实验一 显微镜油镜的使用和细菌三种基本形态观察
二、基本原理
油镜是显微镜物镜中重要的镜头，其上刻有“OI ”或“HI ”字样，也有以刻一圈红线或白线为
标记，用于区别其它物镜。油镜的使用比较特殊，需在玻片与镜头之间加滴镜油，其原理如下：
1． 增加照明强度
油镜的放大倍数可达100×，其镜头焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。需在油
镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n=1.52），目的是使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失，基本上全进入镜头，因此提高了照明强度，使图像更加清晰。不同介质的折射率是不同的，用空气作介质，折射率为（n=1）; 用水作介质，折射率为（n =1.33），它们的折射率都比香柏油低，其光线通过玻片后会发生折射或全反射，不能完全进入物镜，造成光的损失，结果降低了视场亮度，使图像不清晰。由此可见，提高介质的折射率，就可提高图像的清晰度。
2． 增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离（D ）的能力。D 值愈小则表明分辨率愈强。
D 值可用如下下公式表示：
式中入=光波波长； N A=物镜的数值孔径值。
分辨率取决于物镜的数值孔径和光源波长，即显微镜分辨率与物镜的数值孔径成正比，与光波
波长成反比。波长愈短，数值孔径愈大，分辨距离愈短，则分辨能力就愈强。光学显微镜的光源不
可能超出可见光的波长范围（400～770nm ），虽然利用紫外线作光源可提高分辨率，但应用范围有限，只适用于显微镜摄影而不适用直接观察。数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，即指介质的折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可表示为：
式中n=物镜与标本间介质的折射率；a=镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成
的夹角 图1-1）。
图1-1 物镜的镜口角
影响数值孔径的因素之一是镜角口。式中a 为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和
焦距。当Sin （a/2）增到最大时，a/2=90°，就是说，进入透视镜的光线与光轴成90°角，这是不可能的，所以Sin(a/2)的最大值总是小于1。现在所用的油镜其a/2为60°左右。影响数值孔径的另一因素是介质的折射率，前面已说到，不同介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，香柏油的折射率为1.52，玻璃的折射率为1.55。因此，在物镜和玻片标本间加入香柏油作介质时，数值孔径就可以增大到1.2—1.4。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，假如数值孔径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的最小距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值孔径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离=0.552×
1.25=0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体。但是大部分细菌直径在0.5μm左右，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态及某些结构。
显微镜的总放大率是指物镜放大率和目镜放大率的乘积。但由于物镜和目镜搭配不同，其分辨
率也不同，例如，在总放大率相同情况下，采用数值孔径大的40×物镜和10×目镜相搭配，其分辨率就比数值孔径小的20×物镜和20×目镜相搭配的要高些，效果也更好。
三、实验器材
1. 标本：细菌三型玻片。
2. 试剂：香柏油、显微镜清洗液（酒精乙醚液）。
3. 器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸等。
四、操作步骤（用油镜观察细菌）
显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
1. 放置标本 将染色的细菌三型玻片置于镜台上。
2. 找合适的视野 先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移到视野中央。
3. 转换油镜 将油镜转到工作位置。
4. 调节聚光器与油镜数值孔径一致 只要将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大，此
时两者的数值孔径即达到一致。
5. 加香柏油 取香柏油1-2滴加到欲观察部位涂片上，从侧面注视然后将油镜转到工作位置，
下降镜筒或上升载物台，使油镜浸入香柏油中。必须十分注意，油镜头不能压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，否则不仅会压碎玻片，还易损坏镜头。
6. 调焦 左眼从油镜中观察，同时转动粗调节螺旋，缓慢地提升油镜调焦，至出现模糊的物
象时，再用细调节螺旋调节至物象清晰为止。如按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜下降不到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象。遇此情况，应重新操作。调焦时，应特别注意误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及玻片。
7. 观察 仔细观察细菌的三种基本形态。
8. 显微镜用毕后的处理 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，
再取擦镜纸蘸取酒精乙醚液，擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留物。最后将镜头转至“八”字形，并将载物台和聚光镜降至最低处，将显微镜放入镜箱。
五、注意事项
1. 油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切忌用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从
侧面注视，不要使油镜镜头压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，还应特别注意误将粗调节器向相反方向转动而损坏镜头和玻片。
2. 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。
实验二 细菌革兰氏染色和芽孢染色法
二、基本原理
1. 革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要鉴别染色法。1884年由丹麦病理学家C ·Gram 创立，用革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G ）和革兰氏阴性菌（G ）两大类。一般来说，芽孢杆菌与绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都是革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体，某些球菌和大多数致病性的无芽孢杆菌都是革兰氏阴性反应。
革兰氏染色法的基本步骤是先用结晶紫进行初染，再用碘液媒染（以增加染料与细菌的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的不溶于水的复合物，然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂(蓝紫色) 者为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色后而使细菌染上复染剂的颜色（红色）者则为革兰氏阴性菌。 +—
革兰氏染色法之所以能将细菌分为G 菌和G 菌，是由这两类细菌的细胞壁成分和结构不同所决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁中肽聚糖层较厚且交联度高，类脂含量少，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经复染后，仍保留初染剂的蓝紫色。而革兰氏阴性菌由于细胞璧中含有较高的类脂，而且肽聚糖层较薄，且交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物比较容易洗脱出来，结果是细菌被脱成无色，当用复染剂番红复染后，细菌就染成复染剂番红的红色。
2. 芽孢染色法
芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形，细菌能否形成
芽孢以及芽孢的形状、大小和在菌体内的位置都是鉴定细菌的重要依据。
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能是菌体着色而芽孢不
着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。
芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红, 在加热条件下，延长染色
时间促进标本着色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂如番红复染后，芽孢仍保留初染剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色，使芽孢和菌体形成鲜明的对比，因而更明显地衬托出芽孢，易于辨认。 +—
三、实验器材
1. 菌种: 大肠埃希氏菌（Escherichia coli ）, 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ），
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），丙酮丁醇梭菌。
2. 试剂： 草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液（附录Ⅰ）；5%孔雀绿
染色液，0.5%番红水溶液。
3. 器具： 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸、
吸水纸等。
五、注意事项
1. 革兰氏染色成败关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被误认为是革兰氏阴性
菌。如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。
2. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸干残水或用吹风机吹干，以免染色液被稀
释而影响染色效果。
3. 革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h 菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自
溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
4. 芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。巨大芽孢杆菌在37℃下
培养12-14h 效果最佳。
5. 在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。
实验三 放线菌和真菌的形态观察
二、基本原理 放线菌是能形成分枝菌丝体的一类革兰氏阳性菌，是产生抗生素的最重要的微生物。能否产生
菌丝体及菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内丝菌，基内丝菌向空气中生长出气生菌丝，气生菌丝进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。基丝较细透明，气丝较粗颜色较深，孢子丝有直、波曲、各种螺旋或轮生，孢子有球形，椭圆形，杆状或柱状，一般着生在孢子丝的顶端。孢子丝和孢子的形态和排列方式是分类的重要依据。
扦片法可观察到不同生长时期放线菌自然生长状态下的形态特征。是一种常用和有效的方法。
其主要原理是：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置载玻片上直接镜检，就可观察到放线菌在自然状态下着生的各种形态特征，也可用吕氏碱性美蓝染色后观察。
真菌主要包括酵母菌和霉菌。真菌大小通常比细菌大几倍甚至几十倍。酵母菌是不运动的单细胞真核生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖产生子囊孢子。而霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝（分生孢子梗），由繁殖菌丝产生分生孢子。霉菌的菌丝体尤其是繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
美蓝是一种无毒性的染料，它可用来观察酵母菌的形态和出芽方式，也可对酵母菌的死活细胞进行鉴别，它的氧化型呈蓝色，还原形呈无色，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母菌细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色。观察霉菌的形态主要有直接制片观察法和载片培养法。直接观察法是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染液中，制成霉菌玻片镜检。用此方法制片能使细胞不变形，具有防腐作用，不易干燥，保存时间较长，防止孢子飞散；染成蓝色增强反差，便于观察。载片培养法见微生物实验教程。
三、实验器材
1. 菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus ）5406，红酵母（Rhodotorula sP ）或酿酒
酵母（Sacchromyces cerevisiae ）, 产黄青梅（Penicillium chrysogenum ）, 黑曲霉（Aspergillus niger ）, 黑机霉（Rhizopus nigricans）, 总状毛霉（Mucor racemosds）。
2. 培养基：高氏1号琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基或查氏培养
基。
3. 试剂：0.1%美蓝染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%乙醇。
4. 器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、接种杯、解剖针等。
五、注意事项
1. 镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。
2. 染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖片时，过多染液会溢出，过少会出现大量气泡而影
响观察。
3. 挑菌和制片要细心，用镊子或解剖针小心将菌丝分开，要尽可能保持霉菌自然生长状态和
菌体的完整性。
实验四 微生物显微镜直接计数法
二、基本原理
利用血细胞计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）的数目，是一种常用的微生物
总菌数（包括死菌体和活菌体）的计数方法。它是有直观，简便和快捷等优点，常用于酵母、细菌、霉菌孢子等单细胞的微生物计数。但此法的缺点是所测的结果通常是死菌体和活菌体的总和，要克服这一缺点，此法可与美蓝等特殊染料染色相结合，也能达到分别计算活菌数和死菌数的目的。而间接（活菌）计数常用液体稀释法或平板菌落（因为样品中每个活细胞数能在平板培养基表面形成一个菌落）计数法两种，它们是以最大稀释率或平板菌落法间接获得样品中的活细胞（或孢子）数的一种计数法，其所测结果通常是活菌体。
利用血细胞计数板计数的原理是：将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。由于计数室的容积是固定的（0.1mm ），故可将显微镜下计得的菌体细胞或孢子数换算成单位体积试样中的含菌量。
血细胞计数板是一块特别的精密载玻片，在载玻片上有4条长槽将玻片中间区域分隔成3个平台，中间较宽的平台有被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数室构造如图（4-1、4-2）。计数室的刻度一般3
有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每个大方格中的小方格都是400个。每中格四周均有双线界限标志，以便区分。计数室大方格的边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm ，计数室与盖玻片间的高度为0.1mm ，所以计数室的体积为0.1mm 23（万分之一毫升）。计数时，先计得若干（一般为5个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中（0.1mm ）计数室中的总菌数，最好再换算成1ml 菌液中的总菌数，即再乘以10及菌液的稀释倍数，即可算出1ml 菌液中的总菌数。1ml=1cm=1000mm433 3
若要区分计数样品中的死菌和活菌值，则可采用微生物的活体染色法。活体染色法就是利用对微生物无毒性的染料（如美蓝、刚果红、中性红等染料）配成一定的浓度，再与一定量的菌液混合，经一段时间后，死菌和活菌会呈现出不同的颜色，这样便可在显微镜下区分活菌数与死菌数。
美蓝是常用的活体染色染料，当它处于氧化态时呈蓝色，还原态度时为无色。用它进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氧作用，美蓝接受氢后就由氧化态转变成还原态，因此活细胞呈现无色，而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，故细胞呈蓝色。
图 4-1 血细胞计数板正面与侧面图 图 4-2 中央大方格为计数室
4. 显微镜计数
先用低倍镜，找到计数室，并将计数室移至中央，转用高倍镜观察计数。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体计数，位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半时，可计为2个菌体。每个样品必须计数2个计数室中的平均含菌量值。
5. 计算方法
或16) ×10×稀释倍数 4
计数完毕，将血细胞计数板用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，再用吹风机吹干后放入计数板盒
中。
五、注意事项
1. 取样前，必须将菌悬液摇匀。
2. 计数室内不可有气泡
3. 凡压在中格线上的菌体，切莫四边全计，通常只计上方和右边两条线上的。
4. 计数时，遇出芽的酵母菌，芽体大小达到母细胞的一半时才计为2个。
实验五 显微测微尺的使用和微生物大小的测定
二、基本原理
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——显微测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺（图5－1) 是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm 等分为100格，每
格长0.01mm （即10µm ）。标尺的外围有一黑色的小环，以便在显微镜下寻找标尺位置，标尺的圆环上复有一圆形盖玻片以作保护。盖玻片是用树胶粘在在玻片上的，因此避免二甲苯与其接触。镜台测微尺是显微长度测量的标准，它并不被用来直接测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度，故其质量对所测结果影响极大。
目镜测微尺（图5－2) 是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分
为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
图5－1 镜台测微尺及中间部分的放大 图5－2 目镜测微尺
球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8μm，枯草芽胞杆菌大小为0.7～0.8 × 2～3µm 。
三、实验器材
1． 菌种： 红酵母48h 斜面培养物，
2． 器具： 显微镜、目镜测微尺，镜台测微尺，接种环，载玻片，盖玻片，等。
实验六 化学和物理因素对微生物的影响
二、基本原理：
微生物的生长繁殖是通过与外界环境进行物质和能量交换而实现的，环境条件的改变对微生物
的生长会造成不同程度的影响。环境因素从总体上可分为化学、物理和生物因素。
本实验主要通过化学、物理这两类环境因素对微生物影响的试验，了解微生物与其所处环境之
间的相互关系，使学生初步了解如何控制环境条件．使有益微生物正常生长、有害微生物受到抑制或被杀死，掌握微生物在环境中的分布规律，使微生物能更好地为人类所利用。
1、常用化学消毒剂及杀（抑）菌机理：
重金属离子：与菌体蛋白质结合而使之变性，或与酶蛋白的巯基相结合而使酶失活；
重金属盐：是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生螯合作用而使之变为无效化合物；
有机溶剂(酚、醇、醛等) ：使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢
卤族元素及其化合物：碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反
应产生的强氧化剂也具有杀菌作用；
有机染料：在低浓度条件下可抑制细菌生长，革兰氏阳性菌更加敏感；
表面活性剂：能降低溶液表面张力，这类物质作用于微生物细胞膜，改变其透性，同时也能使
蛋白质发生变性。
2、紫外线杀菌机理
紫外线主要改变微生物的DNA 结构，轻则使微生物发生突变不能繁殖后代，重则造成微生物
当即死亡，达到杀菌的目的。紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率(瓦数) 、照射距离和照射时间有关。紫外线透过物质的能力弱，一层黑纸足以挡住紫外线的通过。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm
的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它作用于细胞内的DNA （脱氧核糖核酸），诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA 链的
交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O 2氧化生成臭氧(O3) 或使水(H2O) 氧化生成过氧化氢(H2O 2) 。O 3和H 2O 2都具有杀菌作用。
另外，要避免光复活作用。暗修复作用与可见光无关。
五、注意事项：
1、滤纸片法测定化学消毒剂的杀(抑) 菌作用实验中， 取出滤纸片时要在瓶口沥去多余药液，
以保证各滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致。
2、紫外线对微生物的影响实验中，接受紫外线照射时要打开培养皿盖；照射后要避免光复活作
用。
实验七 细菌鉴定中常规生理生化反应
——甲基红试验与伏-普试验
二、基本原理
甲基红试验和伏-普试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气杆菌(Eenterobacter aerogenes) ，而且主要
用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌虽非致病菌，但饮水中若大肠杆菌超过一定数量则表示受到粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。
甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中糖先分解成丙酮酸，丙酮酸再分解成甲基、
乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂[pH4.2（红色）—6.3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。
伏-普试验。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此
物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。产气肠杆菌伏-普反应阳性，大肠杆菌伏-普反应阴性。
实验八 不同类群的土壤微生物分离
二、基本原理
（一）微生物的分离纯化
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌种。微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎
污染时也需予以分离。
分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。上述工作又离不开接种，即将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。 分离纯化常用的方法有：
1． 简易单细胞挑取法：该技术需要借助于显微操纵仪或通过单孢子分离法来完成。 2． 平板分离法：本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其内容包括两个方面：
（1） 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2） 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。
其中纯培养的确定方法包括两方面内容，一方面要确定其菌落观察特征，另一方面要结合显微镜检测并确定个体形态特征。
（二） 干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃) ，时间长(1～2h) 。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图6—
1
图6－1 干燥箱的外观和结构
A 外观 B 结构
1温度计； 2排气阀； 3温度显示屏； 4箱门； 5控温旋钮； 6设温测温转换开关； 7指示灯； 8加热开关； 9搁板； 10散热板； 11电热丝； 2. 高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气孔中驱尽，然后关闭排气阀。继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表6－1）。二是湿热的穿透力比干热大(表6－2) ，三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g 水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ （千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高待灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表6－1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
表6－2 干热湿热穿透力及灭菌效果比较
表6－3 灭菌锅内有不同分量空气时，压力与温度的关系
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的 排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中合有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表6－3）。一般培养基用0.1MPa(相当于1.05kg ／cm 2) ，121.5℃，15～30min 可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06MPa （0.59 kg ／cm 2）112.6℃灭菌15min 。
实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提
式（图6－2）二种。其结构和工作原理相同．本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法。
三、实验器材
1. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基。 2. 试剂：土壤悬液，无菌水。
3. 器具：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、移液管、三角瓶、接种环、
无菌培养皿、玻璃刮铲等。
四、操作步骤
（一）培养基的配制：
以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例：
1. 称量 按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂．一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。
2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化．以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。
3. 调pH 在未调pH 前 先用精密pH 试纸测定培养基的原始pH ，如果偏酸，用滴管向培养基中缓慢滴加入1mol/L NaOH 边加边搅拌，并随时用pH 试纸测其pH ，直至pH 达7.0～7.2。如偏碱，用1mol/L HCl进行调节。
对于有些要求pH 较精确的微生物，其培养基的pH 可用酸度计进行调节。 pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4. 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。可以省去(本实验勿需过滤) 。
5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图6-3。
分装高度以试管高度的l ／4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用了振荡培养用．则根据通气量的要求酌情减少。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶) 口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6. 加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶瓶口塞上棉塞，以
阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
7. 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记 号笔注明培养基名称、组男IJ 、配制日期。
8. 灭菌 将上述培养基以0.103Mpa ，121℃，20min 高压蒸气灭菌。
9. 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50℃左右〔以防斜面上冷凝水太多) ，将试
管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
（二）、灭菌 1. 干热灭菌
（1） 装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品(培养皿，试管，吸管等) 放入电烘箱内，关好箱门．
物品不要摆得太挤，以免妨得空气流通．灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁扳，以防包装纸烤焦起火。
（2） 升温 接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，设定温度为160～170℃，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。继续升温至设定温度。
（3） 恒温 当温度升到设定温度后，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h 。 （4） 降温 切断电源、自然降温。
（5） 开箱取物 待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。 电烘箱内温度末降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿烽裂． 2. 高压蒸汽灭菌
（1） 首先将内层钢取出，再向外层钢内加入适量的水．使水面与三角搁架相乎为宜． 切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅干烧而引起炸裂事故。
（2） 放回内层锅，并装人待灭菌物品．注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3） 加盖，并将益上的排气软管插入内层锅的排气槽内．再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺拴，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4） 通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，
维持压力至所需时间。本实验用0.1 MPa 121.5℃，20min 灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后．才能关上排气阀，维持所需压力。
（5） 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀。旋松螺栓，打开盖子。取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力骤然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞蘸染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
（6） 将取出的灭菌培养基故人37℃温箱培养24h ，经检查若五杂菌生长，即可待用。 （三）平板分离法 1、稀释涂布平板法
（1） 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃， 高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；
（2） 制备土壤稀释溶液 称取土样10g ，放入盛有90ml 无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min ，使土样与水分混合，将细胞分散. 用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一个盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；
（3） 涂布 将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml 对号加入已写好标记的培养基上，均匀涂布，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基；
（4） 培养 将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板; 马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5day，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3day后观察；
（5） 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
（6） 接种移植与保存 将获得的纯培养接种移植到灭菌的试管斜面培养基上，在适宜的温度下培养数日后，于冰箱中4℃保存。
2、 平板划线分离法
（1） 倒平板 按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期； （2） 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线. 划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落；培养方法同上。
（3） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。接种移植与保存的方法同上。
3、 稀释混合倒平板法
（1） 用无菌吸管分别吸取0.5ml 10-4，10-5，10-6土壤稀释液加入平板中.
（2） 将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中（约15～20ml ），充分混匀，水平放置待凝固。培养方法同上。
（3） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。接种移植与保存的方
法同上。
五、注意事项
1． 干热灭菌结束后，一定要等箱内温度降到70℃左右才能打开箱门，否则冷热空气相遇会引起玻璃器皿爆炸！
2． 高压蒸气灭菌结束后，一定要等锅内压力降为0才能打开锅盖，否则瓶内外压力不平衡，引起培养基暴沸，冲到瓶口污染棉塞。
3. 平板不能倒得太薄，为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 4. 在分离和接种过程中必须进行严格的无菌操作。
5. 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些，否则易划破培养基。
实验一 显微镜油镜的使用和细菌三种基本形态观察
二、基本原理
油镜是显微镜物镜中重要的镜头，其上刻有“OI ”或“HI ”字样，也有以刻一圈红线或白线为
标记，用于区别其它物镜。油镜的使用比较特殊，需在玻片与镜头之间加滴镜油，其原理如下：
1． 增加照明强度
油镜的放大倍数可达100×，其镜头焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。需在油
镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n=1.52），目的是使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失，基本上全进入镜头，因此提高了照明强度，使图像更加清晰。不同介质的折射率是不同的，用空气作介质，折射率为（n=1）; 用水作介质，折射率为（n =1.33），它们的折射率都比香柏油低，其光线通过玻片后会发生折射或全反射，不能完全进入物镜，造成光的损失，结果降低了视场亮度，使图像不清晰。由此可见，提高介质的折射率，就可提高图像的清晰度。
2． 增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离（D ）的能力。D 值愈小则表明分辨率愈强。
D 值可用如下下公式表示：
式中入=光波波长； N A=物镜的数值孔径值。
分辨率取决于物镜的数值孔径和光源波长，即显微镜分辨率与物镜的数值孔径成正比，与光波
波长成反比。波长愈短，数值孔径愈大，分辨距离愈短，则分辨能力就愈强。光学显微镜的光源不
可能超出可见光的波长范围（400～770nm ），虽然利用紫外线作光源可提高分辨率，但应用范围有限，只适用于显微镜摄影而不适用直接观察。数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，即指介质的折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可表示为：
式中n=物镜与标本间介质的折射率；a=镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成
的夹角 图1-1）。
图1-1 物镜的镜口角
影响数值孔径的因素之一是镜角口。式中a 为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和
焦距。当Sin （a/2）增到最大时，a/2=90°，就是说，进入透视镜的光线与光轴成90°角，这是不可能的，所以Sin(a/2)的最大值总是小于1。现在所用的油镜其a/2为60°左右。影响数值孔径的另一因素是介质的折射率，前面已说到，不同介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，香柏油的折射率为1.52，玻璃的折射率为1.55。因此，在物镜和玻片标本间加入香柏油作介质时，数值孔径就可以增大到1.2—1.4。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，假如数值孔径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的最小距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值孔径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离=0.552×
1.25=0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体。但是大部分细菌直径在0.5μm左右，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态及某些结构。
显微镜的总放大率是指物镜放大率和目镜放大率的乘积。但由于物镜和目镜搭配不同，其分辨
率也不同，例如，在总放大率相同情况下，采用数值孔径大的40×物镜和10×目镜相搭配，其分辨率就比数值孔径小的20×物镜和20×目镜相搭配的要高些，效果也更好。
三、实验器材
1. 标本：细菌三型玻片。
2. 试剂：香柏油、显微镜清洗液（酒精乙醚液）。
3. 器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸等。
四、操作步骤（用油镜观察细菌）
显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
1. 放置标本 将染色的细菌三型玻片置于镜台上。
2. 找合适的视野 先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移到视野中央。
3. 转换油镜 将油镜转到工作位置。
4. 调节聚光器与油镜数值孔径一致 只要将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大，此
时两者的数值孔径即达到一致。
5. 加香柏油 取香柏油1-2滴加到欲观察部位涂片上，从侧面注视然后将油镜转到工作位置，
下降镜筒或上升载物台，使油镜浸入香柏油中。必须十分注意，油镜头不能压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，否则不仅会压碎玻片，还易损坏镜头。
6. 调焦 左眼从油镜中观察，同时转动粗调节螺旋，缓慢地提升油镜调焦，至出现模糊的物
象时，再用细调节螺旋调节至物象清晰为止。如按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜下降不到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象。遇此情况，应重新操作。调焦时，应特别注意误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及玻片。
7. 观察 仔细观察细菌的三种基本形态。
8. 显微镜用毕后的处理 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，
再取擦镜纸蘸取酒精乙醚液，擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留物。最后将镜头转至“八”字形，并将载物台和聚光镜降至最低处，将显微镜放入镜箱。
五、注意事项
1. 油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切忌用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从
侧面注视，不要使油镜镜头压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，还应特别注意误将粗调节器向相反方向转动而损坏镜头和玻片。
2. 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。
实验二 细菌革兰氏染色和芽孢染色法
二、基本原理
1. 革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要鉴别染色法。1884年由丹麦病理学家C ·Gram 创立，用革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G ）和革兰氏阴性菌（G ）两大类。一般来说，芽孢杆菌与绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都是革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体，某些球菌和大多数致病性的无芽孢杆菌都是革兰氏阴性反应。
革兰氏染色法的基本步骤是先用结晶紫进行初染，再用碘液媒染（以增加染料与细菌的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的不溶于水的复合物，然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂(蓝紫色) 者为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色后而使细菌染上复染剂的颜色（红色）者则为革兰氏阴性菌。 +—
革兰氏染色法之所以能将细菌分为G 菌和G 菌，是由这两类细菌的细胞壁成分和结构不同所决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁中肽聚糖层较厚且交联度高，类脂含量少，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经复染后，仍保留初染剂的蓝紫色。而革兰氏阴性菌由于细胞璧中含有较高的类脂，而且肽聚糖层较薄，且交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物比较容易洗脱出来，结果是细菌被脱成无色，当用复染剂番红复染后，细菌就染成复染剂番红的红色。
2. 芽孢染色法
芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形，细菌能否形成
芽孢以及芽孢的形状、大小和在菌体内的位置都是鉴定细菌的重要依据。
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能是菌体着色而芽孢不
着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。
芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红, 在加热条件下，延长染色
时间促进标本着色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂如番红复染后，芽孢仍保留初染剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色，使芽孢和菌体形成鲜明的对比，因而更明显地衬托出芽孢，易于辨认。 +—
三、实验器材
1. 菌种: 大肠埃希氏菌（Escherichia coli ）, 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ），
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），丙酮丁醇梭菌。
2. 试剂： 草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液（附录Ⅰ）；5%孔雀绿
染色液，0.5%番红水溶液。
3. 器具： 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸、
吸水纸等。
五、注意事项
1. 革兰氏染色成败关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被误认为是革兰氏阴性
菌。如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。
2. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸干残水或用吹风机吹干，以免染色液被稀
释而影响染色效果。
3. 革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h 菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自
溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
4. 芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。巨大芽孢杆菌在37℃下
培养12-14h 效果最佳。
5. 在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。
实验三 放线菌和真菌的形态观察
二、基本原理 放线菌是能形成分枝菌丝体的一类革兰氏阳性菌，是产生抗生素的最重要的微生物。能否产生
菌丝体及菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内丝菌，基内丝菌向空气中生长出气生菌丝，气生菌丝进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。基丝较细透明，气丝较粗颜色较深，孢子丝有直、波曲、各种螺旋或轮生，孢子有球形，椭圆形，杆状或柱状，一般着生在孢子丝的顶端。孢子丝和孢子的形态和排列方式是分类的重要依据。
扦片法可观察到不同生长时期放线菌自然生长状态下的形态特征。是一种常用和有效的方法。
其主要原理是：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置载玻片上直接镜检，就可观察到放线菌在自然状态下着生的各种形态特征，也可用吕氏碱性美蓝染色后观察。
真菌主要包括酵母菌和霉菌。真菌大小通常比细菌大几倍甚至几十倍。酵母菌是不运动的单细胞真核生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖产生子囊孢子。而霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝（分生孢子梗），由繁殖菌丝产生分生孢子。霉菌的菌丝体尤其是繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
美蓝是一种无毒性的染料，它可用来观察酵母菌的形态和出芽方式，也可对酵母菌的死活细胞进行鉴别，它的氧化型呈蓝色，还原形呈无色，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母菌细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色。观察霉菌的形态主要有直接制片观察法和载片培养法。直接观察法是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染液中，制成霉菌玻片镜检。用此方法制片能使细胞不变形，具有防腐作用，不易干燥，保存时间较长，防止孢子飞散；染成蓝色增强反差，便于观察。载片培养法见微生物实验教程。
三、实验器材
1. 菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus ）5406，红酵母（Rhodotorula sP ）或酿酒
酵母（Sacchromyces cerevisiae ）, 产黄青梅（Penicillium chrysogenum ）, 黑曲霉（Aspergillus niger ）, 黑机霉（Rhizopus nigricans）, 总状毛霉（Mucor racemosds）。
2. 培养基：高氏1号琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基或查氏培养
基。
3. 试剂：0.1%美蓝染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%乙醇。
4. 器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、接种杯、解剖针等。
五、注意事项
1. 镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。
2. 染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖片时，过多染液会溢出，过少会出现大量气泡而影
响观察。
3. 挑菌和制片要细心，用镊子或解剖针小心将菌丝分开，要尽可能保持霉菌自然生长状态和
菌体的完整性。
实验四 微生物显微镜直接计数法
二、基本原理
利用血细胞计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）的数目，是一种常用的微生物
总菌数（包括死菌体和活菌体）的计数方法。它是有直观，简便和快捷等优点，常用于酵母、细菌、霉菌孢子等单细胞的微生物计数。但此法的缺点是所测的结果通常是死菌体和活菌体的总和，要克服这一缺点，此法可与美蓝等特殊染料染色相结合，也能达到分别计算活菌数和死菌数的目的。而间接（活菌）计数常用液体稀释法或平板菌落（因为样品中每个活细胞数能在平板培养基表面形成一个菌落）计数法两种，它们是以最大稀释率或平板菌落法间接获得样品中的活细胞（或孢子）数的一种计数法，其所测结果通常是活菌体。
利用血细胞计数板计数的原理是：将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。由于计数室的容积是固定的（0.1mm ），故可将显微镜下计得的菌体细胞或孢子数换算成单位体积试样中的含菌量。
血细胞计数板是一块特别的精密载玻片，在载玻片上有4条长槽将玻片中间区域分隔成3个平台，中间较宽的平台有被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数室构造如图（4-1、4-2）。计数室的刻度一般3
有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每个大方格中的小方格都是400个。每中格四周均有双线界限标志，以便区分。计数室大方格的边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm ，计数室与盖玻片间的高度为0.1mm ，所以计数室的体积为0.1mm 23（万分之一毫升）。计数时，先计得若干（一般为5个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中（0.1mm ）计数室中的总菌数，最好再换算成1ml 菌液中的总菌数，即再乘以10及菌液的稀释倍数，即可算出1ml 菌液中的总菌数。1ml=1cm=1000mm433 3
若要区分计数样品中的死菌和活菌值，则可采用微生物的活体染色法。活体染色法就是利用对微生物无毒性的染料（如美蓝、刚果红、中性红等染料）配成一定的浓度，再与一定量的菌液混合，经一段时间后，死菌和活菌会呈现出不同的颜色，这样便可在显微镜下区分活菌数与死菌数。
美蓝是常用的活体染色染料，当它处于氧化态时呈蓝色，还原态度时为无色。用它进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氧作用，美蓝接受氢后就由氧化态转变成还原态，因此活细胞呈现无色，而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，故细胞呈蓝色。
图 4-1 血细胞计数板正面与侧面图 图 4-2 中央大方格为计数室
4. 显微镜计数
先用低倍镜，找到计数室，并将计数室移至中央，转用高倍镜观察计数。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体计数，位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半时，可计为2个菌体。每个样品必须计数2个计数室中的平均含菌量值。
5. 计算方法
或16) ×10×稀释倍数 4
计数完毕，将血细胞计数板用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，再用吹风机吹干后放入计数板盒
中。
五、注意事项
1. 取样前，必须将菌悬液摇匀。
2. 计数室内不可有气泡
3. 凡压在中格线上的菌体，切莫四边全计，通常只计上方和右边两条线上的。
4. 计数时，遇出芽的酵母菌，芽体大小达到母细胞的一半时才计为2个。
实验五 显微测微尺的使用和微生物大小的测定
二、基本原理
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——显微测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺（图5－1) 是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm 等分为100格，每
格长0.01mm （即10µm ）。标尺的外围有一黑色的小环，以便在显微镜下寻找标尺位置，标尺的圆环上复有一圆形盖玻片以作保护。盖玻片是用树胶粘在在玻片上的，因此避免二甲苯与其接触。镜台测微尺是显微长度测量的标准，它并不被用来直接测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度，故其质量对所测结果影响极大。
目镜测微尺（图5－2) 是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分
为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
图5－1 镜台测微尺及中间部分的放大 图5－2 目镜测微尺
球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8μm，枯草芽胞杆菌大小为0.7～0.8 × 2～3µm 。
三、实验器材
1． 菌种： 红酵母48h 斜面培养物，
2． 器具： 显微镜、目镜测微尺，镜台测微尺，接种环，载玻片，盖玻片，等。
实验六 化学和物理因素对微生物的影响
二、基本原理：
微生物的生长繁殖是通过与外界环境进行物质和能量交换而实现的，环境条件的改变对微生物
的生长会造成不同程度的影响。环境因素从总体上可分为化学、物理和生物因素。
本实验主要通过化学、物理这两类环境因素对微生物影响的试验，了解微生物与其所处环境之
间的相互关系，使学生初步了解如何控制环境条件．使有益微生物正常生长、有害微生物受到抑制或被杀死，掌握微生物在环境中的分布规律，使微生物能更好地为人类所利用。
1、常用化学消毒剂及杀（抑）菌机理：
重金属离子：与菌体蛋白质结合而使之变性，或与酶蛋白的巯基相结合而使酶失活；
重金属盐：是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生螯合作用而使之变为无效化合物；
有机溶剂(酚、醇、醛等) ：使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢
卤族元素及其化合物：碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反
应产生的强氧化剂也具有杀菌作用；
有机染料：在低浓度条件下可抑制细菌生长，革兰氏阳性菌更加敏感；
表面活性剂：能降低溶液表面张力，这类物质作用于微生物细胞膜，改变其透性，同时也能使
蛋白质发生变性。
2、紫外线杀菌机理
紫外线主要改变微生物的DNA 结构，轻则使微生物发生突变不能繁殖后代，重则造成微生物
当即死亡，达到杀菌的目的。紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率(瓦数) 、照射距离和照射时间有关。紫外线透过物质的能力弱，一层黑纸足以挡住紫外线的通过。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm
的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它作用于细胞内的DNA （脱氧核糖核酸），诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA 链的
交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O 2氧化生成臭氧(O3) 或使水(H2O) 氧化生成过氧化氢(H2O 2) 。O 3和H 2O 2都具有杀菌作用。
另外，要避免光复活作用。暗修复作用与可见光无关。
五、注意事项：
1、滤纸片法测定化学消毒剂的杀(抑) 菌作用实验中， 取出滤纸片时要在瓶口沥去多余药液，
以保证各滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致。
2、紫外线对微生物的影响实验中，接受紫外线照射时要打开培养皿盖；照射后要避免光复活作
用。
实验七 细菌鉴定中常规生理生化反应
——甲基红试验与伏-普试验
二、基本原理
甲基红试验和伏-普试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气杆菌(Eenterobacter aerogenes) ，而且主要
用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌虽非致病菌，但饮水中若大肠杆菌超过一定数量则表示受到粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。
甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中糖先分解成丙酮酸，丙酮酸再分解成甲基、
乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂[pH4.2（红色）—6.3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。
伏-普试验。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此
物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。产气肠杆菌伏-普反应阳性，大肠杆菌伏-普反应阴性。
实验八 不同类群的土壤微生物分离
二、基本原理
（一）微生物的分离纯化
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌种。微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎
污染时也需予以分离。
分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。上述工作又离不开接种，即将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。 分离纯化常用的方法有：
1． 简易单细胞挑取法：该技术需要借助于显微操纵仪或通过单孢子分离法来完成。 2． 平板分离法：本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其内容包括两个方面：
（1） 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2） 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。
其中纯培养的确定方法包括两方面内容，一方面要确定其菌落观察特征，另一方面要结合显微镜检测并确定个体形态特征。
（二） 干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃) ，时间长(1～2h) 。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图6—
1
图6－1 干燥箱的外观和结构
A 外观 B 结构
1温度计； 2排气阀； 3温度显示屏； 4箱门； 5控温旋钮； 6设温测温转换开关； 7指示灯； 8加热开关； 9搁板； 10散热板； 11电热丝； 2. 高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气孔中驱尽，然后关闭排气阀。继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表6－1）。二是湿热的穿透力比干热大(表6－2) ，三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g 水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ （千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高待灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表6－1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
表6－2 干热湿热穿透力及灭菌效果比较
表6－3 灭菌锅内有不同分量空气时，压力与温度的关系
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的 排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中合有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表6－3）。一般培养基用0.1MPa(相当于1.05kg ／cm 2) ，121.5℃，15～30min 可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06MPa （0.59 kg ／cm 2）112.6℃灭菌15min 。
实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提
式（图6－2）二种。其结构和工作原理相同．本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法。
三、实验器材
1. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基。 2. 试剂：土壤悬液，无菌水。
3. 器具：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、移液管、三角瓶、接种环、
无菌培养皿、玻璃刮铲等。
四、操作步骤
（一）培养基的配制：
以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例：
1. 称量 按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂．一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。
2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化．以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。
3. 调pH 在未调pH 前 先用精密pH 试纸测定培养基的原始pH ，如果偏酸，用滴管向培养基中缓慢滴加入1mol/L NaOH 边加边搅拌，并随时用pH 试纸测其pH ，直至pH 达7.0～7.2。如偏碱，用1mol/L HCl进行调节。
对于有些要求pH 较精确的微生物，其培养基的pH 可用酸度计进行调节。 pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4. 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。可以省去(本实验勿需过滤) 。
5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图6-3。
分装高度以试管高度的l ／4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用了振荡培养用．则根据通气量的要求酌情减少。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶) 口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6. 加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶瓶口塞上棉塞，以
阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
7. 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记 号笔注明培养基名称、组男IJ 、配制日期。
8. 灭菌 将上述培养基以0.103Mpa ，121℃，20min 高压蒸气灭菌。
9. 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50℃左右〔以防斜面上冷凝水太多) ，将试
管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
（二）、灭菌 1. 干热灭菌
（1） 装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品(培养皿，试管，吸管等) 放入电烘箱内，关好箱门．
物品不要摆得太挤，以免妨得空气流通．灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁扳，以防包装纸烤焦起火。
（2） 升温 接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，设定温度为160～170℃，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。继续升温至设定温度。
（3） 恒温 当温度升到设定温度后，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h 。 （4） 降温 切断电源、自然降温。
（5） 开箱取物 待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。 电烘箱内温度末降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿烽裂． 2. 高压蒸汽灭菌
（1） 首先将内层钢取出，再向外层钢内加入适量的水．使水面与三角搁架相乎为宜． 切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅干烧而引起炸裂事故。
（2） 放回内层锅，并装人待灭菌物品．注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3） 加盖，并将益上的排气软管插入内层锅的排气槽内．再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺拴，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4） 通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，
维持压力至所需时间。本实验用0.1 MPa 121.5℃，20min 灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后．才能关上排气阀，维持所需压力。
（5） 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀。旋松螺栓，打开盖子。取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力骤然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞蘸染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
（6） 将取出的灭菌培养基故人37℃温箱培养24h ，经检查若五杂菌生长，即可待用。 （三）平板分离法 1、稀释涂布平板法
（1） 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃， 高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；
（2） 制备土壤稀释溶液 称取土样10g ，放入盛有90ml 无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min ，使土样与水分混合，将细胞分散. 用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一个盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；
（3） 涂布 将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml 对号加入已写好标记的培养基上，均匀涂布，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基；
（4） 培养 将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板; 马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5day，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3day后观察；
（5） 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
（6） 接种移植与保存 将获得的纯培养接种移植到灭菌的试管斜面培养基上，在适宜的温度下培养数日后，于冰箱中4℃保存。
2、 平板划线分离法
（1） 倒平板 按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期； （2） 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线. 划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落；培养方法同上。
（3） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。接种移植与保存的方法同上。
3、 稀释混合倒平板法
（1） 用无菌吸管分别吸取0.5ml 10-4，10-5，10-6土壤稀释液加入平板中.
（2） 将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中（约15～20ml ），充分混匀，水平放置待凝固。培养方法同上。
（3） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。接种移植与保存的方
法同上。
五、注意事项
1． 干热灭菌结束后，一定要等箱内温度降到70℃左右才能打开箱门，否则冷热空气相遇会引起玻璃器皿爆炸！
2． 高压蒸气灭菌结束后，一定要等锅内压力降为0才能打开锅盖，否则瓶内外压力不平衡，引起培养基暴沸，冲到瓶口污染棉塞。
3. 平板不能倒得太薄，为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 4. 在分离和接种过程中必须进行严格的无菌操作。
5. 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些，否则易划破培养基。