・３１９・
．综述．
乙型脑炎病毒反向遗传技术研究进展
李佳，朱武洋，王兰，粱国栋
乙型脑炎病毒能够引起流行性乙型脑炎，该病可引起人类永久性中枢神经系统后遗症，且致死率较高。该病毒免疫逃逸、跨越血脑屏障及其跨种阃传播与感染等机制尚不清楚．而反向遗传技术对于阐明乙脑病毒致病分子机理、研制重组病毒疫苗及开发基因工程载体是蕈要的技术手段。本文将就乙脑病毒反向遗传技术的研究状况、限制因素及应用加以综述。
ｌ
前言
流行性乙型脑炎（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，ＪＥ）是由乙型脑
炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ．ＪＥＶ）引起的病毒性脑炎，主要流行于亚洲和太平洋地区¨工１。每年有３５０００—５００００
人患病．死产１０
０００—１５
０００人¨’。全世界大约３０亿人生活
在乙脑流行区…，加之每年大量的旅游者到乙脑流行区域旅
行而使患病牢增加。提示乙脑已经成为危害人类生命和财
产安全的莺要公共卫生问题。目前。乙脑病毒的基因组结构已得到证实，但乙脑的发病机制，特别是乙腩病毒免疫逃逸、跨越血脑屏障及其跨种间传播与感染的分子机制一直不清。
乙型脑炎病毒简称乙脑病毒，隶属于黄病毒科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）黄病毒属（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）。该病毒基冈组序列已被完整的测定出来，５７末端有一个帽子结构即ｍ７Ｇ（５’）ＰＰＰ（５’）ＡｐＵｐ．３’末端没有ｐｏｌｙＡ．而是以ＣＵ－ＯＨ为尾巴¨Ｊ。在病毒的复制、翻译和病毒颗粒包装的过程中，５’和３’末端非编码区起到了不可或缺的作用。在５’和３’端非编码区之间的单一开放阅读框（ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ．ＯＲＦ）编码约３４３２
个氮基酸残基的多聚蛋白．自５’至３’端依次为三种结构蛋白Ｃ、ｐｒＭ和Ｅ以及七种非结构蛋白ＮＳＩ、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ和ＮＳ５㈩。
’
由于乙脑病毒属于非逆转录ＲＮＡ病毒，其复制过程中
不形成中间体ＤＮＡ．因此直接对病毒基因组ＲＮＡ进行基因工程操作存在一定的困难。乙脑病毒反向遗传技术是指由
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－９２７９．２０１Ｉ．０４．０２７
基金项目：国家自然科学基金项目（３０９７０１６０）；传染病预防控制国家蕈点实验室（２０ＩｌＳＫＬＩＤ２０５）：重大传染病防治科技重大专项项目（２００８ＺＸｌ０００４－００１；２００９ＺＸｌ０００４－７０５）
作者单位：０３０００６
太原，山西大学生命科学学院（李佳、壬
兰）：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（朱武洋、粟围栋）
通信作者：王兰．Ｅｍａｉｌ：［ａｎｗａｎｇ＠ＳＸＵ．ｅｄｕ．ｃｎ；粱国栋。Ｅｍａｉｌ：
ｇｄｌｉａｎｇ＠ｈｏｔｍｍｌ．ｃｏｍ
万方数据
病毒来源的ｃＤＮＡ克隆获得恢复病毒的技术，该平台为阐明
乙脑病毒致病分子机理、研制病毒疫苗和开发基因工程载体等研究奠定了物质基础。本研究将就乙脑病毒反向遗传技术的研究状况、限制因素及应用加以综述。
２乙脑病毒反向遗传系统的研究状况２．１
国外研究状况
最早研究ＪＥＶ反向遗传技术的是
Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等”１，１９９２年该研究小组通过ＲＴ—ＰＣＢ方法扩增
获得了ＪＥＶ基因组全长ｅＤＮＡ的两个半分子，这两个片段的
长度分别为５５７６ｂｐ和５４００ｂｐ。将这两个半分子片段分别克隆至载体中获得了两个ＪＥＶ亚基因组克隆（Ｍ３４３和
Ｈ７５６）．起初该小组把半分子片段经体外连接获得的ＪＥＶ全
长ｅＤＮＡ克隆至ｐＢＲ３２２载体中。期望经体外转录获得具有感染性的ＲＮＡ转录本。但实验没有获得成功．其原因可能是ＪＥＶ基因组全长ｅＤＮＡ，尤其是基因组５’末端对大肠埃希菌有毒性，使ＪＥＶ基因组在宿主菌中不稳定。为解决这一问题，Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等直接将ＪＥＶ两个半分子连接成基因组全长ｅＤＮＡ。为对恢复病毒进行鉴定，在全长ｅＤＮＡ的３’末端非编码区９１３１ｂｐ处加入了单一酶切位点ＸｂａＩ，使恢复病毒具有与亲本病毒不同的分子标识。以此ｅＤＮＡ为模板转录出的ＲＮＡ转染ＢＨＫ．２１细胞后获得了恢复病毒．且经酶切鉴定的恢复病毒与亲本病毒的生长曲线、在ＢＨＫ一２１细胞一｜：的空斑表型、在Ｃ６／３６细胞内的信号肽表达及其神经毒性等生物学特性均较为相似∞１。
为了克服ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ克隆在宿主菌中的不稳定性。Ｓａｎｇ－Ｉｍ等¨１以细菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ＢＡＣｓ）为载体构建了ＪＥＶ感染性克隆。将ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ克隆到细菌人工染色体．然后以其为模板进行体外转录，所获得的转录本ＲＮＡ的感染力大约为ｌＯ’一１０６ＰＦＵ／ｍ１．转染宿主细胞后所获得的恢复病毒的滴度可达
１０６—１０７ＰＦＵ／ｍｌ。而且所获得的恢复病毒和亲本病毒在感
染性、致病性等生物学特性上具有相似性油’。另外，在重组
ＢＡＣｓ上对ＪＥＶ基因组上进行点突变后，测序鉴定结果表明恢复病毒来自于该感染性ｅＤＮＡ克隆‘“。这也再次证明可通过反向遗传技术从分子水平上对ＪＥＶ基因组进行改造和应用。
２．２国内研究状况
黄庆生等利用长模板ＲＴ－ＰＣＲ法，一
次扩增出ＳＡｌ４株ＪＥＶ的基因组全长ｅＤＮＡ片段，并使用大片段克隆技术将其克隆于黏粒载体的ＲＮＡ聚合酶启动子下游。所使用的黏粒载体克隆位点两端具有１７和ＳＰ６启动
・３２０・
子，可根据不同的插入方向在体外转录时选择相应的ＲＮＡ聚合酶。以该重组载体为模板经体外转录可获得病毒的全长转录本ＲＮＡ，采用脂质体转染法转染ＢＨＫ细胞后，转录本
ＲＮＡ可使细胞产生病变，经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧
光染色证明为ＪＥＶ。这一结果说明该克隆具有一定的感染性…。另外，以一条含有ＲＮＡ聚合酶启动子序列的５’引物
为基础，利用长模板ＲＴ—ＰＣＲ方法一次扩增出带有启动子的基因组全长ｅＤＮＡ，该小组以其为模板也获得了具有感染性的转录本ＲＮＡ【７Ｊ。曾明等¨’利用类似的方法也获得了．ＪＥＶ
减毒株ＳＡｌ４．１４．２的恢复病毒。
黄莺等一１利用ＲＴ．ＰＣＲ法扩增出ＪＥＶ减毒株ＳＡｌ４－１４－２
的４个片段，并将其分别克隆到质粒载体中，进～步构建两
个半端分子克隆．最终将全长ｃＤＮＡ克隆到改造过的载体
ｐＢＲ—ｋｐｎ中，并选取一个生长相对缓慢的ＪＭｌ０９菌株为宿主菌。经体外转录得到的ＲＮＡ转录本采用脂质体转染法转染ＢＨＫ一２１细胞后。获得了ＪＥＶ恢复病毒。实验结果证实恢复
病毒在生物学特性、分子生物学和蛋白表达水平等几个方匾
与亲本病毒基本一致。
３乙脑病毒感染性克隆构建的限翩因素
全长ｃＤＮＡ克隆的不稳定性是黄病毒属病毒反向遗传
系统构建工作最重要的限制性因素。已有研究表明，通过
ＲＴ—ＰＣＲ、体外连接等方法可以获得黄病毒基因组全长ｅＤＮＡ克隆，但是由于对大肠埃希菌的毒性或其他因素，使得全长
克隆不稳定而导致感染性ｅＤＮＡ克隆构建工作的失败。豌豆早桔病毒（ｐｅａｅａｒｌｙ—ｂｒｏｗｎｉｎｇｖｉｒｕｓ）、茄子花叶病毒
（ｅｇｇｐｌａｎｔ
ｍｏｓａｉｃ
ｖｉｒｕｓ）以及甜菜坏死黄脉病毒（ｂｅｅｔ
ｎｅｃｒｏｔｉｃ
ｙｅｌｌｏｗｖｅｉｎｖｉｒｕｓ）的反向遗传研究中也存在类似问题¨…。
已有研究工作表明，可以通过选择合适的载体、菌株等方法克服这一限制因素。３．１载体选择黄病毒属病毒主要包括ＪＥＶ、黄热病毒（ｙｅｌｌｏｗ
ｆｅｖｅｒ
ｖｉｒｕｓ，ＹＦＶ）和登革病毒（Ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓ，ＤＥＮＶ）
等，基因组全长ｅＤＮＡ在宿主细胞中的不稳定性严重阻碍了
黄病毒反向遗传技术的研究进展。在黄病毒属病毒中，ＹＦＶ是感染性克隆构建较为成功的成员之一。Ｒｉｃｅ等…１在黄热病毒两个亚基因组克隆，即ｐＹＦ５’３’ＩＶ和ｐＹＦＭ５．２的基础上经体外连接构建了病毒全长ｅＤＮＡ片段，以其为模板经体外转录和转染获得了恢复病毒。黄病毒也是第一个使用体外
连接方法获得感染性转录本ＲＮＡ的病毒。载体ｐＡＣＹＣｌ７７
是一低拷贝质粒，以该载体为骨架成功构建了鼠疫病毒感染性ｅＤＮＡ克隆１１２０”。低拷贝质粒ｐＡＣＮＲＩｌ８０是在ｐＡＣＹＣｌ７７质粒的基础上改造而来的。Ｒｉｃｅ等…１以ｐＡＣＮＲｌｌ８０为载体成功获得了ＹＦ－１７Ｄ的全长ｅＤＮＡ克隆ｐＡＣＮＲ／ＦＬＹＦ－１７Ｄｘ。以其为模板转录出的ＲＮＡ转录本经脂
质体转染后的病毒滴度可达１０５—１０６
ｐｈ／¨ｇ
ＲＮＡ。且
ｐＡＣＮＲ／ＦＬＹＦ．１７Ｄｘ克隆来源的恢复病毒与亲本病毒具有相
似的蛋白水解动力学曲线、病毒ＲＮＡ合成和生长曲线¨“。
万方数据
解决ＪＥＶ全长ｃＤＮＡ在细菌体内的潜在毒性和不稳定性的问题，可以通过选择合适的克隆载体得以解决。通常而言，
携带外源长片段的载体会对宿主表现出一定程度的限制性，而基冈组ｅＤＮＡ在中、低拷贝的克隆载体中较稳定¨…。过
去各种载体系统试图用于装配ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ，包括大肠埃希菌的黏性末端质粒载体，结果表明ｃＤＮＡ克隆在遗传学上
均不稳定¨’”。“。与之类似．以高拷贝ＰＵＣ质粒和中拷贝
ｐＢＲ３２２载体为骨架构建ＪＥＶＣＮＵ／ＬＰ２全长ｅＤＮＡ克隆的工作也是失败的∞ｏ。与此相比，Ｓａｎｇ．Ｉｍ等阳１将ＪＥＶ
ｃＤＮＡ
克隆在低拷贝的ＢＡＣｓ载体上（每个大肠埃希菌细胞中只有１或２拷贝），获得了稳定的ＪＥＶ感染性ｃＤＮＡ克隆，在大肠
埃希菌中增殖１８０代后其遗传学结构和功能依然稳定。类
似的低拷贝载体在一些其他黄病毒感染性克隆构建工作中
也有报道，如蜱传脑炎病毒（ｔｉｃｋ．ｂｏｒｎｅ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ
ｖｉｒｕｓ，
ＴＢＥＶ）¨副和墨累溪谷脑炎病毒（ｍｕｒｒａｙｖａｌｌｅｙ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ
ｖｉｒｕｓ．ＭＶＥＶ）”…。这些研究均表明，选择ＢＡＣｓ、ｐＡＣＮＲｌｌ８０质粒等低拷贝载体是黄病毒感染性全长ｅＤＮＡ克隆构建工作的重要策略之一，而这对于构建ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ克隆具有
一定的借鉴意义。
３．２其他因素除了选择合适的载体之外，宿主菌、克隆方
法的选择同样对ＪＥＶ等黄病毒感染性全长ｅＤＮＡ克隆构建工作至关重要。研究结果表明选择生长相对较为缓慢的宿
主菌，如ＤＨ５ａ、ＪＭｌ０９及ＭＣｌ０６１等，可以有效提高ＪＥＶ基
因组ｅＤＮＡ的稳定性Ⅲ１。此外，选择合理的克隆方法有助于感染性克隆的构建。感染性克隆的构建方法主要有三种，
第一种方法是运用ＲＴ—ＰＣＲ方法分段扩增出ＪＥＶ基因组
ｅＤＮＡ片段，将得到的ｅＤＮＡ片段分段连人载体后得到全长ｅＤＮＡ模板用于转录＂’１１，ｔｓｊ，这种方法规避了病毒ｅＤＮＡ基因组的不稳定问题，但实用性较筹，较为繁琐费时。第二种方法是利用高保真长片段ＲＴ－ＰＣＲ法获得含有ＳＰ６或１７启
动子的全长ｅＤＮＡ，这种方法虽然简便快捷，但对试剂品质
要求较高，而且难以对病毒基因组进行定点突变旧“。第三种则是在选择合适的载体和宿主菌的前提下运用融合ＰＣＲ法分段获得ＪＥＶ基因组ｅＤＮＡ片段。然后经体外连接得到ＪＥＶ基因组全长ｅＤＮＡ后将全长ｅＤＮＡ连入载体中的方法。４乙脑病毒反向遗传技术的应用
４．１基础研究反向遗传技术是研究ＲＮＡ病毒基因组结构和功能之间关系的新兴技术。ＪＥＶ反向遗传技术可被广泛应用于基础理论研究和实践生产研究领域。在基础研究方面，反向遗传技术可以帮助我们研究ＪＥＶ复制、转录及转
染的分子机制，也可以确定ＪＥＶ神经毒力和发病机制相关的毒力位点。Ｓａｎｇ．１ｍ等¨’利用反向遗传技术对ＪＥＶ的３’末端进行了研究，研究表明具有３’末端保守序列的ＲＮＡ转
录本的感染性比经过反向遗传技术改造后的３’末端具有３
或４个与病毒核苷酸序列无关的ＲＮＡ转录本要高ｌＯ倍。
刘欣玉等旧引利用反向遗传技术对ＪＥＶＳＡ４及ＳＡｌ４的神经
毒力进行了研究，ＳＡ４的氨基酸序列与ＳＡｌ４存在１７个位点
的差异。而ＳＡ４的神经毒力比ＳＡｌ４强，说明了这１７个差异
氨基酸位点口ｒ能影响着ＪＥＶ的神经毒力。而ＪＥＶ免疫逃逸、跨越血脑屏障及其跨种问传播与感染等分子机制的进一
步探索也离不开ＪＥＶ反向遗传技术平台。
４．２载体开发通过反向遗传技术可以将ＪＥＶ感染性克隆改造成ＲＮＡ型或ＤＮＡ型的复制子载体，这些载体在真核细胞乍物学研究巾广泛应用．是表达外源基因极有价值的遗传
学丁具。作为ＲＮＡ型病毒载体，外源基冈在体内有效表达
的载体系统是研究基因治疗和疫苗的重要策略，日前常用ＤＮＡ病毒载体、逆转录病毒载体或裸ＤＮＡ，而ＲＮＡ病毒载
体的应用则提供ｒ另一种研究途径。与常用的ＤＮＡ病毒载
体相比，ＲＮＡ病毒载体的基闪组小，构建和操作较为方便，其生命周期中不经历ＤＮＡ阶段，不会整合到宿主细胞染色体从而引起低水平表达或基因沉默，不会改变物种的遗传性。Ｓａｎｇ—ｌｍ等【６１将两个代表性的报告基因绿色荧光蛋白
（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）和荧光索酶（１ｕｃｉｆｅｃａｓｅ）插入
ＪＥＶ基因组ＲＮＡ后转染ＢＨＫ－２ｌ细胞，两个报告基因均得到
了表达。由此可知，ＪＥＶ感染性ｅＤＮＡ在表达外源基因时起
到了真核表达载体的作用。
４．３重组疫苗研发减毒己脑重组疫苗是经过定向操纵感染性ＪＥＶｅＤＮＡ克隆，从而产生孽组ＪＥＶ。如ＪＥＶ的Ｅ蛋白中的１个氨肇酸就是这样被证实为毒力相关位点，当ＪＥＶ的Ｅ—１３８位点谷氨腋突变为赖氨酸时，突变株的毒力比原毒株减弱¨…。嵌合疫苗是在ＪＥＶ基因组感染性克隆基础卜，将不同病毒抗原基因嵌合在一起，使之在体内产生有感染性的病毒粒子。因此，反向遗传技术为ＪＥＶ的相关研究提供了有利的生物学工具。
总之，反向遗传技术是研究病毒分子机制和遗传学原理的技术平台，本综述概述了ＪＥＶ反向遗传技术的研究状况、限制因素及其在基础研究等领域巾的应用。如何构建稳定的全长ｅＤＮＡ仍是ＪＥＶ反向遗传技术尚待解决的核心问题。尽管ＪＥＶ感染性ＲＮＡ可以通过全长ｃＤＮＡ克隆获得，但是当ｅＤＮＡ克隆在宿主细胞中复制时容易引入突变。而体外连接获得的全长ｅＤＮＡ模板在遗传学七具有稳定性，但是体外连接方法费时、费力，实际应用价值不大。已有研究丁作表明，选用ＢＡＣｓ、ｐＡＣＮＲｌｌ８０质粒等中低拷Ｄ！载体是解决黄病毒全长ｅＤＮＡ在细荫体内潜在毒性和不稳定性的重要策略之一。而这对于构建ＪＥＶ感染性全长ｅＤＮＡ克隆具有一定的借鉴意义。
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．综述．
乙型脑炎病毒反向遗传技术研究进展
李佳，朱武洋，王兰，粱国栋
乙型脑炎病毒能够引起流行性乙型脑炎，该病可引起人类永久性中枢神经系统后遗症，且致死率较高。该病毒免疫逃逸、跨越血脑屏障及其跨种阃传播与感染等机制尚不清楚．而反向遗传技术对于阐明乙脑病毒致病分子机理、研制重组病毒疫苗及开发基因工程载体是蕈要的技术手段。本文将就乙脑病毒反向遗传技术的研究状况、限制因素及应用加以综述。
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前言
流行性乙型脑炎（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，ＪＥ）是由乙型脑
炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ．ＪＥＶ）引起的病毒性脑炎，主要流行于亚洲和太平洋地区¨工１。每年有３５０００—５００００
人患病．死产１０
０００—１５
０００人¨’。全世界大约３０亿人生活
在乙脑流行区…，加之每年大量的旅游者到乙脑流行区域旅
行而使患病牢增加。提示乙脑已经成为危害人类生命和财
产安全的莺要公共卫生问题。目前。乙脑病毒的基因组结构已得到证实，但乙脑的发病机制，特别是乙腩病毒免疫逃逸、跨越血脑屏障及其跨种间传播与感染的分子机制一直不清。
乙型脑炎病毒简称乙脑病毒，隶属于黄病毒科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）黄病毒属（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）。该病毒基冈组序列已被完整的测定出来，５７末端有一个帽子结构即ｍ７Ｇ（５’）ＰＰＰ（５’）ＡｐＵｐ．３’末端没有ｐｏｌｙＡ．而是以ＣＵ－ＯＨ为尾巴¨Ｊ。在病毒的复制、翻译和病毒颗粒包装的过程中，５’和３’末端非编码区起到了不可或缺的作用。在５’和３’端非编码区之间的单一开放阅读框（ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ．ＯＲＦ）编码约３４３２
个氮基酸残基的多聚蛋白．自５’至３’端依次为三种结构蛋白Ｃ、ｐｒＭ和Ｅ以及七种非结构蛋白ＮＳＩ、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ和ＮＳ５㈩。
’
由于乙脑病毒属于非逆转录ＲＮＡ病毒，其复制过程中
不形成中间体ＤＮＡ．因此直接对病毒基因组ＲＮＡ进行基因工程操作存在一定的困难。乙脑病毒反向遗传技术是指由
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－９２７９．２０１Ｉ．０４．０２７
基金项目：国家自然科学基金项目（３０９７０１６０）；传染病预防控制国家蕈点实验室（２０ＩｌＳＫＬＩＤ２０５）：重大传染病防治科技重大专项项目（２００８ＺＸｌ０００４－００１；２００９ＺＸｌ０００４－７０５）
作者单位：０３０００６
太原，山西大学生命科学学院（李佳、壬
兰）：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（朱武洋、粟围栋）
通信作者：王兰．Ｅｍａｉｌ：［ａｎｗａｎｇ＠ＳＸＵ．ｅｄｕ．ｃｎ；粱国栋。Ｅｍａｉｌ：
ｇｄｌｉａｎｇ＠ｈｏｔｍｍｌ．ｃｏｍ
万方数据
病毒来源的ｃＤＮＡ克隆获得恢复病毒的技术，该平台为阐明
乙脑病毒致病分子机理、研制病毒疫苗和开发基因工程载体等研究奠定了物质基础。本研究将就乙脑病毒反向遗传技术的研究状况、限制因素及应用加以综述。
２乙脑病毒反向遗传系统的研究状况２．１
国外研究状况
最早研究ＪＥＶ反向遗传技术的是
Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等”１，１９９２年该研究小组通过ＲＴ—ＰＣＢ方法扩增
获得了ＪＥＶ基因组全长ｅＤＮＡ的两个半分子，这两个片段的
长度分别为５５７６ｂｐ和５４００ｂｐ。将这两个半分子片段分别克隆至载体中获得了两个ＪＥＶ亚基因组克隆（Ｍ３４３和
Ｈ７５６）．起初该小组把半分子片段经体外连接获得的ＪＥＶ全
长ｅＤＮＡ克隆至ｐＢＲ３２２载体中。期望经体外转录获得具有感染性的ＲＮＡ转录本。但实验没有获得成功．其原因可能是ＪＥＶ基因组全长ｅＤＮＡ，尤其是基因组５’末端对大肠埃希菌有毒性，使ＪＥＶ基因组在宿主菌中不稳定。为解决这一问题，Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等直接将ＪＥＶ两个半分子连接成基因组全长ｅＤＮＡ。为对恢复病毒进行鉴定，在全长ｅＤＮＡ的３’末端非编码区９１３１ｂｐ处加入了单一酶切位点ＸｂａＩ，使恢复病毒具有与亲本病毒不同的分子标识。以此ｅＤＮＡ为模板转录出的ＲＮＡ转染ＢＨＫ．２１细胞后获得了恢复病毒．且经酶切鉴定的恢复病毒与亲本病毒的生长曲线、在ＢＨＫ一２１细胞一｜：的空斑表型、在Ｃ６／３６细胞内的信号肽表达及其神经毒性等生物学特性均较为相似∞１。
为了克服ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ克隆在宿主菌中的不稳定性。Ｓａｎｇ－Ｉｍ等¨１以细菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ＢＡＣｓ）为载体构建了ＪＥＶ感染性克隆。将ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ克隆到细菌人工染色体．然后以其为模板进行体外转录，所获得的转录本ＲＮＡ的感染力大约为ｌＯ’一１０６ＰＦＵ／ｍ１．转染宿主细胞后所获得的恢复病毒的滴度可达
１０６—１０７ＰＦＵ／ｍｌ。而且所获得的恢复病毒和亲本病毒在感
染性、致病性等生物学特性上具有相似性油’。另外，在重组
ＢＡＣｓ上对ＪＥＶ基因组上进行点突变后，测序鉴定结果表明恢复病毒来自于该感染性ｅＤＮＡ克隆‘“。这也再次证明可通过反向遗传技术从分子水平上对ＪＥＶ基因组进行改造和应用。
２．２国内研究状况
黄庆生等利用长模板ＲＴ－ＰＣＲ法，一
次扩增出ＳＡｌ４株ＪＥＶ的基因组全长ｅＤＮＡ片段，并使用大片段克隆技术将其克隆于黏粒载体的ＲＮＡ聚合酶启动子下游。所使用的黏粒载体克隆位点两端具有１７和ＳＰ６启动
・３２０・
子，可根据不同的插入方向在体外转录时选择相应的ＲＮＡ聚合酶。以该重组载体为模板经体外转录可获得病毒的全长转录本ＲＮＡ，采用脂质体转染法转染ＢＨＫ细胞后，转录本
ＲＮＡ可使细胞产生病变，经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧
光染色证明为ＪＥＶ。这一结果说明该克隆具有一定的感染性…。另外，以一条含有ＲＮＡ聚合酶启动子序列的５’引物
为基础，利用长模板ＲＴ—ＰＣＲ方法一次扩增出带有启动子的基因组全长ｅＤＮＡ，该小组以其为模板也获得了具有感染性的转录本ＲＮＡ【７Ｊ。曾明等¨’利用类似的方法也获得了．ＪＥＶ
减毒株ＳＡｌ４．１４．２的恢复病毒。
黄莺等一１利用ＲＴ．ＰＣＲ法扩增出ＪＥＶ减毒株ＳＡｌ４－１４－２
的４个片段，并将其分别克隆到质粒载体中，进～步构建两
个半端分子克隆．最终将全长ｃＤＮＡ克隆到改造过的载体
ｐＢＲ—ｋｐｎ中，并选取一个生长相对缓慢的ＪＭｌ０９菌株为宿主菌。经体外转录得到的ＲＮＡ转录本采用脂质体转染法转染ＢＨＫ一２１细胞后。获得了ＪＥＶ恢复病毒。实验结果证实恢复
病毒在生物学特性、分子生物学和蛋白表达水平等几个方匾
与亲本病毒基本一致。
３乙脑病毒感染性克隆构建的限翩因素
全长ｃＤＮＡ克隆的不稳定性是黄病毒属病毒反向遗传
系统构建工作最重要的限制性因素。已有研究表明，通过
ＲＴ—ＰＣＲ、体外连接等方法可以获得黄病毒基因组全长ｅＤＮＡ克隆，但是由于对大肠埃希菌的毒性或其他因素，使得全长
克隆不稳定而导致感染性ｅＤＮＡ克隆构建工作的失败。豌豆早桔病毒（ｐｅａｅａｒｌｙ—ｂｒｏｗｎｉｎｇｖｉｒｕｓ）、茄子花叶病毒
（ｅｇｇｐｌａｎｔ
ｍｏｓａｉｃ
ｖｉｒｕｓ）以及甜菜坏死黄脉病毒（ｂｅｅｔ
ｎｅｃｒｏｔｉｃ
ｙｅｌｌｏｗｖｅｉｎｖｉｒｕｓ）的反向遗传研究中也存在类似问题¨…。
已有研究工作表明，可以通过选择合适的载体、菌株等方法克服这一限制因素。３．１载体选择黄病毒属病毒主要包括ＪＥＶ、黄热病毒（ｙｅｌｌｏｗ
ｆｅｖｅｒ
ｖｉｒｕｓ，ＹＦＶ）和登革病毒（Ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓ，ＤＥＮＶ）
等，基因组全长ｅＤＮＡ在宿主细胞中的不稳定性严重阻碍了
黄病毒反向遗传技术的研究进展。在黄病毒属病毒中，ＹＦＶ是感染性克隆构建较为成功的成员之一。Ｒｉｃｅ等…１在黄热病毒两个亚基因组克隆，即ｐＹＦ５’３’ＩＶ和ｐＹＦＭ５．２的基础上经体外连接构建了病毒全长ｅＤＮＡ片段，以其为模板经体外转录和转染获得了恢复病毒。黄病毒也是第一个使用体外
连接方法获得感染性转录本ＲＮＡ的病毒。载体ｐＡＣＹＣｌ７７
是一低拷贝质粒，以该载体为骨架成功构建了鼠疫病毒感染性ｅＤＮＡ克隆１１２０”。低拷贝质粒ｐＡＣＮＲＩｌ８０是在ｐＡＣＹＣｌ７７质粒的基础上改造而来的。Ｒｉｃｅ等…１以ｐＡＣＮＲｌｌ８０为载体成功获得了ＹＦ－１７Ｄ的全长ｅＤＮＡ克隆ｐＡＣＮＲ／ＦＬＹＦ－１７Ｄｘ。以其为模板转录出的ＲＮＡ转录本经脂
质体转染后的病毒滴度可达１０５—１０６
ｐｈ／¨ｇ
ＲＮＡ。且
ｐＡＣＮＲ／ＦＬＹＦ．１７Ｄｘ克隆来源的恢复病毒与亲本病毒具有相
似的蛋白水解动力学曲线、病毒ＲＮＡ合成和生长曲线¨“。
万方数据
解决ＪＥＶ全长ｃＤＮＡ在细菌体内的潜在毒性和不稳定性的问题，可以通过选择合适的克隆载体得以解决。通常而言，
携带外源长片段的载体会对宿主表现出一定程度的限制性，而基冈组ｅＤＮＡ在中、低拷贝的克隆载体中较稳定¨…。过
去各种载体系统试图用于装配ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ，包括大肠埃希菌的黏性末端质粒载体，结果表明ｃＤＮＡ克隆在遗传学上
均不稳定¨’”。“。与之类似．以高拷贝ＰＵＣ质粒和中拷贝
ｐＢＲ３２２载体为骨架构建ＪＥＶＣＮＵ／ＬＰ２全长ｅＤＮＡ克隆的工作也是失败的∞ｏ。与此相比，Ｓａｎｇ．Ｉｍ等阳１将ＪＥＶ
ｃＤＮＡ
克隆在低拷贝的ＢＡＣｓ载体上（每个大肠埃希菌细胞中只有１或２拷贝），获得了稳定的ＪＥＶ感染性ｃＤＮＡ克隆，在大肠
埃希菌中增殖１８０代后其遗传学结构和功能依然稳定。类
似的低拷贝载体在一些其他黄病毒感染性克隆构建工作中
也有报道，如蜱传脑炎病毒（ｔｉｃｋ．ｂｏｒｎｅ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ
ｖｉｒｕｓ，
ＴＢＥＶ）¨副和墨累溪谷脑炎病毒（ｍｕｒｒａｙｖａｌｌｅｙ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ
ｖｉｒｕｓ．ＭＶＥＶ）”…。这些研究均表明，选择ＢＡＣｓ、ｐＡＣＮＲｌｌ８０质粒等低拷贝载体是黄病毒感染性全长ｅＤＮＡ克隆构建工作的重要策略之一，而这对于构建ＪＥＶ全长ｅＤＮＡ克隆具有
一定的借鉴意义。
３．２其他因素除了选择合适的载体之外，宿主菌、克隆方
法的选择同样对ＪＥＶ等黄病毒感染性全长ｅＤＮＡ克隆构建工作至关重要。研究结果表明选择生长相对较为缓慢的宿
主菌，如ＤＨ５ａ、ＪＭｌ０９及ＭＣｌ０６１等，可以有效提高ＪＥＶ基
因组ｅＤＮＡ的稳定性Ⅲ１。此外，选择合理的克隆方法有助于感染性克隆的构建。感染性克隆的构建方法主要有三种，
第一种方法是运用ＲＴ—ＰＣＲ方法分段扩增出ＪＥＶ基因组
ｅＤＮＡ片段，将得到的ｅＤＮＡ片段分段连人载体后得到全长ｅＤＮＡ模板用于转录＂’１１，ｔｓｊ，这种方法规避了病毒ｅＤＮＡ基因组的不稳定问题，但实用性较筹，较为繁琐费时。第二种方法是利用高保真长片段ＲＴ－ＰＣＲ法获得含有ＳＰ６或１７启
动子的全长ｅＤＮＡ，这种方法虽然简便快捷，但对试剂品质
要求较高，而且难以对病毒基因组进行定点突变旧“。第三种则是在选择合适的载体和宿主菌的前提下运用融合ＰＣＲ法分段获得ＪＥＶ基因组ｅＤＮＡ片段。然后经体外连接得到ＪＥＶ基因组全长ｅＤＮＡ后将全长ｅＤＮＡ连入载体中的方法。４乙脑病毒反向遗传技术的应用
４．１基础研究反向遗传技术是研究ＲＮＡ病毒基因组结构和功能之间关系的新兴技术。ＪＥＶ反向遗传技术可被广泛应用于基础理论研究和实践生产研究领域。在基础研究方面，反向遗传技术可以帮助我们研究ＪＥＶ复制、转录及转
染的分子机制，也可以确定ＪＥＶ神经毒力和发病机制相关的毒力位点。Ｓａｎｇ．１ｍ等¨’利用反向遗传技术对ＪＥＶ的３’末端进行了研究，研究表明具有３’末端保守序列的ＲＮＡ转
录本的感染性比经过反向遗传技术改造后的３’末端具有３
或４个与病毒核苷酸序列无关的ＲＮＡ转录本要高ｌＯ倍。
刘欣玉等旧引利用反向遗传技术对ＪＥＶＳＡ４及ＳＡｌ４的神经
毒力进行了研究，ＳＡ４的氨基酸序列与ＳＡｌ４存在１７个位点
的差异。而ＳＡ４的神经毒力比ＳＡｌ４强，说明了这１７个差异
氨基酸位点口ｒ能影响着ＪＥＶ的神经毒力。而ＪＥＶ免疫逃逸、跨越血脑屏障及其跨种问传播与感染等分子机制的进一
步探索也离不开ＪＥＶ反向遗传技术平台。
４．２载体开发通过反向遗传技术可以将ＪＥＶ感染性克隆改造成ＲＮＡ型或ＤＮＡ型的复制子载体，这些载体在真核细胞乍物学研究巾广泛应用．是表达外源基因极有价值的遗传
学丁具。作为ＲＮＡ型病毒载体，外源基冈在体内有效表达
的载体系统是研究基因治疗和疫苗的重要策略，日前常用ＤＮＡ病毒载体、逆转录病毒载体或裸ＤＮＡ，而ＲＮＡ病毒载
体的应用则提供ｒ另一种研究途径。与常用的ＤＮＡ病毒载
体相比，ＲＮＡ病毒载体的基闪组小，构建和操作较为方便，其生命周期中不经历ＤＮＡ阶段，不会整合到宿主细胞染色体从而引起低水平表达或基因沉默，不会改变物种的遗传性。Ｓａｎｇ—ｌｍ等【６１将两个代表性的报告基因绿色荧光蛋白
（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）和荧光索酶（１ｕｃｉｆｅｃａｓｅ）插入
ＪＥＶ基因组ＲＮＡ后转染ＢＨＫ－２ｌ细胞，两个报告基因均得到
了表达。由此可知，ＪＥＶ感染性ｅＤＮＡ在表达外源基因时起
到了真核表达载体的作用。
４．３重组疫苗研发减毒己脑重组疫苗是经过定向操纵感染性ＪＥＶｅＤＮＡ克隆，从而产生孽组ＪＥＶ。如ＪＥＶ的Ｅ蛋白中的１个氨肇酸就是这样被证实为毒力相关位点，当ＪＥＶ的Ｅ—１３８位点谷氨腋突变为赖氨酸时，突变株的毒力比原毒株减弱¨…。嵌合疫苗是在ＪＥＶ基因组感染性克隆基础卜，将不同病毒抗原基因嵌合在一起，使之在体内产生有感染性的病毒粒子。因此，反向遗传技术为ＪＥＶ的相关研究提供了有利的生物学工具。
总之，反向遗传技术是研究病毒分子机制和遗传学原理的技术平台，本综述概述了ＪＥＶ反向遗传技术的研究状况、限制因素及其在基础研究等领域巾的应用。如何构建稳定的全长ｅＤＮＡ仍是ＪＥＶ反向遗传技术尚待解决的核心问题。尽管ＪＥＶ感染性ＲＮＡ可以通过全长ｃＤＮＡ克隆获得，但是当ｅＤＮＡ克隆在宿主细胞中复制时容易引入突变。而体外连接获得的全长ｅＤＮＡ模板在遗传学七具有稳定性，但是体外连接方法费时、费力，实际应用价值不大。已有研究丁作表明，选用ＢＡＣｓ、ｐＡＣＮＲｌｌ８０质粒等中低拷Ｄ！载体是解决黄病毒全长ｅＤＮＡ在细荫体内潜在毒性和不稳定性的重要策略之一。而这对于构建ＪＥＶ感染性全长ｅＤＮＡ克隆具有一定的借鉴意义。
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