述所介绍分子标记的技术特点和标记的遗传特点。图4概述了各种分子标记的生物学基础
以及它们和其它标记的关系。
·85·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用图2 PARD循环示意图
Fig.2 D iagram ofRAPD cycle
当某一双链DNA分子在200～2000个碱基范围内有一小段( 10个碱基)反向对称DNA序列时(IR),通过单一
引物(P)就可合成一段与该序列以内的DNA互补的新链,而这段新链又可作模板合成另一段新链。
IR
IR
IR
IR
IR
IR
IR
IR
IR
BB
bb
Bb
凝胶电泳图
1kb
BB bb Bb
图3 RAPD标记及显性示意图
Fig.3 D iagram ofRAPD marker and its dom inance
图上某一物种DNA片段,在等位基因B中含有一段反向重复序列(IR),假定某一引物与其配对可扩增出1kb的
DNA片段。等位基因b由于IR序列的核苷酸的变化,引物不能与DNA结合,不能扩增出DNA片段。当杂合体Bb
中,由于含有可扩增出1kb片段的序列,电泳结果可以显示出1kb片段,故RAPD标记为显性标记。
·86·山东农业大学学报 28卷图4 各种遗传标记的分子基础及关系
Fig.4 Them ilecular basis and relationship of each geneticmarker
2 分子标记在植物遗传育种研究中的应用
2.1 遗传图谱的构建和基因定位
表1 4种分子标记的比较
Table 1 The comparision of 4molecularmarkers
比较内容
Comparision contents
同工酶
IsozymeRFLP RAPDDNA指纹图DNA fingerprinting
创立者及年代
Founder and generation
Neilands JB
1952
G rodzicker J et al.
1974
W illiams JG et al.
W elsh J et al.
1990
JeffreysAJ et al.
1985
核心技术
Nuclear technique
电泳技术
生化技术
电泳技术
分子杂交
电泳技术
PCR
电泳技术
分子杂交
多态性类型
Polymorphic type
蛋白质合成
加工、产生的
亚基变异
单碱基突变
插入、缺失
易位、倒位
单碱基突变
插入、缺失
易位、倒位
重复序列的
长度与次数
的差异
多态性水平
Polymorphic number低中中高
技术难度
The difficulty
of technique
低中
中中
可靠性
Reliability高高中高
遗传特性
Genetic character
简单孟德尔
遗传
简单孟德尔
遗传
简单孟德尔
遗传
简单孟德尔
遗传
探针或
引物类型
Type of probe of primer
单一序列
探针
10个bp
随机引物重复序列探针
遗传图谱的构建是对基因组系统研究的基础,是植物遗传育种的依据,由于分子标记是反映基因位
·87·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用点的多态性,因此可以用来构建遗传图谱。利用分子标记构建遗传图谱,不象利用形态标记那样选择专
门的亲本,设计杂交方式,并建立专门的群体。利用分子标记构建遗传图谱可以使用不同的分离群体,它
既可以是暂时性分离群体(F2代和回交一代),也可以是永久性分离群体(F1代花药培养获得的双单倍体
及F2代一粒传获得的重组自交系)。利用分子标记构建遗传图谱的原理跟形态标记一样,二点、三点测
交依然是基本程序,不同的是一个分子标记分离的群体中,可以同时获得几十个乃至几百个标记的数
据,这些数据的处理需要专门的计算机程序来完成。由于利用分子标记构建遗传图谱具有方便、快速、密
度大等特点,因而,许多重要农作物、果树、蔬菜、林木的同工酶〔3, 4〕、RFLP〔5, 18〕、RAPD〔5, 13, 14, 15〕遗传图谱
相继建立。
分子标记还可以对某一特定DNA区域内的目标基因进行定位。根据样品的来源,有两种基因定位
的方法。第一,利用近等基因系进行基因定位。近等基因系是由提供目标基因的供体亲本跟轮回亲本杂
交,并经多次回交,多代对目标性状基因的选择而获得,该系除了目标基因外其余基因大部分同轮回亲
本相同,这样就可以对轮回亲本和近等基因系的同工酶或者DNA进行多态性分析,找出两基因组产物
的差异,并以此为标记,利用遗传图谱,就可以对目标性状基因定位〔19〕。第二,利用对目标性状基因有分
离的F2代群体进行基因定位。原理是依据目标性状将F2代群体分为两组,一组是含有目标性状基因的
纯合体(可由F3代分离情况确定F2代单株是纯合体还是杂合体)。另一组是不含目标性状的纯合体。每
组中随机取10～20株,分别提取其DNA并等量混合,这样就构建了两个DNA库(DNA Pool)。在这两
个DNA库中,目标基因所在的DNA区域完全不同,而其余区域的DNA则近似相同。通过分子标记分
析,可以找出同目标区域相连锁的多态性标记,进而进行基因定位〔20〕。利用分子标记,迄今在玉米、水
稻、番茄、大豆、小麦和棉花等各种农作物上已定位了许多重要农艺性状基因,其中包括作物的抗病性、
抗虫性、耐逆性、光周期的敏感性、雄性不育、育性恢复和矮杆等各种
基因〔4, 9, 18, 19, 20, 21, 22〕。
分子标记不仅能对控制质量性状的基因进行定位,而且还可以对数量性状基因定位。过去,数量性
状的遗传分析一直停留在统计水平上,尽管统计方法日趋精细,但数量性状基因依然是一个形式上的单
位。而分子标记则可以将这些数量定位到某个染色体区段上。具体做法是,选择在某个数量性状有较大
差异的两个亲本类型进行杂交,获得一个F2分离群体,对群体内每个植株进行数量性状测定,同时分析
每个染色体片段上的分子标记,通过比较可以发现某个染色体片段的存在与植株的数量性状密切相关,
这样将微效多基因确定到染色体片段上,每个片段都有自己的分子标记为代表,在育种过程中,可利用
分子标记作为微效基因的选择标记。利用分子标记现已成功定位了水稻的粒形、生育期、产量构成因素
等数量性状基因〔1, 2〕、控制番茄果实重、种子重、果实固形物含量、pH值等数量性状基因也进行了定
位〔23〕。分子标记的发展使木本植物遗传学走出低谷,如控制苹果果实大小、色泽、柱形生长、白粉病抗性
等数量性状基因进行了鉴定并定位〔22〕。随着分子标记研究的深入,分子标记将为研究数量性状之间的
基因互作等基础研究提供依据。
2.2 杂交育种
杂交育种是目前植物育种的重要技术,而杂交亲本的选配是杂交育种的关键步骤。亲本选配必须考
虑的一个重要因素是测定亲本的遗传距离,确定其亲缘关系。由于植物受内外环境因素、数量性状遗传
及显性、上等性等因素的制约,传统方法是利用形态特性分析确定其亲缘关系,这难免出现效率偏低。分
子标记由于受环境因素影响小,且数量大,因而可以快速鉴别亲本之间的亲缘关系。利用同工酶已确定
了水稻、小麦、棉花、番茄等多种作物的亲缘关系〔4, 18〕。利用RAPD标记对29个野生花生品种亲缘关系
的研究跟经典方法研究结果一致〔24〕。RFLP和DNA指纹技术也成功地应用于多种植物的亲缘关系研
究中〔25, 9〕。
2.3 回交育种
回交育种的目的是引入供体目标基因后,通过反复回交恢复受体亲本优良的基因型。通常需要多次
回交才能选择到理想的个体,对于目标性状为隐性基因和数量性状基因所控制的,在选择时则比较困
·88·山东农业大学学报 28卷难。由于分子标记既可以标记主基因,又可以标记数量性状基因,因此,利用分子标记辅助回交选择,不
受转移性状类型的限制。据估算,在番茄的回交育种过程中,利用RFLP标记仅需三代即可实现某个优
良目标基因导入受体基因组中。此外,在回交育种过程中,目标基因导入的同时,还带有不
利基因片段,
而利用高密度的分子标记,则可以克服此问题。在番茄的回交育种中,利用RFLP标记经过两代选择,
就可以使与目标基因一起导入的片段缩小至2cM的范围内。而常规育种的方法则需100代〔26〕。
2.4 抗病育种
分子标记在抗病育种中有着独特的作用。第一,不需制备病原菌种,克服接菌的不一致性。有些病原
菌在制备种菌体时,方法复杂,而且由于土壤等因素的影响,易造成接菌不均一,从而使抗病育种的选择
进程受阻。而利用分子标记选择时,则不需接病原菌。在番茄的育种研究中发现,酸性磷酸酶基因座
(APS-1)跟M i基因座的抗线虫基因连锁,许多种子公司利用这一分子标记,将抗线虫的基因转育到育
种材料中〔4〕。第二,可以对外来或作为检疫对象的病原菌进行筛选。有的病原菌易于流行,常禁止人工接
种,而许多情况下,育种家希望对抗性进行选择,借助分子标记选择则是一个可行途径。国际玉米和小麦
改良中心正致力于检测玉米霜霉病和穗条纹抗性连锁的分子标记,以借助分子标记选择使育种材料在
不发病的育种疒甫内,对其抗性进行改良〔3〕。第三,克服环境效应。许多抗性基因的表达是受环境因素强
烈影响的。如豌豆耳突花叶病(PEMV)随着温度的升高,病症消失,温度下降则病症重现。因此,利用自
然病疒甫选择常较困难。后来研究发现抗PEMV基因与一个同工酶位点紧密连锁,故借助标记选择比直
接选择更有效〔6〕。第四,抗病性的早期选择。一些植物抗病性的表现是在发育后期进行表达的,而借助
分子标记早期选择则无需保留大量的植株,对栽培周期长、成本高的植物更有益。
2.5 变异后代的鉴定和选择
遗传变异是植物育种的前提,无论是利用常规杂交方法还是利用现代生物技术的方法都是使植物
产生遗传变异。但是,有些遗传变异性是早期无法鉴定和筛选的(如产量、品质、成熟期等),有些变异性
状则需创造逆境才能知晓的(抗病、抗旱等)。常规育种对这些性状选择时,相当数量的优良性状因群体
和环境条件的限制而早代被淘汰掉。如果利用这些性状跟分子标记的紧密连锁,对这些性状选择不仅能
够早期选择,而且不需创造逆境条件。因此,可以节省大量的人力、物力和时间,提高育种的效率。Cho
等〔27〕发现水稻的半矮杆基因Sd-1与同工酶Est-1、RFLP标记(GR220、GR709)紧密连锁,相距仅为
0. 8um,根据分子标记选择的纯合型植株,在F6代仍表现为矮杆,且Sd-1与分子标记之间无重组。
Stromberg等比较了利用分子标记对玉米产量性状早代选择的材料和利用传统的方法对产量性状选择
的玉米材料,结果表明两种方法对产量性状的选择没有差别〔28〕
。很显然,利用分子标记对产量选择则大
大提高选择的效率。
2.6 品种和品系遗传纯度的测定
培育出的新品种或品系,都有可能由于管理或内外环境因素的影响而出现纯度下降,从而影响品种
的产量和品质。因而,需对品种的遗传纯度进行检测。在育种上,也需了解品系的遗传纯度,而遗传纯度
的测定离不开遗传标记,遗传标记的选用又必须对基因组有代表性。分子标记能够对基因组多个至几十
个基因位点同时标记,且受环境影响较小,对基因组的标记明显高于其它形态性状的标记。因此,利用分
子标记可以快速对品种或品系进行遗传纯度的检测,去杂留纯加强管理,确保新品系和品种的产量和品
质优势。
2.7 品种的鉴别和良种登记
植物的分子标记具有品种的特异性,象小麦、水稻等自花授粉作物以及马铃薯、甘薯等无性繁殖作
物,同一品种不同植株具有相同的遗传背景,因而,任何一植株的分子标记都能代表其所属品种的特性。
Dallas等利用人源33. 6的小卫星DNA为探针,获得6个籼稻品种的DNA指纹,发现同一品种不同植
株的DNA指纹相同,不同品种相同DNA指纹的可能性仅为1. 3×10-17〔9〕。L.F.Quiros利用RAPD标
记成功区别了12个Brocoli和14个向日葵品种〔29〕。以M13作探针,利用DNA指纹技术也区别了不同品
·89·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用种的苹果和草霉〔30〕。利用RAPD标记也可以区别水稻、苹果等多种植物的不同品种〔5, 13, 15〕。因此,分子标
记可以作为识别品种的标记,解决与品种专利有关的问题。
2.8 杂种优势的利用
分子标记可以分析不同品种(系)之间的杂合性,可以根据分子标记位点的杂合性预测各组合之间
的杂种优势。Stuber〔31〕等利用分子标记鉴别了与玉米杂种优势有关的遗传因子,发现与产量性状有关的
基因座,杂合体比纯合体有更高产量优势。Figdore应用RFLP标记分析杂交玉米不同自交系之间的杂
合性,发现染色体上的RFLP位点的杂合性和杂种优势有明显相关性,检测34个RFLP位点后发现,
以产量计算杂种优势与RFLP位点杂合程度的百分比有高度的相关性〔32〕。此外,目前杂优组合的改良
主要是将大量待测品系与亲本杂交,希望能够碰上能够产生较大优势的组合,而分子标记则为利用杂
种优势提供了另一种筛选途径。第一,利用分子标记从潜在的种质中系统鉴别与现有杂交组合的亲本
之一表现为显性互补的其它染色体区域。第二,将这些染色体区域渐渗导入相应的亲本品系。
2.9 基因的分离
长期以来,分子生物学家对基因的认识和克隆的重要依据是基因产物分析,而对基因产物未知的基
因则难以分离。
数量性状基因困难以确定它在染色体上的位置以及与其它基因之间的关系也难以进行
克隆分析。利用分子标记在连锁图上精确定位为产物未知的基因和数量性状基因的克隆开辟了新的途
径,这种以图谱为基础的基因克隆,又称图谱克隆(M ap-based cloning),它从连锁标记出发通过大片段
克隆(酵母人工染色体、细菌人工染色体等)的染色体步移达到靶基因。但是,植物基因组中大量存在的
DNA重复序列是染色体步进难以愈越的障碍。目前利用高密度分子标记,可以获得与靶基因共分离的
分子标记,两者之间的距离在几百kb范围内,最后利用该标记筛选大片段克隆库,可望直接发现含靶基
因的克隆片段,这种战术称为染色体登陆(Chromosome landing)。利用染色体登陆技术已成功分离出番
茄抗细菌病基因PTO〔33〕,拟南芥的抗细菌病基因RPSZ〔34〕等一批植物的过敏性抗病基因。
分子标记为植物遗传育种开辟了新途径,在实际工作中能否应用这些技术,依赖于分子标记与目标
基因的连锁程度,直接选择和分子标记选择的相对花费。分子标记的普遍利用因目前所需成本较高,操
作复杂,因而利用受到很大限制,随着分子生物学的发展,建立有效简单的实验方法是有希望的,而且随
着实验步骤的自动化,分子标记的成本也将会降低。分子标记在植物遗传育种中将发挥越来越重要的作
用。
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作者简介 沈法富,男, 1965年生。讲师,硕士, 1991年毕业于山东农业大学作物遗传
育种专业。现从事利用生物技术创新棉花抗逆种质和棉花抗逆遗传标记辅助育种的研究
工作。利用生物技术创新了6个抗盐、抗病棉花种质,发表研究论文8篇。获校级科技成
果一等奖一项。
·91·1期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用