中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期生理生化・４５・
牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定
苑学ｈ２。邢欣１，龙淼１，逄晓阳１．ｖ，刘国文１，孙国权２，王哲１
（１．吉林大学畜牧兽医学院，长春１３００６２；２．内蒙古民族大学动物科技学院，通辽０２８０４２；
３．吉林省产品质量监督检验院，长春
１３００２２）
摘要：在牛瘤胃中，牛链球菌的数量和发酵类型直接影响瘤胃的正常生理活动，同时牛链球菌发酵产生的乳酸和其内存在的各种酶在实际的工业生产中具有重要的价值。本试验从新采集的牛瘤胃液中分离得到菌株，用微量生化反应管和１６ＳｒＲＮＡ技术分别对菌株的生化及遗传特性进行鉴定，结合革兰氏染色和形态学观察结果判定所分离的菌株即为牛链球菌，为更好地研究和改造该菌奠定了理论和试验基础。
关键词：牛链球菌；分离鉴定；１６ＳｒＲＮＡ中图分类号：ｓ８５２．６１＋１
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７１—７２３６（２００９）０５一００４５一０４
牛链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓ）是瘤胃内一种常见的革兰氏阳性乳酸生成菌，是瘤胃正常的菌群，
２００２）。其还可以产生较稳定的脲酶，且活性相当高，在瘤胃内非蛋白氮的分解中起重要作用（ＭｕｒｉｅｌＳａｌｅｓ—Ｄｕｒａｌ等，２００１）。此外在许多提高瘤胃功能的微生态制剂中，均有牛链球菌及其发酵产物参与
（张名爱等，２００７）。
兼性厌氧（Ｋｒａｕｓｅ等，１９９６；Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。牛链球菌可以将易发酵的饲料分解为ｎ乳酸和Ｌ－乳酸，Ｌ－￥Ｌ酸吸收后可迅速转化成丙酮酸氧化利用；而Ｄ－￥Ｌ酸则代谢缓慢，当其汇聚量超过肝脏的代谢功能时，即导致代谢性酸中毒（安娟，２００７）。因此调控瘤胃微生物发酵生成Ｌ一乳酸，对缓解代谢性酸中毒有着积极的意义。而这其中的关键是分离、筛选出具有利用淀粉作为底物生成乳酸的菌株，且在不干扰瘤胃正常的微生物发酵基础上将其改造成ｎ乳酸生成缺陷菌，有助于预防和治疗瘤胃酸中毒。国外还有人用免疫接种牛链球菌来降低绵羊瘤胃酸中毒的风险，并获得了成功（Ｓｈｕ等，２０００）。另外，利用牛链球菌可以分解淀粉成Ｌ一乳酸，且产率和纯度较高，这一特点可以用其来生产大量高纯度的Ｌ－乳酸，进而合成聚乳酸应用于工业生产（Ｓａｎｇ等，
收稿日期：２００８—１ｌ一１２
作者简介：苑学（１９６３一）．男，内蒙古人，副教授。主要从事动物
医学研究。
通信作者：刘国文（１９７３一），男，副教授，硕导，主要从事动物营
养代谢病研究。
基金项目：国家自然科学基金（３０６００４４１）。
牛链球菌的分离鉴定可为其在体内外对乳酸代谢及瘤胃微生物发酵影响的研究奠定基础，并对瘤胃酸中毒的预防和治疗提供理论保证。１材料与方法
１．１材料专性厌氧球菌营养液，厌氧血琼脂ＶＳ培养基（未加抗生素）（熊德鑫，１９８６），ＬＢ固体培养基，ＬＢ液体培养基（陈天寿等，１９８７），生化反应管（３１种），ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰｓＭｉｘｔｕｒｅ，５ｒａｇ／ｍＩ，ＥＢ，ＰＭＤｌ８－Ｔ载体，感受态细胞（自备）。ＤＮＡ回收试剂盒、ＤＮＡ小量制备试剂盒；溶菌酶、蛋白酶Ｋ、ＳＤＳ、溴酚蓝、Ｔｒｉｓ碱、ＥＢ、琼脂糖、ＥＤＴＡ等；常用化学药品为国产分析纯；ＰＣＲ试验所用试剂按照于鸿玲等（２００６）配制。
１．２仪器８５２一Ａ型厌氧罐、厌氧产气袋、ＺＦ型紫外投射反射分析仪、ＰＣＲ仪、高速冷冻离心机、可调式温水水浴箱、ＣＯ。培养箱、超低温冰柜、酸度计、试管、试管塞、玻璃瓶等。
１．３
方法
ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｅｖｅｒｙ
ｄａｙｆｏｒ１６ｗｅｅｋｓ。ｔｈｅｎｄｒｉｎｋｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄｗａｔｅｒｆｏｒａｎｏｔｈｅｒ２ｗｅｅｋｓ．Ａｔ１８ｔｈｗｅｅｋ，ｔｈｅ
ｒａｔｓｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄ．
Ｍｉｃｒｏｖａｓｅｕｌａｒｄｅｎｓｉｔｙ（ＭＶＤ）ａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙ
ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｍｏｄｅｌ
ＭＶＤａｎｄＶＥＧＦｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅＳＥＭｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ
ｒａｔ
ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＩｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＳＥＭｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｅ
ｈｅｐａｔｏｍａ．Ｔｈｅ
ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｏｆＶＥＧＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｉｇｈｔｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｄｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｅｈｅｄｍａｌｔｔｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ；ｒａｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ；ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
万方数据
・４６・生理生化１．３．１瘤胃液的采集用导胃管从健康奶牛导出
瘤胃液，装入无菌烧瓶中，密封，３７℃保温，立即送入实验室。用４层滤网（１８０目）过滤后通５ｍｉｎＣＯ：，使之饱和，４℃３００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除饲料颗粒、纤毛虫等。吸取上清用埃氏巨型球菌营养液冲洗２次，每次４℃，２３００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将瘤胃菌液收集入１５０ｍＩ。营养液的三角烧瓶中，于３７℃的温箱内厌氧环境培养４８ｈ进行增菌（李涤生等，１９８３）。
１．３．２
细菌的分离培养和形态学及生化反应鉴定
将配制好的厌氧血琼脂放置在无菌操作台上，用无菌枪头吸取摇匀的瘤胃液５０肛Ｌ，用涂布棒涂匀，放人厌氧培养罐内，加入厌氧产气袋，密闭，置于３７℃进行厌氧培养，经过反复分离纯培养从培养基上得到单菌落接种于专性厌氧液体培养基内，同样培养４８ｈ，根据其生物学性状、染色特点、生化反应进行初步鉴定（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。１．３．３细菌的分子生物学鉴定
１．３．３．１
染色体基因组ＤＮＡ提取
取对数生长
的液体培养基内的菌液２ｍＬ，用细菌基因组ＤＮＡ小量制备试剂盒提取细菌ＤＮＡ。操作按照小量细菌基因组ＤＮＡ制备试剂盒操作说明书进行（奥斯伯等，１９９８；萨姆布鲁克等，２００２）。
１．３．３．２
ＰＣＲ扩增
以提取的细菌染色体基因组
为模板，根据ＧｅｎＢａｎｋ中埃氏巨型球菌（ＡＹｌ９６９１９）的１６ＳｒＲＮＡ序列，设计、合成如下的引物序列：上游引物Ｐ１：５’一ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ—ＧＧ一３’；下游引物Ｐ２：５’一ＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧ—
ＴＡＴＣＴＡＡＴ一３７，ＰＣＲ预计扩增目的片段大小为
８０５
ｂｐ。ＰＣＲ反应体系为２５弘Ｌ，灭菌三蒸水１７．３
ｐＬ，Ｐ１、Ｐ２引物各１弘Ｌ，基因组模板１耻Ｌ，１０×
Ｔａｑ—ｂｕｆｆｅｒ２．５肛Ｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２／－ｔＬ，Ｅｘ
Ｔａｑ酶０．２弘Ｌ。扩增条件：９４℃预变性５
ｍｉｎ；９４
℃变性４５ｓ，３３℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０次循环；７２℃延伸１０
ｍｉｎ。
１．３．３．３
扩增产物电泳分析、回收取ＰＣＲ扩增
产物在１％琼脂糖凝胶用６０Ｖ电泳１５ｍｉｎ，紫外灯下观察电泳结果，对于目的片段用凝胶回收试剂盒回收。
１．３．３．４
ＰＣＲ产物的连接和转化将回收的ＰＣＲ
产物与ｐＭＤｌ８一Ｔ载体连接，１６℃连接过夜。将连接产物与大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞轻轻混匀，在
万方数据
中国畜牧兽医
２００９年第３６卷第５期
冰水中放置４５ｍｉｎ后，４２℃热激２ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ，加入２００ｌｕＬ无菌ＬＢ培养基，混匀后３７℃摇床培养１ｈ．然后将菌液均匀涂布在含Ａｍｐ的ＬＢ琼脂平板上，３７℃倒置培养１２～１６ｈ。在含Ａｍｐ的ＬＢ平板上挑取单个菌落接种到５ｍＬ的ＬＢ液体培养基（含Ａｍｐ的量）上，在３７℃恒温震荡培养
１２～１６ｈ。
１．３．３．５
重组质粒的扩增与测序用质粒ＤＮＡ
小剂量纯化试剂盒提取重组质粒，电泳观察提取结果。ＰＣＲ扩增重组质粒，电泳观察并送到ＴａＫａＰａ公司测序，由ＤＮＡｓｉｓ软件分析测序结果。根据测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ上利用ＢＬＡＳＴ进行序列的同源性分析。２试验结果
２．１
细菌的形态和培养特性在厌氧血琼脂培养
基上，菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑、凸起，直径
０．５～ｌＩｔｌｍ，专性厌氧液体培养物中细菌以长链为
主。由图１可见，目的菌株革兰氏染色为阳性，细菌
常以单个或成对存在、短链状。１０℃环境下，６．５％ＮａＣｌ培养液和ｐＨ为９．６或０．１％的美兰牛奶中均不生长；在４０％胆汁培养基中生长；４５℃环境下生长，耐热，６０℃３０ｍｉｎ仍具有活性。
图ｌ
链球菌形态学观察结果
２．２
细茵的生化鉴定由表１可知，目的菌能发酵
葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、柳醇、棉籽糖，但不能发酵鼠李糖、蕈糖和菊糖；能水解淀粉．能发酵甘露醇，不能发酵山梨醇、赤藓醇、肌
醇、侧金盏花醇、苦杏ｆ＿：苷、水杨苷、七叶苷、尿素、靛基质，不能液化明胶，能从硝酸盐生成亚硝酸盐，胆
汁能刺激其生长。
中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期生理生化・４７・
结果＋
————
一—－一
２．３
ＰＣＲ扩增结果由图２可知，扩增片段大小在８０５ｂｐ左右，是所需要片段。
２．４
１６ＳｒＲＮＡ序列测定结果
牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因的测序结果已提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，其
登录的序列号为曲Ｉ
ＡＦｌ０４１０９．１
ＡＦｌ０４１０９。本
试验得到的序列经ＢＬＡＳＴ对ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库进行同源性分析。与已报道的牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列相比，其同源性达９９％，因此可以鉴定为牛
链球菌。
图２链球菌的ＰＣＲ扩增结果
注：１为ＤＬ一２０００
ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ
２、３为菌株ＰＣＲ扩增结果。
３讨论
牛链球菌是革兰氏阳性链球菌属的一种，主要存在于反刍动物的瘤胃内，是参与瘤胃发酵的重要瘤胃微生物之一，对反刍动物乳酸的生成起重要作用。它可以将谷类饲料（主要富含碳水化合物）迅速发酵Ｄ－￥Ｌ酸和Ｌ－乳酸。其中不易被代谢的Ｄ乳酸是引发代谢性酸中毒主要物质；而Ｌ－￥Ｌ酸一方面可以很快被代谢不会造成酸中毒，另一方面其及其聚随着奶牛业的快速发展，瘤胃酸中毒在奶牛饲万方数据
突然死亡综合征等（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。此外，由于近年来利用微生物生产高纯度的Ｌ＿乳酸成为国
际的研究热点，但是自然界中能生产Ｌ一乳酸的微生物极少。随着基因工程的飞速发展和广泛应用，利用基因工程的方法构建Ｌ厂乳酸高产菌株成为人们研究的焦点。天然的大肠杆菌没有Ｌ一乳酸脱氢酶，没有Ｌ一乳酸产生。许多研究人员将表达牛链球菌Ｌ一乳酸脱氢酶基因的质粒转化到大肠杆菌菌株中，期望在大肠杆菌中建立新的Ｌ－乳酸代谢途径（张黎等，２００５）。为此，分离筛选出对乳酸生成具有重要意义的菌株一牛链球菌，并通过生物化学手段将其改造成Ｄ－￥Ｌ酸生成关键酶基因缺失Ｔ程菌，从而减弱其生成胁乳酸的能力，对纠正或缓解奶牛乳酸酸中毒具有重要意义；并且可以通过基因工程方法将牛链球菌的Ｌ一乳酸脱氢酶基因转入其它菌株中，转化葡萄糖生产Ｌ一乳酸，从而对生产高纯度的Ｌ－￥Ｌ酸产
生深远的影响。
本试验在对目的菌进行体外培养过程中，选用了专性厌氧细菌培养基一ＶＳ厌氧血琼脂培养基作为分离和纯培养的特异性固体培养基，并加入了能够刺激目的菌生长的吐温一８０（于鸿玲等。２００６），这些
改进增加了培养基对目的菌的选择性。牛链球菌的生物学性状表现为菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑，凸起，兼性厌氧，再结合生化特性观察结果，可以初步判定牛链球菌。
以往对微生物的认识基于对微生物的培养和纯种分离技术，而在自然环境中的微生物９２％～９８％的种类至今尚是不可培养的，成为正确认识微生物养技术的限制，对样品进行客观的分析，更精确地揭的日益完善，１６ＳｒＲＮＡ序列分析作为微生物系统ｒＲＮＡ的遗传保守性和其大小最适合
生态系的严重障碍。分子生态技术的应用克服了培示微生物种类和遗传的多样性。随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展．微生物核糖体数据库分类的主要依据已得到了广泛认同，该技术已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具（周煜，１９９９）。该技术利用微生物遗传信息中小亚基单位核糖体
ＲＮＡ的１６Ｓ合物还是工业生产重要的原料之一。
养中影响越来越明显，瘤胃酸中毒发生时，导致奶牛生长速度下降和饲料转化率降低，从而引起奶牛产奶量、乳脂率和体重下降等。瘤胃低ｐＨ和较高乳酸浓度持续数月甚至数年，还可导致瘤胃炎、瘤胃角质化、蹄叶炎、腹泻、瘤胃血管血栓、脑灰质软化症、
进行分析的特点（于鸿玲等，２００６），从微生物样本中
・４８・生理生化
中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期
提取１６ＳｒＲＮＡ的基因片段，通过克隆、测序或酶
６杨舒黎，王加启，ｈ噩攀．瘤胃微生物定量方法研究进展［Ｊ］．中
切、探针等手段获得１６ＳｒＲＮＡ的序列信息，再与
国畜牧兽医．２００７．３４（３）：５～８．
７陈天寿主编．微生物培养基的制造与应用ＥＭ］．北京：中国农业出
１６Ｓ
ｒＲＮＡ数据库中的序列数据或其它数据进行比
版社，１９８７．
较，确定其在进化树中的位置或属种，从而鉴定样本８周煜．１６Ｓ
ｒＲＮＡ序列分析法在医学微生物鉴定中的应用［Ｊ］．生
中可能存在的微生物种类。这些新的技术有助于更物技术通讯，１９９９，１０（４）：２９７
３０５．
好的理解瘤胃饲料利用的机制。
９段智勇．郭嫣秋，刘建新．现代分子生物学技术在瘤胃微生态系
一直以来牛链球菌被认为在饲喂富含淀粉的日统研究中的应用［Ｊ］．微生物学报，２００６（１）：１６６～１６９．
粮中占主导位置，但用实时定量ＰＣＲ研究结果表１０萨姆布鲁克Ｊ．ＤＷ拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南
（第ｉ版）［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．
明，在很多动物中，当日粮从稻草转换为谷物时牛１１奥斯伯Ｆ，布伦特Ｒ，ＲＥ金斯顿，等．精编分子生物学实验指南
链球菌不受影响。因此，利用这些新技术可以重［Ｍ］．北京：中国科学出版社。１９９８．
新确立不同微生物群体在瘤胃中的代谢机制，相１２熊德鑫，厌氧菌的分离和鉴定［Ｍ］．南昌：江西科学技术出版社，
信在未来的几十年瘤胃微生物学将有重大改变１９８６．（段智勇等，２００６）。根据以上技术的特点和优势，１３
ＫｒａｕｓｅＤ
Ｏ，ＲｕｓｓｅｌｌＪＢ．ＨＯＷｍａｎｙｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａ
ａｒｅ
ｔｈｅｒｅ．
本试验应用这些技术并得到了牛链球菌遗传信
Ｊ
Ｄａｉｒｙ
Ｓｃｉ，１９９６；７９（８）：１４６７～１４７５．
１４
ＭｕｒｉｅｌＳａｌｅｓ－Ｄｕｖａｌ。ＦｒａｎｃｏｉｓＬ，Ｇ６ｒａｒｄＢ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ
息，分离到了菌株，为更好的研究和改造牛链球菌ｏｆ
ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｂｏｒｉｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｌｏｎｅ
ｏｒ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅｖｏｔｅｌ—
奠定了基础。
ｌａａｌｂｅｎｓｉｓ，ｏｎｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｌ
Ｃａｓｅｉｎ
ｏｒＰｅａ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｅｒｏｂｅ，２００１。７（４）：１９９～２０８．
参
考
文
献
１５
ＳｈｕＱ，Ｈ
Ｓ
Ｇｉｌｌ，ＲＡ
Ｌｅｎｇ。ｅｔ
ａ１．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈ
ａ
ｓｔｒｅｐｔｏ—
１于鸿玲，李艳飞，逢晓阳，等．瘤胃反刍月形单胞菌的分离鉴定
ＣＯＣＣＵＳ
ｂｏｖｉｓｖａｃｃｉｎｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｂｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｒｏｕｔｅｓ
ａｇａｉｎｓｔｌａｅ—
［Ｊ３。中国兽医杂志，２００６（１１）：２５～２６．
ｔｉｃａｃｉｄｏｓｉｓｉｎｓｈｅｅｐ．ＴｈｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＪｏｕｒｎａｌ，２０００，１５９（３）：
２安娟．反刍动物发生瘤胃酸中毒的营养机制及其防治［Ｊ］．中国
２６２～２６９．饲料，２００７（２）：２３～２６．
１６
Ｂｕｃｈａｎａｎ
Ｒ
Ｅ，Ｇｉｂｂｏｎｓ
Ｎ
Ｅ．伯杰细菌鉴定手册（第八版）．北
３张名爱，崔春涛，郭绍聪．微生态制剂在奶牛生产中的应用［Ｊ］．
京：中国科学出版社，１９８４．
中国奶牛，２００７（１）：１５～１７．
１７Ｓａｎｇ
ＳＬ。］ｉｈ－ＴａｙＨｓｕ，Ｈｉｌｄｒｉｏ
Ｃ，ｅｔ
ａ１．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｏｖｉｃｉｎ
４张黎，韦宇拓，黄彦，等．牛链球菌Ｌ．（＋）一乳酸脱氢酶基因的克
ＨＣ５．ａｂａｃｔｅｒｉｏｅｉｎｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｂｏｖｉｓＨＣ５，ｏｎ
ｒｕｍｉｎａｌ
隆及在大肠杆菌中表达［Ｊ］．食品与发酵工业，２００５（９）：２４～２８．ｍｅｔｈａｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎ
ｖｉｔｒｏ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，
５李涤生，娆升．厌氧菌［Ｍ］．合肥：安徽科学技术出版社．１９８３．
２１７（１）：５１～５５，
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｆ，Ｐｐｆｏｃｏｃｃ“ｓＢｏｖｉｓ
ｉｎＣａｔｔｌｅＲｕｍｅｎＧａｓｔｒｉｃＪｕｉｃｅ
ＹＵＡＮＸｕｅｌ“，ＸＩＮＧＸｉｎｌ，ＬＯＮＧＭｉａ０１，ＰＡＮＧＸｉａｏ－ｙａｎｇａ”，ＬＩＵＧｕｏ－ｗｅｎｌ，ＳＵＮＧｕｏ－ｑｕａｎｚ，ＷＡＮＧＺｈｅｌ
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００６２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ０２８０４２，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｐｒｏｄｕｃｔ
ＱｕａｌｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｅｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｃａｔｔｌｅｒｕｍｅｎ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓａｎｄｔｈｅ
ｔｙｐｅ
ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｈａｖｅ
ａ
ｄｉｒｅｃｔｅｆｆｅｃｔ
ｏｎ
ｒｕｍｉｎａｌ
ｎｏｒｍａｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｔｈｅｍｅａｎｔｉｍｅ，ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｗｈｉｃｈｉｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓ’ｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｎｄａｌｌｋｉｎｄｓ
ｏｆｅｎｚｙｍｅｓｗｈｉｃｈｅｘｉｓｔｉｎＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓｈａｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｖａｌｕｅｓｉｎｐｒａｃｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｔｅｓｔ，ａｕｔｈｏｒｉｓｏｌａ—
ｔｅｄｓｔｒａｉｎ
ｆｒｏｍ
ｒｕｍｉｎａｌｆｌｕｉｄｓ，ａｎｄｕｓｅｄｔｈｅｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｅｖｅｎｔ
ｒｅａｃｔｏｎｓ
ａｎｄｔｈｅ１６ＳｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｔｏｉ—
ｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｉｎｈｅｒｉｔｅｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｉｎｄｉｎｇ
ｔＯ
ｔｈｅｖｉｅｗｉｎｇｒｅｓｕｌｔｏｆｇｒａｍ
ｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｕｔｈｏｒａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｗａｓＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇｔｈｅｔｈｅｏｒｙａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｂｏｖｉｓｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓＩｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；１６ＳｒＲＮＡ
万方数据
中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期生理生化・４５・
牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定
苑学ｈ２。邢欣１，龙淼１，逄晓阳１．ｖ，刘国文１，孙国权２，王哲１
（１．吉林大学畜牧兽医学院，长春１３００６２；２．内蒙古民族大学动物科技学院，通辽０２８０４２；
３．吉林省产品质量监督检验院，长春
１３００２２）
摘要：在牛瘤胃中，牛链球菌的数量和发酵类型直接影响瘤胃的正常生理活动，同时牛链球菌发酵产生的乳酸和其内存在的各种酶在实际的工业生产中具有重要的价值。本试验从新采集的牛瘤胃液中分离得到菌株，用微量生化反应管和１６ＳｒＲＮＡ技术分别对菌株的生化及遗传特性进行鉴定，结合革兰氏染色和形态学观察结果判定所分离的菌株即为牛链球菌，为更好地研究和改造该菌奠定了理论和试验基础。
关键词：牛链球菌；分离鉴定；１６ＳｒＲＮＡ中图分类号：ｓ８５２．６１＋１
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７１—７２３６（２００９）０５一００４５一０４
牛链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓ）是瘤胃内一种常见的革兰氏阳性乳酸生成菌，是瘤胃正常的菌群，
２００２）。其还可以产生较稳定的脲酶，且活性相当高，在瘤胃内非蛋白氮的分解中起重要作用（ＭｕｒｉｅｌＳａｌｅｓ—Ｄｕｒａｌ等，２００１）。此外在许多提高瘤胃功能的微生态制剂中，均有牛链球菌及其发酵产物参与
（张名爱等，２００７）。
兼性厌氧（Ｋｒａｕｓｅ等，１９９６；Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。牛链球菌可以将易发酵的饲料分解为ｎ乳酸和Ｌ－乳酸，Ｌ－￥Ｌ酸吸收后可迅速转化成丙酮酸氧化利用；而Ｄ－￥Ｌ酸则代谢缓慢，当其汇聚量超过肝脏的代谢功能时，即导致代谢性酸中毒（安娟，２００７）。因此调控瘤胃微生物发酵生成Ｌ一乳酸，对缓解代谢性酸中毒有着积极的意义。而这其中的关键是分离、筛选出具有利用淀粉作为底物生成乳酸的菌株，且在不干扰瘤胃正常的微生物发酵基础上将其改造成ｎ乳酸生成缺陷菌，有助于预防和治疗瘤胃酸中毒。国外还有人用免疫接种牛链球菌来降低绵羊瘤胃酸中毒的风险，并获得了成功（Ｓｈｕ等，２０００）。另外，利用牛链球菌可以分解淀粉成Ｌ一乳酸，且产率和纯度较高，这一特点可以用其来生产大量高纯度的Ｌ－乳酸，进而合成聚乳酸应用于工业生产（Ｓａｎｇ等，
收稿日期：２００８—１ｌ一１２
作者简介：苑学（１９６３一）．男，内蒙古人，副教授。主要从事动物
医学研究。
通信作者：刘国文（１９７３一），男，副教授，硕导，主要从事动物营
养代谢病研究。
基金项目：国家自然科学基金（３０６００４４１）。
牛链球菌的分离鉴定可为其在体内外对乳酸代谢及瘤胃微生物发酵影响的研究奠定基础，并对瘤胃酸中毒的预防和治疗提供理论保证。１材料与方法
１．１材料专性厌氧球菌营养液，厌氧血琼脂ＶＳ培养基（未加抗生素）（熊德鑫，１９８６），ＬＢ固体培养基，ＬＢ液体培养基（陈天寿等，１９８７），生化反应管（３１种），ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰｓＭｉｘｔｕｒｅ，５ｒａｇ／ｍＩ，ＥＢ，ＰＭＤｌ８－Ｔ载体，感受态细胞（自备）。ＤＮＡ回收试剂盒、ＤＮＡ小量制备试剂盒；溶菌酶、蛋白酶Ｋ、ＳＤＳ、溴酚蓝、Ｔｒｉｓ碱、ＥＢ、琼脂糖、ＥＤＴＡ等；常用化学药品为国产分析纯；ＰＣＲ试验所用试剂按照于鸿玲等（２００６）配制。
１．２仪器８５２一Ａ型厌氧罐、厌氧产气袋、ＺＦ型紫外投射反射分析仪、ＰＣＲ仪、高速冷冻离心机、可调式温水水浴箱、ＣＯ。培养箱、超低温冰柜、酸度计、试管、试管塞、玻璃瓶等。
１．３
方法
ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｅｖｅｒｙ
ｄａｙｆｏｒ１６ｗｅｅｋｓ。ｔｈｅｎｄｒｉｎｋｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄｗａｔｅｒｆｏｒａｎｏｔｈｅｒ２ｗｅｅｋｓ．Ａｔ１８ｔｈｗｅｅｋ，ｔｈｅ
ｒａｔｓｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄ．
Ｍｉｃｒｏｖａｓｅｕｌａｒｄｅｎｓｉｔｙ（ＭＶＤ）ａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙ
ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｍｏｄｅｌ
ＭＶＤａｎｄＶＥＧＦｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅＳＥＭｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ
ｒａｔ
ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＩｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＳＥＭｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｅ
ｈｅｐａｔｏｍａ．Ｔｈｅ
ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｏｆＶＥＧＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｉｇｈｔｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｄｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｅｈｅｄｍａｌｔｔｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ；ｒａｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ；ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
万方数据
・４６・生理生化１．３．１瘤胃液的采集用导胃管从健康奶牛导出
瘤胃液，装入无菌烧瓶中，密封，３７℃保温，立即送入实验室。用４层滤网（１８０目）过滤后通５ｍｉｎＣＯ：，使之饱和，４℃３００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除饲料颗粒、纤毛虫等。吸取上清用埃氏巨型球菌营养液冲洗２次，每次４℃，２３００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将瘤胃菌液收集入１５０ｍＩ。营养液的三角烧瓶中，于３７℃的温箱内厌氧环境培养４８ｈ进行增菌（李涤生等，１９８３）。
１．３．２
细菌的分离培养和形态学及生化反应鉴定
将配制好的厌氧血琼脂放置在无菌操作台上，用无菌枪头吸取摇匀的瘤胃液５０肛Ｌ，用涂布棒涂匀，放人厌氧培养罐内，加入厌氧产气袋，密闭，置于３７℃进行厌氧培养，经过反复分离纯培养从培养基上得到单菌落接种于专性厌氧液体培养基内，同样培养４８ｈ，根据其生物学性状、染色特点、生化反应进行初步鉴定（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。１．３．３细菌的分子生物学鉴定
１．３．３．１
染色体基因组ＤＮＡ提取
取对数生长
的液体培养基内的菌液２ｍＬ，用细菌基因组ＤＮＡ小量制备试剂盒提取细菌ＤＮＡ。操作按照小量细菌基因组ＤＮＡ制备试剂盒操作说明书进行（奥斯伯等，１９９８；萨姆布鲁克等，２００２）。
１．３．３．２
ＰＣＲ扩增
以提取的细菌染色体基因组
为模板，根据ＧｅｎＢａｎｋ中埃氏巨型球菌（ＡＹｌ９６９１９）的１６ＳｒＲＮＡ序列，设计、合成如下的引物序列：上游引物Ｐ１：５’一ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ—ＧＧ一３’；下游引物Ｐ２：５’一ＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧ—
ＴＡＴＣＴＡＡＴ一３７，ＰＣＲ预计扩增目的片段大小为
８０５
ｂｐ。ＰＣＲ反应体系为２５弘Ｌ，灭菌三蒸水１７．３
ｐＬ，Ｐ１、Ｐ２引物各１弘Ｌ，基因组模板１耻Ｌ，１０×
Ｔａｑ—ｂｕｆｆｅｒ２．５肛Ｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２／－ｔＬ，Ｅｘ
Ｔａｑ酶０．２弘Ｌ。扩增条件：９４℃预变性５
ｍｉｎ；９４
℃变性４５ｓ，３３℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０次循环；７２℃延伸１０
ｍｉｎ。
１．３．３．３
扩增产物电泳分析、回收取ＰＣＲ扩增
产物在１％琼脂糖凝胶用６０Ｖ电泳１５ｍｉｎ，紫外灯下观察电泳结果，对于目的片段用凝胶回收试剂盒回收。
１．３．３．４
ＰＣＲ产物的连接和转化将回收的ＰＣＲ
产物与ｐＭＤｌ８一Ｔ载体连接，１６℃连接过夜。将连接产物与大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞轻轻混匀，在
万方数据
中国畜牧兽医
２００９年第３６卷第５期
冰水中放置４５ｍｉｎ后，４２℃热激２ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ，加入２００ｌｕＬ无菌ＬＢ培养基，混匀后３７℃摇床培养１ｈ．然后将菌液均匀涂布在含Ａｍｐ的ＬＢ琼脂平板上，３７℃倒置培养１２～１６ｈ。在含Ａｍｐ的ＬＢ平板上挑取单个菌落接种到５ｍＬ的ＬＢ液体培养基（含Ａｍｐ的量）上，在３７℃恒温震荡培养
１２～１６ｈ。
１．３．３．５
重组质粒的扩增与测序用质粒ＤＮＡ
小剂量纯化试剂盒提取重组质粒，电泳观察提取结果。ＰＣＲ扩增重组质粒，电泳观察并送到ＴａＫａＰａ公司测序，由ＤＮＡｓｉｓ软件分析测序结果。根据测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ上利用ＢＬＡＳＴ进行序列的同源性分析。２试验结果
２．１
细菌的形态和培养特性在厌氧血琼脂培养
基上，菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑、凸起，直径
０．５～ｌＩｔｌｍ，专性厌氧液体培养物中细菌以长链为
主。由图１可见，目的菌株革兰氏染色为阳性，细菌
常以单个或成对存在、短链状。１０℃环境下，６．５％ＮａＣｌ培养液和ｐＨ为９．６或０．１％的美兰牛奶中均不生长；在４０％胆汁培养基中生长；４５℃环境下生长，耐热，６０℃３０ｍｉｎ仍具有活性。
图ｌ
链球菌形态学观察结果
２．２
细茵的生化鉴定由表１可知，目的菌能发酵
葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、柳醇、棉籽糖，但不能发酵鼠李糖、蕈糖和菊糖；能水解淀粉．能发酵甘露醇，不能发酵山梨醇、赤藓醇、肌
醇、侧金盏花醇、苦杏ｆ＿：苷、水杨苷、七叶苷、尿素、靛基质，不能液化明胶，能从硝酸盐生成亚硝酸盐，胆
汁能刺激其生长。
中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期生理生化・４７・
结果＋
————
一—－一
２．３
ＰＣＲ扩增结果由图２可知，扩增片段大小在８０５ｂｐ左右，是所需要片段。
２．４
１６ＳｒＲＮＡ序列测定结果
牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因的测序结果已提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，其
登录的序列号为曲Ｉ
ＡＦｌ０４１０９．１
ＡＦｌ０４１０９。本
试验得到的序列经ＢＬＡＳＴ对ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库进行同源性分析。与已报道的牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列相比，其同源性达９９％，因此可以鉴定为牛
链球菌。
图２链球菌的ＰＣＲ扩增结果
注：１为ＤＬ一２０００
ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ
２、３为菌株ＰＣＲ扩增结果。
３讨论
牛链球菌是革兰氏阳性链球菌属的一种，主要存在于反刍动物的瘤胃内，是参与瘤胃发酵的重要瘤胃微生物之一，对反刍动物乳酸的生成起重要作用。它可以将谷类饲料（主要富含碳水化合物）迅速发酵Ｄ－￥Ｌ酸和Ｌ－乳酸。其中不易被代谢的Ｄ乳酸是引发代谢性酸中毒主要物质；而Ｌ－￥Ｌ酸一方面可以很快被代谢不会造成酸中毒，另一方面其及其聚随着奶牛业的快速发展，瘤胃酸中毒在奶牛饲万方数据
突然死亡综合征等（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。此外，由于近年来利用微生物生产高纯度的Ｌ＿乳酸成为国
际的研究热点，但是自然界中能生产Ｌ一乳酸的微生物极少。随着基因工程的飞速发展和广泛应用，利用基因工程的方法构建Ｌ厂乳酸高产菌株成为人们研究的焦点。天然的大肠杆菌没有Ｌ一乳酸脱氢酶，没有Ｌ一乳酸产生。许多研究人员将表达牛链球菌Ｌ一乳酸脱氢酶基因的质粒转化到大肠杆菌菌株中，期望在大肠杆菌中建立新的Ｌ－乳酸代谢途径（张黎等，２００５）。为此，分离筛选出对乳酸生成具有重要意义的菌株一牛链球菌，并通过生物化学手段将其改造成Ｄ－￥Ｌ酸生成关键酶基因缺失Ｔ程菌，从而减弱其生成胁乳酸的能力，对纠正或缓解奶牛乳酸酸中毒具有重要意义；并且可以通过基因工程方法将牛链球菌的Ｌ一乳酸脱氢酶基因转入其它菌株中，转化葡萄糖生产Ｌ一乳酸，从而对生产高纯度的Ｌ－￥Ｌ酸产
生深远的影响。
本试验在对目的菌进行体外培养过程中，选用了专性厌氧细菌培养基一ＶＳ厌氧血琼脂培养基作为分离和纯培养的特异性固体培养基，并加入了能够刺激目的菌生长的吐温一８０（于鸿玲等。２００６），这些
改进增加了培养基对目的菌的选择性。牛链球菌的生物学性状表现为菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑，凸起，兼性厌氧，再结合生化特性观察结果，可以初步判定牛链球菌。
以往对微生物的认识基于对微生物的培养和纯种分离技术，而在自然环境中的微生物９２％～９８％的种类至今尚是不可培养的，成为正确认识微生物养技术的限制，对样品进行客观的分析，更精确地揭的日益完善，１６ＳｒＲＮＡ序列分析作为微生物系统ｒＲＮＡ的遗传保守性和其大小最适合
生态系的严重障碍。分子生态技术的应用克服了培示微生物种类和遗传的多样性。随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展．微生物核糖体数据库分类的主要依据已得到了广泛认同，该技术已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具（周煜，１９９９）。该技术利用微生物遗传信息中小亚基单位核糖体
ＲＮＡ的１６Ｓ合物还是工业生产重要的原料之一。
养中影响越来越明显，瘤胃酸中毒发生时，导致奶牛生长速度下降和饲料转化率降低，从而引起奶牛产奶量、乳脂率和体重下降等。瘤胃低ｐＨ和较高乳酸浓度持续数月甚至数年，还可导致瘤胃炎、瘤胃角质化、蹄叶炎、腹泻、瘤胃血管血栓、脑灰质软化症、
进行分析的特点（于鸿玲等，２００６），从微生物样本中
・４８・生理生化
中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期
提取１６ＳｒＲＮＡ的基因片段，通过克隆、测序或酶
６杨舒黎，王加启，ｈ噩攀．瘤胃微生物定量方法研究进展［Ｊ］．中
切、探针等手段获得１６ＳｒＲＮＡ的序列信息，再与
国畜牧兽医．２００７．３４（３）：５～８．
７陈天寿主编．微生物培养基的制造与应用ＥＭ］．北京：中国农业出
１６Ｓ
ｒＲＮＡ数据库中的序列数据或其它数据进行比
版社，１９８７．
较，确定其在进化树中的位置或属种，从而鉴定样本８周煜．１６Ｓ
ｒＲＮＡ序列分析法在医学微生物鉴定中的应用［Ｊ］．生
中可能存在的微生物种类。这些新的技术有助于更物技术通讯，１９９９，１０（４）：２９７
３０５．
好的理解瘤胃饲料利用的机制。
９段智勇．郭嫣秋，刘建新．现代分子生物学技术在瘤胃微生态系
一直以来牛链球菌被认为在饲喂富含淀粉的日统研究中的应用［Ｊ］．微生物学报，２００６（１）：１６６～１６９．
粮中占主导位置，但用实时定量ＰＣＲ研究结果表１０萨姆布鲁克Ｊ．ＤＷ拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南
（第ｉ版）［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．
明，在很多动物中，当日粮从稻草转换为谷物时牛１１奥斯伯Ｆ，布伦特Ｒ，ＲＥ金斯顿，等．精编分子生物学实验指南
链球菌不受影响。因此，利用这些新技术可以重［Ｍ］．北京：中国科学出版社。１９９８．
新确立不同微生物群体在瘤胃中的代谢机制，相１２熊德鑫，厌氧菌的分离和鉴定［Ｍ］．南昌：江西科学技术出版社，
信在未来的几十年瘤胃微生物学将有重大改变１９８６．（段智勇等，２００６）。根据以上技术的特点和优势，１３
ＫｒａｕｓｅＤ
Ｏ，ＲｕｓｓｅｌｌＪＢ．ＨＯＷｍａｎｙｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａ
ａｒｅ
ｔｈｅｒｅ．
本试验应用这些技术并得到了牛链球菌遗传信
Ｊ
Ｄａｉｒｙ
Ｓｃｉ，１９９６；７９（８）：１４６７～１４７５．
１４
ＭｕｒｉｅｌＳａｌｅｓ－Ｄｕｖａｌ。ＦｒａｎｃｏｉｓＬ，Ｇ６ｒａｒｄＢ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ
息，分离到了菌株，为更好的研究和改造牛链球菌ｏｆ
ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｂｏｒｉｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｌｏｎｅ
ｏｒ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅｖｏｔｅｌ—
奠定了基础。
ｌａａｌｂｅｎｓｉｓ，ｏｎｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｌ
Ｃａｓｅｉｎ
ｏｒＰｅａ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｅｒｏｂｅ，２００１。７（４）：１９９～２０８．
参
考
文
献
１５
ＳｈｕＱ，Ｈ
Ｓ
Ｇｉｌｌ，ＲＡ
Ｌｅｎｇ。ｅｔ
ａ１．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈ
ａ
ｓｔｒｅｐｔｏ—
１于鸿玲，李艳飞，逢晓阳，等．瘤胃反刍月形单胞菌的分离鉴定
ＣＯＣＣＵＳ
ｂｏｖｉｓｖａｃｃｉｎｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｂｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｒｏｕｔｅｓ
ａｇａｉｎｓｔｌａｅ—
［Ｊ３。中国兽医杂志，２００６（１１）：２５～２６．
ｔｉｃａｃｉｄｏｓｉｓｉｎｓｈｅｅｐ．ＴｈｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＪｏｕｒｎａｌ，２０００，１５９（３）：
２安娟．反刍动物发生瘤胃酸中毒的营养机制及其防治［Ｊ］．中国
２６２～２６９．饲料，２００７（２）：２３～２６．
１６
Ｂｕｃｈａｎａｎ
Ｒ
Ｅ，Ｇｉｂｂｏｎｓ
Ｎ
Ｅ．伯杰细菌鉴定手册（第八版）．北
３张名爱，崔春涛，郭绍聪．微生态制剂在奶牛生产中的应用［Ｊ］．
京：中国科学出版社，１９８４．
中国奶牛，２００７（１）：１５～１７．
１７Ｓａｎｇ
ＳＬ。］ｉｈ－ＴａｙＨｓｕ，Ｈｉｌｄｒｉｏ
Ｃ，ｅｔ
ａ１．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｏｖｉｃｉｎ
４张黎，韦宇拓，黄彦，等．牛链球菌Ｌ．（＋）一乳酸脱氢酶基因的克
ＨＣ５．ａｂａｃｔｅｒｉｏｅｉｎｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｂｏｖｉｓＨＣ５，ｏｎ
ｒｕｍｉｎａｌ
隆及在大肠杆菌中表达［Ｊ］．食品与发酵工业，２００５（９）：２４～２８．ｍｅｔｈａｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎ
ｖｉｔｒｏ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，
５李涤生，娆升．厌氧菌［Ｍ］．合肥：安徽科学技术出版社．１９８３．
２１７（１）：５１～５５，
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｆ，Ｐｐｆｏｃｏｃｃ“ｓＢｏｖｉｓ
ｉｎＣａｔｔｌｅＲｕｍｅｎＧａｓｔｒｉｃＪｕｉｃｅ
ＹＵＡＮＸｕｅｌ“，ＸＩＮＧＸｉｎｌ，ＬＯＮＧＭｉａ０１，ＰＡＮＧＸｉａｏ－ｙａｎｇａ”，ＬＩＵＧｕｏ－ｗｅｎｌ，ＳＵＮＧｕｏ－ｑｕａｎｚ，ＷＡＮＧＺｈｅｌ
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００６２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ０２８０４２，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｐｒｏｄｕｃｔ
ＱｕａｌｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｅｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｃａｔｔｌｅｒｕｍｅｎ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓａｎｄｔｈｅ
ｔｙｐｅ
ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｈａｖｅ
ａ
ｄｉｒｅｃｔｅｆｆｅｃｔ
ｏｎ
ｒｕｍｉｎａｌ
ｎｏｒｍａｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｔｈｅｍｅａｎｔｉｍｅ，ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｗｈｉｃｈｉｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓ’ｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｎｄａｌｌｋｉｎｄｓ
ｏｆｅｎｚｙｍｅｓｗｈｉｃｈｅｘｉｓｔｉｎＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓｈａｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｖａｌｕｅｓｉｎｐｒａｃｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｔｅｓｔ，ａｕｔｈｏｒｉｓｏｌａ—
ｔｅｄｓｔｒａｉｎ
ｆｒｏｍ
ｒｕｍｉｎａｌｆｌｕｉｄｓ，ａｎｄｕｓｅｄｔｈｅｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｅｖｅｎｔ
ｒｅａｃｔｏｎｓ
ａｎｄｔｈｅ１６ＳｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｔｏｉ—
ｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｉｎｈｅｒｉｔｅｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｉｎｄｉｎｇ
ｔＯ
ｔｈｅｖｉｅｗｉｎｇｒｅｓｕｌｔｏｆｇｒａｍ
ｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｕｔｈｏｒａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｗａｓＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇｔｈｅｔｈｅｏｒｙａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｂｏｖｉｓｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｒｉｓＩｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；１６ＳｒＲＮＡ
万方数据