第３３卷第１１期分析测试学报Ｖ０１．３３Ｎｏ．１１２０１４年１１月ＦＥＮＸＩＣＥＳＨＩＸＵＥＢＡＯ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓ）１２３ｌ～１２３６
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－４９５７．２０１４．１１．００４
ＨＰＬＣ衍生化法分析决明子多糖水解产物中
单糖组分及其多糖组成特征的研究
万强１，吴学昊１，范华均ｈ，罗安１，陈智１，黄晓文１，张薇２
（Ｉ．广东药学院药科学院，广东广州５１０００６；２．广东药学院基础学院，广东广州５１０００６）
摘要：分别利用分光光度法和Ｉ．苯基，３一甲基一５．吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生化／ＨＰＬｃ法分析了１２批不同批次药材
的决明子多糖及其水解产物中的单糖组分，以水解的单糖组分建立了决明子多糖的ＨＰＬＣ指纹图谱，并研究
了决明子多糖的组成特征。结果表明，经过纯化的决明子多糖含量在９３．４１％一９８．５７％之间，以甘露糖为参
照峰建立了１２批药材的指纹图谱，相似度在０．９６３～０．９９９之间，多糖水解产物中单糖组分的含量在１．６１７～
３０４．５ｍｓ／ｇ之间，７个共有峰组分含量大小分布均依次为：甘露糖＞木糖＞半乳糖＞葡萄糖＞阿拉伯糖＞葡
萄糖醛酸＞氨基半乳糖，显示了决明子多糖的基本组成结构特征，１２批药材的决明子多糖中各单糖的平均
摩尔比为甘露糖：木糖：半乳糖：葡萄糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖＝４３．０：２４．２：１５．４：５．６：
５．５：３．４：２．９。指纹图谱相似度分析和多糖的组成特征分析对市售药材的分析鉴定结果一致，可作为决明
子多糖结构分析及其质量控制的依据。
关键词：决明子；多糖；水解；单糖；指纹图谱；衍生化；高效液相色谱
中图分类号：０６５７．７２；０６２９．１文献标识码：Ａ文章编号：１００４—４９５７（２０１４）１１—１２３１—０６
ＤｅｒｉｖａｔｉｖｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＨｙｄｒｏｌｙｚｅｄ
ＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．ａｎｄＴｈｅｉｒＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓＷＡＮＱｉａｎ９１，ＷＵＸｕｅ．ｈａ０１，ＦＡＮＨｕａ－ｊｕｎｈ，ＬＵＯＡｎｌ，ＣＨＥＮＺｈｉｌ，ＨＵＡＮＧＸｉａｏ．ｗｅｎｌ，ＺＨＡＮＧＷｅｉ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＣｏｕｒｓｅｓ，
ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．ｗａｓｐｅｒ－
ｆｏｒｍｅｄｂｙＵＶｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉ一
如ｆ施Ｌ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ
９３．４１％ａｎｄ９８．５７％ａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｍｏｎｏｓａｃｃｈａ—
ｒｉｄｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨＰＬＣｗｉｔｈ１一ｐｈｅｎｙｌ－３一ｍｅｔｈｙｌ－５－ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ（ＰＭＰ）ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ．
ＢａｓｅｄｏｎＨＰＬＣｄａｔａｏｆ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓ，ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．
ｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｃｏｍｍｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｅａｋｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｍａｎｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ｇａｌａｃ—
ｔｏｓａｍｉｎｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｇａｌａｃｔｏｓｅ，ｘｙｌｏｓｅａｎｄａｒａｂｉｎｏｓｅ，ａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ１．６１７—
３０４．５ｍｇ／ｇ．Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｏｒ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．ｂａｓｉｃａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆｓｅｖｅｎ
ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｎａｍｅｄｍａｎｎｏｓｅ，ｘｙｌｏｓｅ，ｇａ｜ａｃｔｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄａｎｄ
ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｍｏｌａｒｒａｔｉｏｏｆ４３．０：２４．２：１５．４：５．６：５．５：３．４：２．９．Ｆｉｎｇｅｒ—
ｐｒｉｎｔｓａｎｄｍｏｌａｒｒａｔｉｏｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｍａｔｅｒｉａｌｓｓｏｌｄｉｎ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ；ｄｅ・
ｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）
决明子（ＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．）来源于豆科植物决明的干燥成熟种子，始载于《神农本草经》，其味收稿日期：２０１４—０６—０４；修回１３期：２０１４—０８—２０
基金项目：广东药学院师资队伍建设基金项目（５２１０４１０９）｛通讯作者：范华均，博士，教授，研究方向：药物提取分离及药物分析，Ｔｅｌ：０２０—３９３５２１３５，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｕｎｈｕａｆａｎ＠１２６．ｃｏｒｎ
分析测试学报第３３卷
微苦微甘，性微寒，入肝、大肠经，有清热明目、润肠通便的作用¨。ｏ。决明子除含有蒽醌、萘并吡咯酮等有效化学成分外口。４］，还含有结构复杂的多糖化合物。目前人们逐渐发现多糖具有多方面的生物活性和功能，如抗氧化、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗病毒等，有关多糖化合物的药物活性及其作用机理研究成为一大热点ｂ。７］。多糖作为决明子的有效活性成分，其提取、分离及药理和药效等作用的研究也逐渐引起人们的重视。８。１２Ｉ。
多糖化合物由于种类多、性质相似，常采用硫酸一苯酚、硫酸一蒽酮、硫酸一咔唑等显色体系经反应显色后，采用分光光度法测定其总量。该物质由于无挥发性和缺少紫外特征吸收基团，难以用气相色谱法（ＧＣ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）进行定量分析，因而常采用凝胶色谱法和离子色谱法通过示差折光检测器（或蒸发光检测器）和电化学检测器检测，根据其排阻体积可测定多糖的分子量，但由于灵敏度低、标准品难以获得而无法测定其含量¨３－１４］；利用衍生化法可以进行ＨＰＬＣ［１５－１７１和Ｇｃ［１７一引分析，但大多局限于水解的单糖和部分寡糖组分的测定，因此直接了解多糖的定性、定量信息尚存在较大困难。多糖的色谱分析大多通过分离、纯化和水解来实现，该方法是控制多糖质量和提供多糖基本结构信息的重要方法¨７－１９］。本文基于决明子多糖在三氟乙酸介质中可完全降解为单糖，利用１－苯基－３一甲基一５．吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生化／ＨＰＬＣ法测定决明子多糖水解产物中单糖的含量Ｈ９。，采用１２批药材建立了决明子多糖的ＨＰＬＣ指纹图谱；在此基础上通过各单糖组分的定性和定量分析，研究了１２批药材决明子多糖的组成和摩尔比，以了解该多糖的基本组成和特征，为控制药材的质量，进一步研究决明子多糖的结构、药理和药效提供依据，相关研究尚无文献报道。
１实验方法
１．１仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ＳＨＩＭＡＤＺＵ２５５０ＵＶ—Ｖｉｓ分光光度计（日本岛津公司）；ＴＤ一６高速离心机（长沙平凡仪器公司）；ＴＨＺ一８２恒温振荡器（金坛富华仪器厂）；ＲＥ５２ＣＳ一１旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ＨＨ一６恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；ＪＢ—ｌ磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器厂）。
决明子药材（编号Ｓ１～Ｓ１２，产地分别为广东、广西、湖北、安徽、上海等地，由中药鉴定学教研室刘基柱副教授鉴定）；木瓜蛋白酶（７０万Ｕ，广州暨生元生物科技有限公司）；葡萄糖、核糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖（美国Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖（上海晶纯实业有限公司）；氨基半乳糖（上海Ａｄａｍａｓ—ｂｅｔａ公司）；三氟乙酸（ＴＦＡ，上海晶纯实业有限公司）；１－苯基．３一甲基－５一吡唑啉酮（ＰＭＰ，上海Ａｄａｍａｓ—ｂｅｔａ公司）；乙腈（色谱纯，德国Ｍｅｒｃｋ公司）；磷酸二氢钠（ＮａＨ：ＰＯ。・２Ｈ：Ｏ）、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ。・１２Ｈ２０）、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、苯酚、双氧水；其他试剂除特殊注明外，均为分析纯，购自广州化学试剂厂；实验用水为去离子水或超纯水。１．２实验方法
１．２．１决明子多糖的提取与纯化唧１将决明子药材烘干，粉碎，过８０目筛，称取一定量药材粉末以石油醚（ＩＩ）脱脂６ｈ，加水后于８０℃下浸提４ｈ，离心。取其上清液，按药材干重的１／５０量加入木瓜蛋白酶，在６０℃下酶解２ｈ，离心，取上清液，加入Ｓｅｖａｇｅ溶液（三氯甲烷一正丁醇，４：１）萃取多次除去蛋白，直至两相间无乳白色絮状物。取上清液加入１５％Ｈ：Ｏ：溶液脱色处理６ｈ，浓缩，再用９５％乙醇醇沉后置于４℃冰箱过夜，离心，残渣分别用２０ｍＬ丙酮和２０ｍＬ无水乙醚重复洗涤２次，氮气吹干，即得纯化的决明子多糖。
１．２．２多糖的光度测定取一定量的葡萄糖标准溶液于比色管中，加水至１．０ｍＬ，再加入１．０ｍＬ５％苯酚溶液，摇匀，缓慢加入５．０ｍＬ浓硫酸，混匀，静置３０ｍｉｎ，以水作为空白，在４８７ｎｍ处测量吸光度，多糖样品溶液（准确称取２５ｍｇ决明子多糖，用水溶解、定容）按上述光度法测定。
１．２．３多糖的水解准确称取１０ｍｇ决明子多糖样品，置于安瓿瓶中，加入２ｍＬ２ｍｏｌ／Ｌ的ＴＦＡ溶液，封口，于１１０℃下水解５ｈ，离心，取上清液，减压蒸干，加甲醇重复洗涤３次，旋干，得到水解产物，备用。
１．２．４ＰＭＰ衍生化取上述水解产物．加水溶解，定容至１０ｍＬ，准确移取０．２ｍＬ于具塞玻璃离心
第ｌＩ期万强等：ＨＰＬＣ衍生化法分析决明子多糖水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究１２３３
管中，分别加入０．２ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＰ甲醇溶液和０．２ｍＬ０．３ｍｏＶＬ的ＮａＯＨ溶液，于７０℃水浴加热６０ｍｉｎ，冷却后加入０．２ｍＬ０．３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液中和，再加入１ｍＬ氯仿萃取，离心，取上清液重复操作３次，用水稀释，定容至５ｍＬ，备用，其ＰＭＰ衍生化过程如图１所示［２１］。
０
。ｑ■毽－
图１单糖的ＰＭＰ衍生化过程
Ｆｉｇ．１０ｙ…ＮａＵＨ＠Ｉ肿Ｈ０ＤｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂｙＰＭＰｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
ＨＰＬＣ分析将上述ＰＭＰ衍生化后的样品处理液，通过０．２２斗ｍ微孔滤膜，按下述ＨＰＬＣ条
件分析：分离柱为ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉＣ】８（２５０ｍｍ×４．６０ｍｍ，５斗ｍ），流动相为乙腈一０．０５ｍｏｌ／ｍＬ磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）（１８：８２），流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３０℃，紫外检测波长２４５ｎｍ，进样量２０灿。１．２．５２结果与讨论
２．１决明子多糖含量的测定
利用硫酸一苯酚法，将决明子多糖按实验方法显色后测定其吸光度，并配制一系列葡萄糖标准溶液，经光度测量后以其吸光度和浓度绘制标准曲线，据此分别测定了１２批决明子药材中多糖的含量，结果见表１。由表１可知，１２批次药材按实验方法制备的决明子多糖，其含量在９３．４１％～９８．５７％之间，ＲＳＤ为０．２％～１．９％，表明能够较大程度地除去杂质。鉴于多糖的含量均在９３％以上，可以用于多糖组成及其水解产物单糖的分析。
Ｔａｂｌｅｌ
Ｓａｍｐｌｅ
Ｓ１
Ｓ２
Ｓ３
Ｓ４
Ｓ５
Ｓ６表１决明子粗多糖含量的测定结果（ｎ＝３）ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．（ｒｔ＝３）Ｃｏｎｔｅｎｔ（％）９４．０６９６．９２９８．３７９６．８５９５．２３９３．７１Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（ｍｇ）２３．５０２４．２３２４．６７２４．５６２３．９７２３．６９ＲＳＤ（％）０．９１．９０．２０．８１．１０．７ＳａｍｐｌｅＳ７Ｓ８Ｓ９ＳＩＯＳ１１Ｓ１２Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（ｍｇ）２４．１３２４．３６２４．７７２４．１５２３．９４２３．３８Ｃｏｎｔｅｎｔ（％）９６．４０９７．１３９８．５７９５．８０９５．０４９３．４１ＲＳＤ（％）０．５１．３１．８Ｏ．３０．７１．５
２．２决明子多糖的水解条件
取制备的决明子多糖，加入ＴＦＡ溶液将其完全水解为单糖，以进一步了解多糖的基本结构组成。按实验方法，采用ＰＭＰ衍生化／ＨＰＬｃ法测定，分别以水解的甘露糖和各单糖的峰面积和为指标，试验了不同ＴＦＡ浓度、温度和水解时间对多糖水解程度的影响，结果见图２。
ｌ２３４５
ｔ／ｈ６７８
Ｆｉｇ．２图２三氟乙酸浓度（Ａ）、温度（Ｂ）和水解时间（Ｃ）对多糖水解的影响ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＴＦＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ａ），ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）ａｎｄｔｉｍｅ（Ｃ）ｏｎｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
一●一ｍａｎｎｏｓｅ：——卜ｔｏｔａｌｍｏｎｏｓａｃｃｈａｆｉｄｅｓ由图２可知，随着ｒＩ’ＦＡ浓度的增加、温度的升高以及水解时间的延长，多糖逐渐开始水解，单糖的
分析测试学报第３３卷
量逐渐增加。当ＴＦＡ浓度大于２ｍｏｌ／Ｌ、水解温度为１１０ｏＣ，水解时间维持５ｈ时，多糖达到完全水解，因此决明子多糖完全水解为单糖的条件为：ＴＦＡ的浓度为２ｍｏｌ／Ｌ、水解温度１１０℃、水解时间５ｈ。２．３特征指纹图谱的建立与分析
取１２批次的药材分别按照实验方法提取多
糖，并在上述最佳的水解条件下完全水解多糖，
经ＰＭＰ衍生化后进行ＨＰＬＣ分析，记录多糖完全
水解产物６０ｍｉｎ的色谱图。结果表明：１２批次４
样品中有７个单糖组分共有特征峰，非共有峰小
于总峰面积的２％，以其中含量最高的色谱峰１二＝二二二仁二—————ＪｕＬ———，～—ｊ。ｕ酞—Ｌ———————一《弓——————＾——』。———ｊＬ——／也月乙＾———————一叠Ｒ
．＾＾——』。———。＾———毋√亭√Ｌ—————————一ｉ‘
为参照峰分别计算各个组分的相对峰面积，采用Ｌ—————ＪＬ——＾————／Ｌ———矗■舢√＼————．．—～ｉｊ＾Ａ码“《￥
————～ＪＬ——ｋ————、——√ｎ零／Ｌ————ｋ～ｉｊ＾—＿，———＾—』取＾．ｔ岁
国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系０．００８．７０１７．３９２６．０９３４．７８４３．４８５２．１７６０．８７统（２００４Ａ版），设定ｓ１为参照图谱，以１２批次ｔ／ｒａｉｎ
决明子样品的色谱图生成相应的共有模式作为标图３决明子多糖完全水解产物中单糖的ＨＰＬＣ指纹图谱一——————＾１Ａ＾—、＾—．—ｘ——／。———Ｊ、—＾，讳野僵＾ＬｉＬ—＾．—＿—，＾．。●Ｕ——一Ｒ——————ＪＬ——＾————ＪＬ——』０“Ｊ。———．．。—一ｑ¨＾——。、————Ｊ。——√各以凡』、———————一Ｓ１ｑＸ０＋准指纹图谱，并以此计算各批次样品的相似度，Ｆｉｇ．３ＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｅｈａｒｉｄｅｓｉｎｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ其结果见图３和表２。ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ
表２１２批次决明子药材水解产物的共有峰相对峰面积及相似度分析结果
Ｔａｂｌｅ２Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｍｍｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｅａｋｓａｎｄｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｆｏｒｍｏｎｏｓａｅｃｈａｒｉｄｅｓｉｎ
ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅ
由表２可知，来自不同产地的１２批次决明子
药材的相似度均大于０．９０，与共有模式的相似度
在０．９６３—０．９９９之间，符合国家食品药品监督管
理局对中药色谱指纹图谱相似度的要求；虽然各
药材之间各个组分的含量有差异，但均显示色谱
峰１组分的含量最高，经鉴定为甘露糖，平均含
量达１９３．８ｍｇ／ｇ，表明决明子多糖是以该组分为
主构成的杂多糖。
２．４决明子多糖水解产物的分析及其组成０１０２０３０４０５０６０特征ｆ／ｒａｉｎ
为进一步了解多糖的组成，采用ＰＭＰ衍生图４决明子多糖水解产物中单糖ＰＭＰ
衍生化产物的ＨＰＬＣ色谱图
４也／ＨＰＬＣ法对决明子多糖水解产物的单糖组分进Ｆｉｇ．４ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ行鉴定和含量测定，并计算了各单糖组分的摩尔ｆｏｒｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ比，结果分别见图４、表３—４。ｂｙＰＭＰｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
１．Ⅱｍｎｏｓｅ（甘露塘），２．ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ（葡萄糖醛酸）
３．ｇａｌａｅｔｏｓａｍｉｎｅ（氨基半乳糖），４．一ｕｃｏｓｅ（葡萄糖），
５．ｇａｌａｃｔｏｓｅ（半乳糖），６．ｘｙｌｏｓｅ（），７．ａｒａｂｉｎｏｓｅ（阿拉伯糖），８．ｆｕｏｏｓｅ（岩藻糖）
第１１期万强等：ＨＰＬＣ衍生化法分析决明子多糖水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究１２３５
｝ｎｏｄｅｔｅｃｔｅｄ（未检出）
表４决明子多糖中单糖的摩尔质量百分数计算结果（ｎ＝３）
垒：！塑！兰ｉ：旦！：！
ＷａＳ！：！！：！！！：兰丝：！ｉ：！：｝ｍｏｌａｒｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｆｏｒｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙｍｏｌａｒｍａｓｓｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ（按归一化法计算单糖的摩尔质量百分数）
结果表明，单糖组分的含量在１．６１７～３０４．５ｍｇ／ｇ之间，各批次决明子多糖均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖７种单糖组分，其中甘露糖的含量最高，在３２．６％～５７．６％之间，仅个别药材含有极低含量的岩藻糖，各组分在含量和组成比例上有明显差异，说明药材的产地和生长环境对多糖组成有较大影响。尽管如此，但也发现１２批次药材的决明子多糖具有共同基本特征：除了含有相同的７个单糖组分外，其含量大小顺序基本相同，依次为：甘露糖＞木糖＞半乳糖＞葡萄糖＞阿拉伯糖＞葡萄糖醛酸＞氨基半乳糖，显示了决明子多糖是以甘露糖为主的基本结构组成特征，其平均摩尔比为甘露糖：木糖：半乳糖：葡萄糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖＝４３．０：２４．２：１５．４：５．６：５．５：３．４：２．９，可为决明子药材及其多糖的鉴别提供依据ｏ７。８。。
２．５未知药材的鉴别分析
将市场上购买的２种决明子药材和３种掺假药材，按实验方法提取、纯化和水解，采用ＰＭＰ衍生化／ＨＰＬｃ法测定了多糖水解产物中单糖组分的含量及其摩尔比，并与１２批次药材决明子多糖的摩尔比组成以及标准指纹图谱进行相似度比较，结果见表５。
结果显示，尽管未知药材均含有特征性最强、含量最高的甘露糖以及其它６个单糖组分，但只有未知药材２的７个单糖组分的大小顺序和摩尔比与１２批药材的基本结构特征吻合，属于决明子药材；而未知药材ｌ尽管在外观上有相似之处，但甘露糖含量较低（其摩尔质量分数仅为６．５％），且木糖含量极低，与１２批次决明子药材组成有显著差异，不属于决明子种属；同样，通过比较可发现其它３个
１２３６分析测试学报第３３卷
掺假药材也不完全符合决明子的基本特征；与指纹图谱比较，５种未知药材的相似度分别为０．４０９，０．９６６，０．３９５，０．５１７和０．８３１，结果与上述判别一致，且两种方法鉴别均得到药材鉴定学的证实。
表５未知药材中多糖水解产物的测定结果（ｎ＝３）
Ｔａｂｌｅ５ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｌａｒｒａｔｉｏｉｎｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｕｎｋｎｏｗｎｓａｍｐｌｅｓｂｙＨＰＬＣ（ｎ＝３）
３结论
本文基于决明子多糖可在酸性介质中水解为单糖，采用ＰＭＰ衍生＇ｆ匕＿／ＨＰＬＣ法分析了１２批次决明子药材多糖水解产物中的单糖组分，以甘露糖为参照物建立了决明子多糖的指纹图谱，１２批次药材的相似度在０．９０以上；１２批次药材样品中均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖７种共有组分，其含量在药材中的大小分布顺序基本相同，显示了决明子多糖以甘露糖为主的基本组成结构特征。因此利用决明子多糖的指纹图谱和７种单糖组分摩尔比的特征组成可较准确地反映决明子多糖信息，应用于市售药材的鉴定分析，结果较为满意，可作为决明子多糖质量控制及其结构分析的依据。
参考文献：
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第３３卷第１１期分析测试学报Ｖ０１．３３Ｎｏ．１１２０１４年１１月ＦＥＮＸＩＣＥＳＨＩＸＵＥＢＡＯ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓ）１２３ｌ～１２３６
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－４９５７．２０１４．１１．００４
ＨＰＬＣ衍生化法分析决明子多糖水解产物中
单糖组分及其多糖组成特征的研究
万强１，吴学昊１，范华均ｈ，罗安１，陈智１，黄晓文１，张薇２
（Ｉ．广东药学院药科学院，广东广州５１０００６；２．广东药学院基础学院，广东广州５１０００６）
摘要：分别利用分光光度法和Ｉ．苯基，３一甲基一５．吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生化／ＨＰＬｃ法分析了１２批不同批次药材
的决明子多糖及其水解产物中的单糖组分，以水解的单糖组分建立了决明子多糖的ＨＰＬＣ指纹图谱，并研究
了决明子多糖的组成特征。结果表明，经过纯化的决明子多糖含量在９３．４１％一９８．５７％之间，以甘露糖为参
照峰建立了１２批药材的指纹图谱，相似度在０．９６３～０．９９９之间，多糖水解产物中单糖组分的含量在１．６１７～
３０４．５ｍｓ／ｇ之间，７个共有峰组分含量大小分布均依次为：甘露糖＞木糖＞半乳糖＞葡萄糖＞阿拉伯糖＞葡
萄糖醛酸＞氨基半乳糖，显示了决明子多糖的基本组成结构特征，１２批药材的决明子多糖中各单糖的平均
摩尔比为甘露糖：木糖：半乳糖：葡萄糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖＝４３．０：２４．２：１５．４：５．６：
５．５：３．４：２．９。指纹图谱相似度分析和多糖的组成特征分析对市售药材的分析鉴定结果一致，可作为决明
子多糖结构分析及其质量控制的依据。
关键词：决明子；多糖；水解；单糖；指纹图谱；衍生化；高效液相色谱
中图分类号：０６５７．７２；０６２９．１文献标识码：Ａ文章编号：１００４—４９５７（２０１４）１１—１２３１—０６
ＤｅｒｉｖａｔｉｖｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＨｙｄｒｏｌｙｚｅｄ
ＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．ａｎｄＴｈｅｉｒＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓＷＡＮＱｉａｎ９１，ＷＵＸｕｅ．ｈａ０１，ＦＡＮＨｕａ－ｊｕｎｈ，ＬＵＯＡｎｌ，ＣＨＥＮＺｈｉｌ，ＨＵＡＮＧＸｉａｏ．ｗｅｎｌ，ＺＨＡＮＧＷｅｉ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＣｏｕｒｓｅｓ，
ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．ｗａｓｐｅｒ－
ｆｏｒｍｅｄｂｙＵＶｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉ一
如ｆ施Ｌ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ
９３．４１％ａｎｄ９８．５７％ａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｍｏｎｏｓａｃｃｈａ—
ｒｉｄｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨＰＬＣｗｉｔｈ１一ｐｈｅｎｙｌ－３一ｍｅｔｈｙｌ－５－ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ（ＰＭＰ）ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ．
ＢａｓｅｄｏｎＨＰＬＣｄａｔａｏｆ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓ，ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．
ｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｃｏｍｍｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｅａｋｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｍａｎｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ｇａｌａｃ—
ｔｏｓａｍｉｎｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｇａｌａｃｔｏｓｅ，ｘｙｌｏｓｅａｎｄａｒａｂｉｎｏｓｅ，ａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ１．６１７—
３０４．５ｍｇ／ｇ．Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｏｒ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．ｂａｓｉｃａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆｓｅｖｅｎ
ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｎａｍｅｄｍａｎｎｏｓｅ，ｘｙｌｏｓｅ，ｇａ｜ａｃｔｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄａｎｄ
ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｍｏｌａｒｒａｔｉｏｏｆ４３．０：２４．２：１５．４：５．６：５．５：３．４：２．９．Ｆｉｎｇｅｒ—
ｐｒｉｎｔｓａｎｄｍｏｌａｒｒａｔｉｏｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｍａｔｅｒｉａｌｓｓｏｌｄｉｎ
ｍａｒｋｅｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ；ｄｅ・
ｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）
决明子（ＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．）来源于豆科植物决明的干燥成熟种子，始载于《神农本草经》，其味收稿日期：２０１４—０６—０４；修回１３期：２０１４—０８—２０
基金项目：广东药学院师资队伍建设基金项目（５２１０４１０９）｛通讯作者：范华均，博士，教授，研究方向：药物提取分离及药物分析，Ｔｅｌ：０２０—３９３５２１３５，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｕｎｈｕａｆａｎ＠１２６．ｃｏｒｎ
分析测试学报第３３卷
微苦微甘，性微寒，入肝、大肠经，有清热明目、润肠通便的作用¨。ｏ。决明子除含有蒽醌、萘并吡咯酮等有效化学成分外口。４］，还含有结构复杂的多糖化合物。目前人们逐渐发现多糖具有多方面的生物活性和功能，如抗氧化、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗病毒等，有关多糖化合物的药物活性及其作用机理研究成为一大热点ｂ。７］。多糖作为决明子的有效活性成分，其提取、分离及药理和药效等作用的研究也逐渐引起人们的重视。８。１２Ｉ。
多糖化合物由于种类多、性质相似，常采用硫酸一苯酚、硫酸一蒽酮、硫酸一咔唑等显色体系经反应显色后，采用分光光度法测定其总量。该物质由于无挥发性和缺少紫外特征吸收基团，难以用气相色谱法（ＧＣ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）进行定量分析，因而常采用凝胶色谱法和离子色谱法通过示差折光检测器（或蒸发光检测器）和电化学检测器检测，根据其排阻体积可测定多糖的分子量，但由于灵敏度低、标准品难以获得而无法测定其含量¨３－１４］；利用衍生化法可以进行ＨＰＬＣ［１５－１７１和Ｇｃ［１７一引分析，但大多局限于水解的单糖和部分寡糖组分的测定，因此直接了解多糖的定性、定量信息尚存在较大困难。多糖的色谱分析大多通过分离、纯化和水解来实现，该方法是控制多糖质量和提供多糖基本结构信息的重要方法¨７－１９］。本文基于决明子多糖在三氟乙酸介质中可完全降解为单糖，利用１－苯基－３一甲基一５．吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生化／ＨＰＬＣ法测定决明子多糖水解产物中单糖的含量Ｈ９。，采用１２批药材建立了决明子多糖的ＨＰＬＣ指纹图谱；在此基础上通过各单糖组分的定性和定量分析，研究了１２批药材决明子多糖的组成和摩尔比，以了解该多糖的基本组成和特征，为控制药材的质量，进一步研究决明子多糖的结构、药理和药效提供依据，相关研究尚无文献报道。
１实验方法
１．１仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ＳＨＩＭＡＤＺＵ２５５０ＵＶ—Ｖｉｓ分光光度计（日本岛津公司）；ＴＤ一６高速离心机（长沙平凡仪器公司）；ＴＨＺ一８２恒温振荡器（金坛富华仪器厂）；ＲＥ５２ＣＳ一１旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ＨＨ一６恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；ＪＢ—ｌ磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器厂）。
决明子药材（编号Ｓ１～Ｓ１２，产地分别为广东、广西、湖北、安徽、上海等地，由中药鉴定学教研室刘基柱副教授鉴定）；木瓜蛋白酶（７０万Ｕ，广州暨生元生物科技有限公司）；葡萄糖、核糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖（美国Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖（上海晶纯实业有限公司）；氨基半乳糖（上海Ａｄａｍａｓ—ｂｅｔａ公司）；三氟乙酸（ＴＦＡ，上海晶纯实业有限公司）；１－苯基．３一甲基－５一吡唑啉酮（ＰＭＰ，上海Ａｄａｍａｓ—ｂｅｔａ公司）；乙腈（色谱纯，德国Ｍｅｒｃｋ公司）；磷酸二氢钠（ＮａＨ：ＰＯ。・２Ｈ：Ｏ）、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ。・１２Ｈ２０）、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、苯酚、双氧水；其他试剂除特殊注明外，均为分析纯，购自广州化学试剂厂；实验用水为去离子水或超纯水。１．２实验方法
１．２．１决明子多糖的提取与纯化唧１将决明子药材烘干，粉碎，过８０目筛，称取一定量药材粉末以石油醚（ＩＩ）脱脂６ｈ，加水后于８０℃下浸提４ｈ，离心。取其上清液，按药材干重的１／５０量加入木瓜蛋白酶，在６０℃下酶解２ｈ，离心，取上清液，加入Ｓｅｖａｇｅ溶液（三氯甲烷一正丁醇，４：１）萃取多次除去蛋白，直至两相间无乳白色絮状物。取上清液加入１５％Ｈ：Ｏ：溶液脱色处理６ｈ，浓缩，再用９５％乙醇醇沉后置于４℃冰箱过夜，离心，残渣分别用２０ｍＬ丙酮和２０ｍＬ无水乙醚重复洗涤２次，氮气吹干，即得纯化的决明子多糖。
１．２．２多糖的光度测定取一定量的葡萄糖标准溶液于比色管中，加水至１．０ｍＬ，再加入１．０ｍＬ５％苯酚溶液，摇匀，缓慢加入５．０ｍＬ浓硫酸，混匀，静置３０ｍｉｎ，以水作为空白，在４８７ｎｍ处测量吸光度，多糖样品溶液（准确称取２５ｍｇ决明子多糖，用水溶解、定容）按上述光度法测定。
１．２．３多糖的水解准确称取１０ｍｇ决明子多糖样品，置于安瓿瓶中，加入２ｍＬ２ｍｏｌ／Ｌ的ＴＦＡ溶液，封口，于１１０℃下水解５ｈ，离心，取上清液，减压蒸干，加甲醇重复洗涤３次，旋干，得到水解产物，备用。
１．２．４ＰＭＰ衍生化取上述水解产物．加水溶解，定容至１０ｍＬ，准确移取０．２ｍＬ于具塞玻璃离心
第ｌＩ期万强等：ＨＰＬＣ衍生化法分析决明子多糖水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究１２３３
管中，分别加入０．２ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＰ甲醇溶液和０．２ｍＬ０．３ｍｏＶＬ的ＮａＯＨ溶液，于７０℃水浴加热６０ｍｉｎ，冷却后加入０．２ｍＬ０．３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液中和，再加入１ｍＬ氯仿萃取，离心，取上清液重复操作３次，用水稀释，定容至５ｍＬ，备用，其ＰＭＰ衍生化过程如图１所示［２１］。
０
。ｑ■毽－
图１单糖的ＰＭＰ衍生化过程
Ｆｉｇ．１０ｙ…ＮａＵＨ＠Ｉ肿Ｈ０ＤｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂｙＰＭＰｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
ＨＰＬＣ分析将上述ＰＭＰ衍生化后的样品处理液，通过０．２２斗ｍ微孔滤膜，按下述ＨＰＬＣ条
件分析：分离柱为ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉＣ】８（２５０ｍｍ×４．６０ｍｍ，５斗ｍ），流动相为乙腈一０．０５ｍｏｌ／ｍＬ磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）（１８：８２），流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３０℃，紫外检测波长２４５ｎｍ，进样量２０灿。１．２．５２结果与讨论
２．１决明子多糖含量的测定
利用硫酸一苯酚法，将决明子多糖按实验方法显色后测定其吸光度，并配制一系列葡萄糖标准溶液，经光度测量后以其吸光度和浓度绘制标准曲线，据此分别测定了１２批决明子药材中多糖的含量，结果见表１。由表１可知，１２批次药材按实验方法制备的决明子多糖，其含量在９３．４１％～９８．５７％之间，ＲＳＤ为０．２％～１．９％，表明能够较大程度地除去杂质。鉴于多糖的含量均在９３％以上，可以用于多糖组成及其水解产物单糖的分析。
Ｔａｂｌｅｌ
Ｓａｍｐｌｅ
Ｓ１
Ｓ２
Ｓ３
Ｓ４
Ｓ５
Ｓ６表１决明子粗多糖含量的测定结果（ｎ＝３）ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．（ｒｔ＝３）Ｃｏｎｔｅｎｔ（％）９４．０６９６．９２９８．３７９６．８５９５．２３９３．７１Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（ｍｇ）２３．５０２４．２３２４．６７２４．５６２３．９７２３．６９ＲＳＤ（％）０．９１．９０．２０．８１．１０．７ＳａｍｐｌｅＳ７Ｓ８Ｓ９ＳＩＯＳ１１Ｓ１２Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（ｍｇ）２４．１３２４．３６２４．７７２４．１５２３．９４２３．３８Ｃｏｎｔｅｎｔ（％）９６．４０９７．１３９８．５７９５．８０９５．０４９３．４１ＲＳＤ（％）０．５１．３１．８Ｏ．３０．７１．５
２．２决明子多糖的水解条件
取制备的决明子多糖，加入ＴＦＡ溶液将其完全水解为单糖，以进一步了解多糖的基本结构组成。按实验方法，采用ＰＭＰ衍生化／ＨＰＬｃ法测定，分别以水解的甘露糖和各单糖的峰面积和为指标，试验了不同ＴＦＡ浓度、温度和水解时间对多糖水解程度的影响，结果见图２。
ｌ２３４５
ｔ／ｈ６７８
Ｆｉｇ．２图２三氟乙酸浓度（Ａ）、温度（Ｂ）和水解时间（Ｃ）对多糖水解的影响ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＴＦＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ａ），ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）ａｎｄｔｉｍｅ（Ｃ）ｏｎｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
一●一ｍａｎｎｏｓｅ：——卜ｔｏｔａｌｍｏｎｏｓａｃｃｈａｆｉｄｅｓ由图２可知，随着ｒＩ’ＦＡ浓度的增加、温度的升高以及水解时间的延长，多糖逐渐开始水解，单糖的
分析测试学报第３３卷
量逐渐增加。当ＴＦＡ浓度大于２ｍｏｌ／Ｌ、水解温度为１１０ｏＣ，水解时间维持５ｈ时，多糖达到完全水解，因此决明子多糖完全水解为单糖的条件为：ＴＦＡ的浓度为２ｍｏｌ／Ｌ、水解温度１１０℃、水解时间５ｈ。２．３特征指纹图谱的建立与分析
取１２批次的药材分别按照实验方法提取多
糖，并在上述最佳的水解条件下完全水解多糖，
经ＰＭＰ衍生化后进行ＨＰＬＣ分析，记录多糖完全
水解产物６０ｍｉｎ的色谱图。结果表明：１２批次４
样品中有７个单糖组分共有特征峰，非共有峰小
于总峰面积的２％，以其中含量最高的色谱峰１二＝二二二仁二—————ＪｕＬ———，～—ｊ。ｕ酞—Ｌ———————一《弓——————＾——』。———ｊＬ——／也月乙＾———————一叠Ｒ
．＾＾——』。———。＾———毋√亭√Ｌ—————————一ｉ‘
为参照峰分别计算各个组分的相对峰面积，采用Ｌ—————ＪＬ——＾————／Ｌ———矗■舢√＼————．．—～ｉｊ＾Ａ码“《￥
————～ＪＬ——ｋ————、——√ｎ零／Ｌ————ｋ～ｉｊ＾—＿，———＾—』取＾．ｔ岁
国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系０．００８．７０１７．３９２６．０９３４．７８４３．４８５２．１７６０．８７统（２００４Ａ版），设定ｓ１为参照图谱，以１２批次ｔ／ｒａｉｎ
决明子样品的色谱图生成相应的共有模式作为标图３决明子多糖完全水解产物中单糖的ＨＰＬＣ指纹图谱一——————＾１Ａ＾—、＾—．—ｘ——／。———Ｊ、—＾，讳野僵＾ＬｉＬ—＾．—＿—，＾．。●Ｕ——一Ｒ——————ＪＬ——＾————ＪＬ——』０“Ｊ。———．．。—一ｑ¨＾——。、————Ｊ。——√各以凡』、———————一Ｓ１ｑＸ０＋准指纹图谱，并以此计算各批次样品的相似度，Ｆｉｇ．３ＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｅｈａｒｉｄｅｓｉｎｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ其结果见图３和表２。ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ
表２１２批次决明子药材水解产物的共有峰相对峰面积及相似度分析结果
Ｔａｂｌｅ２Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｍｍｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｅａｋｓａｎｄｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｆｏｒｍｏｎｏｓａｅｃｈａｒｉｄｅｓｉｎ
ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅ
由表２可知，来自不同产地的１２批次决明子
药材的相似度均大于０．９０，与共有模式的相似度
在０．９６３—０．９９９之间，符合国家食品药品监督管
理局对中药色谱指纹图谱相似度的要求；虽然各
药材之间各个组分的含量有差异，但均显示色谱
峰１组分的含量最高，经鉴定为甘露糖，平均含
量达１９３．８ｍｇ／ｇ，表明决明子多糖是以该组分为
主构成的杂多糖。
２．４决明子多糖水解产物的分析及其组成０１０２０３０４０５０６０特征ｆ／ｒａｉｎ
为进一步了解多糖的组成，采用ＰＭＰ衍生图４决明子多糖水解产物中单糖ＰＭＰ
衍生化产物的ＨＰＬＣ色谱图
４也／ＨＰＬＣ法对决明子多糖水解产物的单糖组分进Ｆｉｇ．４ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ行鉴定和含量测定，并计算了各单糖组分的摩尔ｆｏｒｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＣａｓｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ比，结果分别见图４、表３—４。ｂｙＰＭＰｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
１．Ⅱｍｎｏｓｅ（甘露塘），２．ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ（葡萄糖醛酸）
３．ｇａｌａｅｔｏｓａｍｉｎｅ（氨基半乳糖），４．一ｕｃｏｓｅ（葡萄糖），
５．ｇａｌａｃｔｏｓｅ（半乳糖），６．ｘｙｌｏｓｅ（），７．ａｒａｂｉｎｏｓｅ（阿拉伯糖），８．ｆｕｏｏｓｅ（岩藻糖）
第１１期万强等：ＨＰＬＣ衍生化法分析决明子多糖水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究１２３５
｝ｎｏｄｅｔｅｃｔｅｄ（未检出）
表４决明子多糖中单糖的摩尔质量百分数计算结果（ｎ＝３）
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结果表明，单糖组分的含量在１．６１７～３０４．５ｍｇ／ｇ之间，各批次决明子多糖均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖７种单糖组分，其中甘露糖的含量最高，在３２．６％～５７．６％之间，仅个别药材含有极低含量的岩藻糖，各组分在含量和组成比例上有明显差异，说明药材的产地和生长环境对多糖组成有较大影响。尽管如此，但也发现１２批次药材的决明子多糖具有共同基本特征：除了含有相同的７个单糖组分外，其含量大小顺序基本相同，依次为：甘露糖＞木糖＞半乳糖＞葡萄糖＞阿拉伯糖＞葡萄糖醛酸＞氨基半乳糖，显示了决明子多糖是以甘露糖为主的基本结构组成特征，其平均摩尔比为甘露糖：木糖：半乳糖：葡萄糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖＝４３．０：２４．２：１５．４：５．６：５．５：３．４：２．９，可为决明子药材及其多糖的鉴别提供依据ｏ７。８。。
２．５未知药材的鉴别分析
将市场上购买的２种决明子药材和３种掺假药材，按实验方法提取、纯化和水解，采用ＰＭＰ衍生化／ＨＰＬｃ法测定了多糖水解产物中单糖组分的含量及其摩尔比，并与１２批次药材决明子多糖的摩尔比组成以及标准指纹图谱进行相似度比较，结果见表５。
结果显示，尽管未知药材均含有特征性最强、含量最高的甘露糖以及其它６个单糖组分，但只有未知药材２的７个单糖组分的大小顺序和摩尔比与１２批药材的基本结构特征吻合，属于决明子药材；而未知药材ｌ尽管在外观上有相似之处，但甘露糖含量较低（其摩尔质量分数仅为６．５％），且木糖含量极低，与１２批次决明子药材组成有显著差异，不属于决明子种属；同样，通过比较可发现其它３个
１２３６分析测试学报第３３卷
掺假药材也不完全符合决明子的基本特征；与指纹图谱比较，５种未知药材的相似度分别为０．４０９，０．９６６，０．３９５，０．５１７和０．８３１，结果与上述判别一致，且两种方法鉴别均得到药材鉴定学的证实。
表５未知药材中多糖水解产物的测定结果（ｎ＝３）
Ｔａｂｌｅ５ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｌａｒｒａｔｉｏｉｎｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｕｎｋｎｏｗｎｓａｍｐｌｅｓｂｙＨＰＬＣ（ｎ＝３）
３结论
本文基于决明子多糖可在酸性介质中水解为单糖，采用ＰＭＰ衍生＇ｆ匕＿／ＨＰＬＣ法分析了１２批次决明子药材多糖水解产物中的单糖组分，以甘露糖为参照物建立了决明子多糖的指纹图谱，１２批次药材的相似度在０．９０以上；１２批次药材样品中均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖７种共有组分，其含量在药材中的大小分布顺序基本相同，显示了决明子多糖以甘露糖为主的基本组成结构特征。因此利用决明子多糖的指纹图谱和７种单糖组分摩尔比的特征组成可较准确地反映决明子多糖信息，应用于市售药材的鉴定分析，结果较为满意，可作为决明子多糖质量控制及其结构分析的依据。
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