7. 线粒体与过氧化物酶体
细胞的生存需要两个基本的要素∶构成细胞结构的化学元件和能量。生物从食物中获取能量，根据对氧的需要情况分为两种类型∶厌氧的，即不需要氧；好氧的，即需要氧的参与。在真核生物中，需氧的能量转化过程与线粒体有关，并且伴随着一系列的化学反应；而在原核生物中，能量转化与细胞质膜相关。
1850年发现的一种细胞器，1898年命名。是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所(图7-1)。
过氧化物酶体是细胞内另一个需要氧的细胞器，不过过氧化物酶体需要氧不是用于ATP的合成而是用于有毒物质的氧化，对线粒体具有氧调节作用。
图7-1 线粒体结构及功能示意图
7.1 线粒体的形态结构
线粒体是能够在光学显微镜进行观察的显微结构，它具有渗透性，在低渗溶液中会膨胀，而在高渗溶液中能够收缩。
7.1.1 线粒体的发现与功能研究
人们对线粒体的研究有一个多世纪的历史。
● 1850年，德国生物学家Rudolph Kölliker第一个发现线粒体， 并推测∶这种颗粒是由半透性的膜包被的。
● 1898年对线粒体进行命名。
● 1900年，Leonor Michaelis用染料Janus green对肝细胞进行染色，发现细胞消耗氧之后，线粒体的颜色逐渐消失了，从而提示线粒体具有氧化还原反应的作用。
后又经过几十年的研究, 逐步证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化的作用,从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的主要部位。
7.1.2 线粒体的形态结构
■ 线粒体的形态和分布 ● 大小:
线粒体的形状多种多样， 一般呈线状(图7-2)，也有粒状或短线状。
图7-2 电子显微镜观察的蝙蝠胰腺细胞线粒体
● 数量:
在不同类型的细胞中线粒体的数目相差很大， 但在同一类型的细胞中数目相对稳定。有些细胞中只有一个线粒体，有些则有几十、几百、甚至几千个线粒体。
● 分布
在多数细胞中，线粒体均匀分布在整个细胞质中，但在某些些细胞中，线粒体的分布是不均一的。
线粒体较多分布在需要ATP的部位(如肌细胞和精细胞， 图7-3);或较为集中分布在有较多氧化反应底物的区域，如脂肪滴(图7-4)，因为脂肪滴中有许多要被氧化的脂肪。
图 7-3 肌细胞和精子的尾部聚集较多的线粒体， 以提供能量
图7-4 线粒体包围着脂肪滴，内有大量要被氧化的脂肪
● 存在方式
线粒体在细胞中并非都是单个存在的，有时可形成由几个线粒体构成的网络结构，有些线粒体具有分支,可以相互交错在一起。如通过相差显微镜检查完整的肝细胞,发现线粒体并非是单个存在的,而是以交织的网络状态存在(图7-5)。
图7-5 细胞中线粒体分支交织连接而成的网状二维结构
7.2 线粒体的结构与化学组成 7.2.1 线粒体的结构
线粒体由内、外两层彼此平行和高度特化的膜包围而成， 内外膜都是典型的单位膜。线粒体外膜(outer membrane)起界膜作用，线粒体内膜(inner membrane)向内皱折形成嵴(cristae)，嵴上有一些颗粒朝向线粒体基质，这些颗粒称为F1颗粒(F1 particle)，似把手状。线粒体的外膜和内膜将线粒体分成两个不同的区室:一个是膜间间隙(intermembrane space)，是两个膜之间的空隙;另一个是线粒体基质(matrix)，它是由内膜包裹的空间(图7-6)。
图7-6 线粒体结构模式图
7.2.2 线粒体膜通透性
很早就认识到线粒体的膜具有半透性，通过对半透性的研究导致线粒体各组分分离方法的建立。
■ 线粒体通透性研究
将线粒体放在100 mM蔗糖溶液中，蔗糖穿过外膜进入线粒体的膜间间隙；然后将线粒体取出测定线粒体内部蔗糖的平均浓度，结果只有50 mM， 比环境中蔗糖的浓度低。据此推测:线粒体外膜对蔗糖是通透的，而内膜对蔗糖是不通透的(图7-7)。
图7-7 线粒体通透性测定
左:将线粒体置于含有100 mM的蔗糖溶液中; 中:蔗糖穿过线粒体外膜，达到平衡;右:将线粒体从蔗糖溶液中取出，测定线粒体中蔗糖的浓度。如果测得线粒体的蔗糖平均浓度是50 mM，就可以推测:100mM的蔗糖仅仅穿过了线粒体外膜，而线粒体中有一半流动的液体在线粒体基质，由于内膜对蔗糖不通透，所以测得的
线粒体平均浓度只有50 mM。
■ 线粒体各组分的分离
由于线粒体外膜的通透性比内膜高，利用这一性质，Donal Parsons 和他的同事最先建立了分离线粒体内膜、外膜及其他组分的方法(图7-8)，
图7-8 线粒体组分的分离
首先将线粒体置于低渗溶液中使外膜破裂，此时线粒体内膜和基质(线粒体质)仍结合在一起，通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂毛地黄皂苷处理线粒体质，破坏线粒体内膜，释放线粒体基质，破裂的内膜重新闭合形成小泡，其表面有F1颗粒。
请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一行特性，设计分离线粒体各组份的方法
7.2.3 线粒体各部分的化学组成和特性
■ 线粒体的化学组成
经过对线粒体各结构组分的生化分析， 线粒体的化学组分主要是由蛋白质、
● 膜间隙 线粒体内膜和外膜之间的间隙称为膜间隙， 宽6～8 nm，由于外膜通透性很强，而内膜的通透性又很低，所以膜间隙中的化学成分很多，几乎接近胞质溶胶。功能是建立和维持氢质子梯度。
● 线粒体基质 内膜和嵴包围着的线粒体内部空间是线粒体基质，与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中；此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。
比较线粒体外膜、内膜、膜间隙和基质的化学特性和功能的主要差别
7.2.4 线粒体内膜的主动运输系统
由于线粒体对于大多数亲水物质的透性极低，所以它必须具备特殊的主动运输系统，完成下列运输作用:
①糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；
②线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A必须运输到细胞质中，它们分别是细胞质中葡萄糖和脂肪酸的前体物质;
③线粒体产生的ATP必须进入到胞质溶胶，以便供给细胞反应所需的能量，同时，ATP水解形成的ADP和Pi又要被运入线粒体作为氧化磷酸化的底物。
■ 丙酮酸、脂肪酸、Pi等的运输
在线粒体内膜上具有完善的运输系统,主要是运输蛋白和一些起促进运输作用的脂类(如心磷脂)。运输系统也包括参与电子传递和氢质子传递的复合物,内膜上有运输丙酮酸、脂肪酸和特殊氨基酸的运输蛋白,其中某些运输蛋白(包括同向和逆向)的运输作用是靠质子梯度驱动的(图7-9)。
图7-9 线粒体内膜中的运输系统
■ 线粒体对细胞内Ca2+的调节
线粒体、内质网和细胞外基质都是Ca2+的储藏地，在内质网、肌质网和细胞质膜上都有Ca2+泵的存在。线粒体内膜上有两种类型的Ca2+运输系统，能够将Ca2+输入到线粒体基质中，或
将Ca2+从线粒体基质运输到膜间隙(图7-10)。
图7-10 线粒体的两种Ca2+离子运输系统
系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质;系统2是通过与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。
7.3 导向信号与线粒体蛋白定位
线粒体中的蛋白质绝大多数都是核基因编码，在细胞质的游离核糖体上合成后运输到线粒体的(表7-3)。
表7-3 细胞质中合成的某些线粒体蛋白质
7.3.1 蛋白质寻靶(protein targeting)和蛋白质分选(protein sorting)
■ 蛋白质的两种转运方式
细胞质中的核糖体在合成蛋白质时有两种可能的存在状态，一种是在蛋白质合成的全过程一直保持游离状态（实际上是与细胞骨架结合在一起的），这种核糖体称为游离核糖体(free ribosomes)。另一种情况是核糖体在合成蛋白质的初始阶段处于自由状态，但是随着肽链的合成，核糖体被引导到内质网上与内质网结合在一起，这种核糖体称为。这两种核糖体上合成的蛋白质不仅在细胞内的去向不同，它们的转运方式也是不同的。
● 翻译后转运(post-translational translocation)与蛋白质寻靶
游离核糖体上合成的蛋白质释放到胞质溶胶后被运送到不同的部位， 即先合成，后运输。由于在游离核糖体上合成的蛋白质在合成释放之后需要自己寻找目的地，因此又称为蛋白质寻靶(7-11)。
图7-11 蛋白质翻译后转运
定位在线粒体、叶绿体、细胞核、细胞质、过氧化物酶体的蛋白质在游离核糖体上合成后释放到胞质溶胶中，进入细胞核的蛋白质通过核孔运输，与定位到其
他翻译后转运的细胞器蛋白的运输机制不同。
● 与蛋白质分选
膜结合核糖体上合成的蛋白质通过定位信号，一边翻译，一边进入内质网，由于这种转运定位是在蛋白质翻译的同时进行的，故称为共翻译转运(图7-12)。在膜结合核糖体上合成的蛋白质通过信号肽，经过连续的膜系统转运分选才能到达最终的目的地，这一过程又称为蛋白质分选。
图7-12 蛋白质的共翻译转运
膜结合核糖体合成的蛋白质经内质网、高尔基体进行转运，运输的目的地包括
内质网、高尔基体、溶酶体、细胞质膜、细胞外基质等。
■ 导向序列(targeting sequence)与信号序列(signal sequence)
● 导向序列
将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号称为导向信号(targeting signal)，或导向序列(targeting sequence)，由于这一段序列是氨基酸组成的肽，所以又称为转运肽(transit peptide)，或。
● 信号序列
将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列(signal
sequence)，将组成该序列的肽称为信号肽（signal peptide)。
在不需要特别区分时，可将它们统称为信号序列或信号肽。
比较导向序列与信号序列有什么不同7.3.2 线粒体蛋白转运
构成线粒体的蛋白主要是核基因编码的,少量是线粒体基因编码的,无论是核基因还是线粒体基因编码的蛋白质都要转运定位。线粒体有四个组成部分,其中有两层膜,所以由细胞质核糖体合成的蛋白质转运到线粒体基质必须穿过两层膜障碍(图7-13)。
图7-13 线粒体蛋白转运的部位
■ 线粒体基质蛋白(mitochondrial matrix protein)转运
线粒体基质蛋白， 除极少数外， 都是游离核糖体合成， 并通过转运肽转运进来的，转运过程十分复杂(图7-14)。
图7-14 蛋白质输入线粒体基质
■ 线粒体膜间隙蛋白的转运
线粒体膜间隙蛋白，如细胞色素c的定位需要两个导向序列，位于N端最前面的为基质导向序列(matrix-targeting sequence)，其后还有第二个导向序列，即膜间隙导向序列(intermembrane-space-targeting sequence)，功能是将蛋白质定位于内膜或膜间隙，这类蛋白有两种转运定位方式。
● 保守性寻靶(conservative targeting) 前体蛋白在N-端的基质导向序列引导下采用与线粒体基质蛋白同样的运输方式，将前体蛋白转运到线粒体基质，在基质中由转肽酶切除基质导向序列后， 膜间隙导向序列就成了N端的导向序列， 它能够识别内膜的受体和转运通道蛋白，引导蛋白质穿过内膜，进入线粒体膜间隙，然后由
线粒体膜间隙中的转肽酶将膜间隙导向序列切除(图7-15)。
图7-15 线粒体内膜蛋白的保守性寻靶，详见正文
● 非保守性寻靶(nonconservative targeting)
与保守性寻靶不同,蛋白质的非保守性寻靶首先在线粒体基质导向序列的引导下,通过线粒体的外膜和内膜,但是疏水的膜间隙导向序列作为停止转运序列
(stop-transfer sequence) 锚定在内膜上,从而阻止了蛋白质的C-末端穿过内膜进入线粒体基质；然后通过蛋白质的扩散作用,锚定在内膜上的蛋白逐渐离开转运通道,
最后在转肽酶的作用下,将膜间隙导向序列切除,蛋白质释放到膜间隙,结合血红素后,蛋白质折叠成正确的构型(图7-16)。
图7-16 线粒体膜间隙蛋白的非保守性寻靶
■ 线粒体内膜和外膜蛋白的转运
图7-17显示线粒体内膜蛋白的N-端只有一个基质导向序列，内膜蛋白在基质导向序列的引导下，按基质蛋白的转运方式进入线粒体基质后，由转肽酶切除导向序列，然后通过构型的变化或与别的蛋白结合形成复合物后再插入到内膜中，详细机理尚不清楚。
图7-17中的P70是线粒体外膜的一个重要的蛋白质, 通过体外实验获得有关外膜蛋白转运的一些线索。在P70的N-端有一个短的基质导向序列,紧随其后是一段较长的、强疏水性氨基酸序列。实验中,如果将疏水性氨基酸序列缺失, P70进入线粒体基质, 并且其基质导向序列依然连接在一起。这一结果提示, 长的疏水性氨基酸序列可作为停止转运信号, 既防止了外膜蛋白进入线粒体基质, 又作为锚定序列将外膜蛋白锚定在外膜上。正常情况下,外膜蛋白N-端的基质导向序列和长的疏水性序列都不会被切除。
图7-17 线粒体内膜、外膜的导向序列
7.3.3 线粒体蛋白转运的实验研究
上面所讨论的线粒体蛋白的转运方式已得到许多实验的支持。
■ 线粒体蛋白转运的实验证明
通过脉冲示踪研究发现酵母线粒体蛋白合成之后存在于胞质溶胶中,后来逐渐进入线粒体各部位, 通过无细胞系统进一步证明这一结果。
■ 转运中间体与导向序列的特异性研究
在线粒体蛋白转运中一个很重要的中间过程是基质导向序列穿过内外膜，如果能够证明线粒体基质蛋白正在穿过内外膜通道形成的中间体的存在则是对上述转运机制的最有力的证明。
另外，线粒体导向序列对所引导的蛋白质是否具特异性也是人们所关心的问题。
科学家通过实验证明了中间体的存在,同时也证明了导肽没有特异性。
7.4 线粒体的功能----氧化磷酸化作用
线粒体是真核生物氧化代谢的部位，是糖、脂肪和氨基酸最终氧化放能的场所。最终氧化的共同途径是三羧酸循环和呼吸链的氧化磷酸化。
7.4.1 真核细胞中的氧化作用(oxidation)
葡萄糖和脂肪酸是真核细胞能量的主要来源，细胞通过对葡萄糖的代谢获取能量。葡萄糖进入细胞后先在细胞质中通过酵解作用生成丙酮酸，如果有氧存在时，
丙酮酸进入线粒体基质经过三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化，最后生成ATP和水。如果没有氧，丙酮酸经过发酵生成乳酸(图7-18)。
图7-18真核细胞中碳水化合物代谢俯瞰
■ 葡萄糖酵解生成丙酮酸
细胞质中的葡萄糖(或糖原)在一系列酶的催化下生成丙酮酸的过程称为
反应的主要过程包括∶①葡萄糖在磷酸化酶的作用下形成1，6二磷酸果糖，此过程需要消耗两个ATP；②二磷酸6-碳糖被裂解生成两个3-碳糖；③三碳糖被逐步转变成丙酮
酸(图7-19)。
图7-19 葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸的过程
■ 线粒体中乙酰CoA的生成
● 丙酮酸生成乙酰CoA
细胞质膜中由糖酵解生成的丙酮酸分子经过线粒体外膜的孔蛋白进入线粒体膜间隙，然后在运输蛋白的作用下穿过内膜进入线粒体基质。在基质中，丙酮酸被丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)氧化成乙酰辅酶A， 同时生成一分子NADH和一分子CO2。
● 脂肪酸在线粒体基质中通过β氧化途径(β-oxidation pathway)循环氧化生成乙酰辅酶A。
生物需要能量时首先利用多糖，必要时也会利用脂肪。脂肪被水解生成脂肪酸后进入线粒体。每两个脂肪酸碳产生一分子乙酰辅酶A，同时产生一分子NADH、一分子FADH2(图7-20)。
图7-20 脂肪酸氧化
脂肪酸氧化的第一步是与辅酶A的巯基(-SH)结合而被激活。这一反应发生在脂肪酸的脂酰基团在线粒体内膜运输蛋白帮助下穿过内膜之后。在线粒体中，脂酰CoA经过β氧化循环，每循环一次，脱去两个C，产生一分子乙酰CoA进入TCA循环，同时产生一分子NADH、一分子FADH2。
● 乙酰辅酶A是线粒体能量代谢的核心分子，无论是糖还是脂肪酸作为能源，都要在线粒体中被转变成乙酰辅酶A才能进入三羧酸循环彻底氧化。
■ 三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle， TCA cycle)
乙酰CoA一旦形成，立即进入线粒体基质的循环氧化途径，即TCA循环。TCA循环又称Krebs循环、柠檬酸循环(图7-21)。每循环一次生成两分子的CO2、一分子GTP、四分子的NADH(连同丙酮酸脱羧形成乙酰CoA时产生的一分子NADH在内)和一分子的FADH2，释放5对电子。
图7-21 TCA循环，特别标出从丙酮酸氧化开始释放的5对用于ATP合成的电
子形成部位
■ 辅酶在能量传递中的作用 ● 能量传递中的辅酶
催化细胞的氧化还原反应中的酶常常利用辅酶作为电子供体或受体，具有这种作用的辅酶是NAD+、NADP+、FAD和FMN(图7-22)。
图7-22 辅酶NAD+、NADP+、FAD和FMN在氧化和还原状态下的结构 在NAD+和NADP+还原期间转移一个质子和两个电子，FAD和FMN还原过程中转移两个质子和两个电子。尽管它们转移的质子数量不同，但是每次转移的电子数量是相同的，都是两个电子。
● TCA循环产生还原型的辅酶
一次TCA循环共产生1分子FADH2、4分子NADH，它们总共接受了5对电子。
这些电子可用于ATP的合成。
● 苹果酸-天冬氨酸穿梭(malate-aspartate shuttle)与甘油磷酸穿梭
(glycerol-phosphate shuttle)，将胞质溶胶中产生的1分子NADH的电子传递到线粒体内膜参与电子传递(图7-23)。
图7-23 甘油-磷酸穿梭
在甘油-磷酸穿梭过程中，电子从NADH转移给二羟丙酮磷酸（DHAP）生成甘油-3-磷酸，进入线粒体膜间隙，甘油3-磷酸被线粒体内膜中的甘油3-磷酸脱氢酶脱氢，使内膜中FAD还原成FADH2。脱氢的甘油3-磷酸又穿梭回到胞质溶胶。FADH2中的电子再转移给线粒体内膜的电子传递链中的电子载体。
7.4.2 呼吸链与电子传递
在三羧酸循环中，乙酰CoA氧化释放的大部分能量都储存在辅酶(NADH和FADH2)分子中。细胞利用线粒体内膜中一系列的电子载体(呼吸链)，伴随着逐步电子传递，将NADH或FADH2进行氧化，逐步收集释放的自由能最后用于ATP的合成，将能量储存在ATP的高能磷酸键。
■ 电子载体(electron carriers)
在电子传递过程中与释放的电子结合并将电子传递下去的物质称为电子载体。参与传递的电子载体有四种∶黄素蛋白、细胞色素、铁硫蛋白和辅酶Q，在这四类电子载体中，除了辅酶Q以外，接受和提供电子的氧化还原中心都是与蛋白相连的辅基。
● 黄素蛋白是由一条多肽结合1个辅基组成的酶类，
每个辅基能够接受和提供两个质子和电子(图7-22)。
● 细胞色素(cytochromes) 细胞色素是含有血红素辅基(图7-24)的一类蛋白质。在氧化还原过程中，血红素基团的铁原子可以传递单个的电子。血红素中的铁通过Fe3+和 Fe2+两种状态的变化传递电子；在还原反应时，铁原子由Fe3+状态转变成Fe2+状态；在氧化反应中，铁由Fe2+转变成Fe3+。
图7-24 细胞色素c的血红素基团的结构及氧化还原状态的变化
四个卟啉环都含有侧链,不同的细胞色素所含侧链不同。图中所示是细胞色素c,血红素与多肽的两个半胱氨酸共价结合,但在大多数细胞色素分子中,血红素并
不与多肽共价结合。
● 铁硫蛋白是含铁的蛋白质，也是细胞色素类蛋白。在铁硫蛋白分子的中央结合的不是血红素而是铁和硫，称为铁-硫中心(iron-sulfur centers， 图7-25)。
图7-25 两种类型的铁硫蛋白的结构 (a)2Fe-2S型铁硫蛋白; (b)4Fe-4S型铁硫蛋白
醌(uniquinone UQ)或辅酶Q(coenzyme Q) 辅酶Q是一种脂溶性的分子，含有
长长的疏水链，由五碳类戊二醇构成。如同黄素蛋白，每一个醌能够接受和提供两个电子和质子(图7-26)，部分还原的称为半醌，完全还原的称为全醌(UQH2)。
图7-26 辅酶Q的氧化和还原形式
辅酶Q的氧化还原分两步进行，先接受一个电子，得到部分还原，称为半醌，再得到一个电子，成为完全还原的醌，称为全醌。全醌失去一个电子是部分氧化，成为半醌，两个电子全部失去，即完全氧化则称为还原型的醌。
■ 氧化还原电位与载体排列顺序
● 氧还电位(oxidation-reduction potentials， redox potentials)
不同的还原剂具有不同的电子传递电位，而氧化与还原又是偶联的，如NAD+
和NADH.它们的差别主要是电子数量不同，所以二者间就有一个电位差，即氧还
图7-27 电子传递链中几种电子载体及电子传递
图中给出各电子载体近似的氧还电位，并标出了电子对沿呼吸链向分子氧传递形成的自由能，垂直箭头线表示产生的能量足够驱使质子穿过线粒体内膜，其后可为ATP合成提供能量。
图中每一个载体都是从呼吸链中上一个载体获得电子被还原，而上一个载体由于失去电子被氧化，因此电子是从一个载体传向另一个载体，直至最终的受体被还原为止，在该呼吸链中的最终的受体是O2，接收电子后生成水。
■ 呼吸链的组成和排列
呼吸链由四种复合物、细胞色素c和辅酶Q组成。辅酶Q和细胞色素c是独立存在的，四种复合物又都是由几种不同的蛋白组成的多蛋白复合体(图7-28，表7-5)，功能是参与氧化还原作用，由于这些复合物在线粒体内膜中不停地移动，所以它们没有稳定的结构。
● 复合物I又称NADH 脱氢酶(NADH dehydrogenase)或NADH-CoQ 还原酶复合物， 功能是催化一对电子从NADH传递给CoQ，一对电子从复合物Ⅰ传递时伴随着4个质子被传递到膜间隙。
● 复合物Ⅱ(complex Ⅱ) 复合物Ⅱ又称为琥珀酸脱氢酶(succinate
图7-29 细胞色素氧化酶对电子与质子传递
(a)细胞色素氧化酶c中电子传递路线; (b)推测的O2被还原成水的中间过程
■ 递氢体与电化学梯度的建立 ● 递氢体
组成呼吸链的成员中除了电子载体外,有些还具有将氢质子跨膜传递到膜间隙的作用,将能够传递氢质子的复合物称为递氢体,或称递质子体。在呼吸链的四个复合物中,复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ既是电子载体,又是递氢体; 复合物Ⅱ只是电子载体,而不是递氢体。
什么是递氢体?有什么作用?
● 电化学梯度(electrochemical gradient)
质子跨膜转运使得膜间隙积累了大量的质子，建立了质子梯度。由于膜间隙质
子梯度的建立， 使内膜两侧发生两个显著的变化∶线粒体膜间隙产生大量的正电荷，而线粒体基质产生大量的负电荷，使内膜两侧形成电位差；第二是两侧氢离子浓度的不同因而产生pH梯度(ΔpH)，这两种梯度合称为电化学梯度(electrochemical gradient)。
7.4.3 氧化磷酸化:ATP形成机制
氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)是指在活细胞中伴随着呼吸链的氧化作用所发生的能量转换和ATP的形成过程。
■ 呼吸链含有三个氧化磷酸化偶联位点 ● 电子传递与ATP合成偶联的假设
早在20世纪30年代， Vladimir Belitzer首先提出电子传递与ATP合成偶联的假设。他在体外测定肌组织制备物合成ATP与氧消耗比值时发现，呼吸链每传递一对电子至少可合成两个ATP。后来有人发现P/O比值(形成的ATP数与每个还原氧的比值)接近3，也就是说可合成三分子ATP。
● 氧化磷酸化偶联位点
根据对呼吸链中不同复合物间氧化还原电位的研究，发现复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ每传递一对电子，释放的自由能都足够合成一分子ATP，因此将复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ看成是呼吸链中电子传递与氧化磷酸化偶联的三个位点。
如果以FADH2作为电子供体，则只有两个ATP合成偶联位点。因为FADH2
提供的电子是经复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ传递的，而复合物Ⅱ不能作为ATP合成的偶联位点，所以只有两个偶联位点，这就意味着由FADH2作为电子供体时，只能合成两分子的ATP。
● 实验证明
上述ATP合成的数量和偶联位点得到实验的支持。如将分离的线粒体内膜小泡与抗霉素(antimycin)一起温育，由于抗霉素阻止电子通过细胞色素b-c1(复合物Ⅲ)，NADH释放的电子只能传递到辅酶Q，其结果，每传递一对电子只合成一分
子ATP。因此可以推论复合物Ⅰ是ATP合成的偶联位点。用同样的方法证明复合物Ⅲ和复合物Ⅳ也都是ATP合成与电子传递偶联位点。
■ 偶联因子1(coupling factor 1)的发现及功能预测
● 发现: 在二十世纪七十年代初，Humberto-Fernandez Moran 用负染技术检查分离的线粒体时发现:线粒体内膜的基质一侧的表面附着一层球形颗粒，球形颗粒通过柄与内膜相连(图7-30)。几年后，Efraim Racker分离到内膜上的颗粒，称为偶联因子1，简称F1。
图7-30 ATP偶联因子电镜照片
牛心脏线粒体的负染电镜照片，可见球形颗粒通过小柄附着在线粒体内膜嵴上。
● 功能预测
Racker发现这种颗粒很像水解ATP的酶，即ATPase，这似乎是一个特别的发现，为什么线粒体内膜需要如此多的水解ATP的酶?
如果按照常规的方式思考所发现颗粒的问题,似难理解线粒体内膜上需要ATP水解酶,如果将ATP的水解看成是ATP合成的相反过程,F1球形颗粒的功能就显而易见了:它含有ATP合成的功能位点,即ATPase既能催化ATP的水解,又能催化ATP的合成,到底行使何种功能,视反应条件而定。
● 实验证明
通过体外实验证明上述的推测是正确的，现在将该酶称为ATP合酶。
请设计一个实验证明ATPase既能催化ATP的水解，又能催化ATP的合成 ● 线粒体ATP合酶的发现和功能预测及实验证实表明,在科学研究中，不能总是按常规思维去认识事物，反向理论也有很重要的作用。
■ ATP合酶功能的鉴定: 线粒体膜重建实验
为了证明F1具有ATP合酶的作用，人们试图进行线粒体膜的重建实验，主要是将线粒体内膜与其嵴上的F1颗粒分离出来，重新装配后研究F1的功能。
实验的结果确证从线粒体内膜中分离的F1颗粒具有偶联电子传递和ATP合成的功能。
请推测线粒体膜重建实验是如何进行的?
■ 的结构和功能 ● 电镜下的结构
从电镜照片(图7-31)看， 线粒体内膜内侧的F1颗粒结构可分为两个基本部分:F1(头部，head section)、F0(基部，base section)，在F1和F0之间有一个细细的柄部(stalk section)。
图7-31 ATP合酶的形态
(a) 电镜照片; (b)根据电镜照片绘制的模式图和各部分的大小。
● 组成
F1颗粒是一个多组分的结构，将它称为F0F1 ATP酶复合物， 或ATP合酶，在分离状态下具有ATP水解酶的活性，在结合状态下具有ATP合成酶的活性。除了线粒体中有ATP合酶外，植物叶绿体的类囊体和好氧细菌都有ATP合酶的同源物，线粒体ATP合酶有F0和F1两部分组成(图7-32)， 主要功能是进行ATP的合成。也有学者将它看成是线粒体内膜呼吸链的第五个复合物(complex Ⅴ)。
图7-32 ATP合酶的结构和组成
■ 氧化磷酸化偶联机理:化学渗透假说
关于氧化磷酸化的偶联机理，先后提出过几种假说，如化学偶联假说(chemical coupling hypothesis)和构象偶联假说(conformational coupling hypothesis)，这些假说由于证据不足得不到公认。
英国生物化学家P.Mitchell 于1961年提出了化学渗透偶联假说(chemiosmotic 解释氧化磷酸化的偶联机理。该学说认为:在电子传递过程中, 伴随着质子从线粒体内膜的里层向外层转移, 形成跨膜的氢离子梯度,这种势能驱动了氧化磷酸化反应(提供了动力), 合成了ATP。这一学说具有大量的实验支持，
得到公认并获得了1978年诺贝尔奖。化学渗透学说可以很好地说明线粒体内膜中电子传递、质子电化学梯度建立、ADP磷酸化的关系(图7-33)。
图7-33 线粒体在有氧呼吸中的主要作用
化学渗透假说的主要内容是什么?主呼吸链每传递一对电子会将多少氢质子传递到膜间隙?次呼吸链呢?
■ ATP合酶合成ATP的机理
● 结合变构模型(binding-change model)
ATP合酶合成ATP的分子机理的研究一直是研究的热点， 为多数人接受的ATP合酶合成ATP的模型是“结合变构模型”。该模型认为F1中的γ亚基作为C亚基旋转中心中固定的转动杆， 旋转时会引起αβ复合物构型的改变。有三种不同的构型，对ATP和ADP具有不同的结合能力: ①O型几乎不与ATP、ADP和Pi结合;②L型同ADP和Pi的结合较强;③T型与ADP和Pi的结合很紧，并能自动形成ATP，并能与ATP牢牢结合。当γ亚基旋转并将αβ复合物转变成O型则会释放ATP(图7-34)。
图7-34 结合变构模型
什么是结合变构模型?
● 定子（stator）和转子（rotor）
Timothy等人提出了一个ATP合酶中能量转化过程的模型（图7-35），该模型认为由abα3β3δ组成了“定子（stator）”，cγε则形成“转子（rotor）”。当H+质子穿过a和c之间的通道时产生了力矩，从而推动了转子与定子间的相对转动，这样在F1中合成了ATP。
图7-35 F0 F1-ATP合酶作用机理图解
● γ亚基旋转的离体培养证明
目前已经可以在光学显微镜下观察到F1中γ亚基的旋转运动(图7-36)，但现在还没有直接的证据显示在F0中有某些亚基作旋转运动。
图7-36 F1和γ旋转的实验证明
实验中对F1进行人工改造， 使之带上组氨酸(每个亚基一个)，由于组氨酸能够同覆盖有金属还原剂(Ni)的玻片结合， 因此可使F1固定到这种玻片上。通过人工的方法将γ结合上一条荧光标记的肌动蛋白纤维， 然后在供给ATP的情况下用荧光显微镜观察γ亚基的转动。
7.5 线粒体的遗传、增殖和起源
7.5.1 线粒体遗传
线粒体是一种半自主性的细胞器，它除了有自己的遗传物质--线粒体DNA外，还有蛋白质合成系统(mRNA、rRNA、tRNA)和线粒体核糖体等。线粒体中的蛋白质只有少数几种是线粒体基因编码的，大多数线粒体蛋白质还是由核基因编码。所以线粒体的生物合成涉及两个彼此分开的遗传系统。
■ 线粒体的基因组
线粒体DNA(mt DNA)是双链环状分子(图7-37)，基因组的大小变化很大，动物细胞线粒体基因组较小，约～16.5kb，每个细胞中有几百个线粒体，每个线粒体有多个DNA拷贝， mtDNA通常与线粒体内膜结合在一起。
人的线粒体基因没有发现内含子，但在酵母线粒体至少两个基因中发现有内含子，如细胞色素氧化酶复合物亚基Ⅰ蛋白基因中就有9个内含子。
图7-37 人的线粒体基因组 tRNA基因用相应氨基酸的三个字母表示
■ 线粒体基因及线粒体DNA的复制和转录 ● 线粒体基因
在人的线粒体DNA中有两个线粒体rRNA基因: 12S rRNA和16S rRNA 基因、22种线粒体合成蛋白质所需的tRNA基因和13种编码蛋白质的基因。
由于不同生物线粒体基因组大小不同，遗传信息量也不相同(表7-6)。
表7-6 已鉴定的线粒体基因
注: +：表示存在；-：表示不存在；*：某些真菌可编码6个亚基。 ● mtDNA复制
线粒体DNA在核
基因编码的DNA聚合酶的作用下以D-环方式进行复制，这种DNA聚合酶是线粒体特异的。线粒体的复制期主要在细胞周期的S期和G2期，与细胞周期同步。
● mtDNA转录
线粒体DNA是对称转录的， 即在线粒体DNA的H链(重链)和L链(轻链)上各有一个启动区，从各自的启动区开始全长对称转录合成前体RNA，经切割加工后履行生物学功能。
■ 线粒体密码 ● 特异密码
线粒体使用核基因的通用密码，但也有些例外(表7-7)。
表7-7 线粒体中特殊遗传密码
● 线粒体的蛋白质合成
基本上属于原核类型,具有原核生物蛋白质合成的特点，如∶mRNA的转录和翻译是在同一时间和地点进行、蛋白质合成的起始tRNA与原核生物的相同、蛋白质合成对药物的敏感性与细菌一样。如氯霉素可抑制线粒体的蛋白质合成,而不抑制细胞质的蛋白质合成; 放线菌酮可抑制细胞质蛋白质的合成而不抑制线粒体蛋白质的合成。
■ 两套遗传体系的协同性
通过离体实验发现两套遗传体系的遗传机制不同。如放
线菌酮是细胞质蛋白质合成抑制剂，但是对细胞器蛋白质的翻译却没有作用。另外，一些抗生素，如氯霉素、四环素、红霉素等能够抑制线粒体蛋白质的合成，但对细胞质蛋白质合成没有多大影响。通过对转录的抑制研究，发现线粒体基因转录的RNA聚合酶也是特异的(图7-38)。
图7-38 线粒体蛋白的生物合成
粗箭头所指是蛋白质合成抑制剂作用位点，线粒体与细胞核基因转录的抑制剂
是不同的。
7.5.2 线粒体的增殖与起源
■ 线粒体增殖的方式 ● 线粒体增殖的几种假说
关于线粒体增殖， 曾提出过三种解释:①现有线粒体生长到一定的大小就要开始分裂，形成两个小的、新的线粒体;②旧的线粒体被吞噬，细胞内利用脂、蛋白、DNA等重新合成线粒体;③利用其他的膜，如质膜、核膜、内质网膜等重新装配新的线粒体。
● 显微镜观察的结果
在显微镜下观察到生活细胞中线粒体的分裂(图7-39)，支持了第一种观点:线粒体通过分裂进行增殖。
图7-39 脂肪细胞中正在分裂的线粒体电镜照片
● 实验证明
为了证明显微镜下观察到的线粒体分裂增殖的可靠性，1965年David Luck通过放射性标记实验，进一步支持了线粒体分裂增殖的观点。
请推测David Luck通过什么样的实验证明线粒体是通过分裂增殖的?实验过程如何?
■ 线粒体起源
关于线粒体的起源有两种假说:内共生学说和非内共生学说。
● 内共生学说endosymbiont hypothesis)认为线粒体来源于细菌，即细菌被真核生物吞噬后，在长期的共生过程中，通过演变，形成了线粒体(图7-40)。
图7-40 线粒体的进化途径
● 非内共生学说
又称细胞内分化学说。认为线粒体的发生是质膜内陷的结果。 ● 过氧化物酶体(peroxisome)
1954年，在电子显微镜下检查肾小管时发现一种膜结合的颗粒(图7-41)，直径
约为
0.5～1.0μm。由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)，并有两种主要类型∶过氧化物酶体和乙醛酸循环体(glyoxysomes)，后者只在植物中发现。
图7-41 动物细胞中的过氧化物酶体
图示鼠肝细胞的过氧化物酶体的电子显微镜照片，每一个微体中有
一个晶核，
动物细胞微体中的晶核几乎都是尿酸氧化酶。
7.6 过氧化物酶体(peroxisome)
1954年，在电子显微镜下检查肾小管时发现一种膜结合的颗粒(图7-41)，直径约为0.5～1.0μm。由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)。微体有两种主要类型∶过氧化物酶体和乙醛酸循环体(glyoxysomes),后者只在植物中发现。
图7-41 动物细胞中的过氧化物酶体
图示鼠肝细胞的过氧化物酶体的电子显微镜照片,每一个微体中有一个晶核,动
物细胞微体中的晶核几乎都是尿酸氧化酶。
7.6.1 过氧化物酶体的发现及所含酶类 ■ 过氧化物酶体的发现
过氧化物酶体、溶酶体都是de Duve 和他的同事发现的，发现的过程很简单，但是实验的设计却给我们以极大的启发。
● 离心分离实验
de Duve和他的同事通过梯度离心分离到溶酶体之后发现至少有一种酶与溶酶体酶的性质不同: 尿酸氧化酶不是酸性水解酶，但离心时总是与酸性水解酶在一起， 只是沉降行为稍有不同。
通过蔗糖密度梯度离心，发现尿酸氧化酶存在的密度区是1.25g/cm3，而线粒体和溶酶体分别是1.19g/cm3和1.20g/cm3～1.24g/cm3，由于密度差异太小，而溶酶体自身的密度范围又很宽，如何将尿酸氧化酶与溶酶体的酶分开?
他们根据一次偶然的实验观察，设计了一个很好的方法:用一种去垢剂Triton WR1339注射小鼠，这种去垢剂在细胞内主要积累在溶酶体中，并使溶酶体的浮力密度降低到1.1-1.14g/cm3，这样就可以将尿酸氧化酶与溶酶体和线粒体分开。
● 酸性磷酸酶和过氧化氢酶的释放实验
用去垢剂(毛地黄皂苷)破坏细胞器使之释放酸性磷酸酶和过氧化氢酶。实验结果表明要加十倍量的去垢剂才能释放过氧化氢酶(图7-42)，这就说明溶酶体和过氧化物酶体是两种不同的细胞器，两种细胞器的膜对去垢剂的耐受性是不同的。
图7-42 酸性磷酸酶和过氧化氢酶释放实验
过氧化物酶体是怎样被发现的? 涉及哪些技术关键？ ● 过氧化物酶体的酶类
过氧化物酶体含有丰富的酶类，目前已知的有40余种，主要是氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶(表7-8)。
表7-8 微体中发现的主要酶类
说明：＋：存在，-;：不存在；空白：未测。
● 氧化酶(oxidase)氧化酶作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢:
RH2 + O2 → R + H2O2
● 过氧化氢酶(catalase) 过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，它的作用是使过氧化氢还原成水: 2H2O2 → O2 + 2H2O
7.6.2 过氧化物酶体的功能 ● 使毒性物质失活
这种作用是过氧化氢酶利用过氧化氢氧化各种底物， 如酚、甲酸、甲醛和乙醇等，氧化的结果使这些有毒性的物质变成无毒性的物质，同时也使H2O2进一步转变成无毒的H2O。这种解毒作用对于肝、肾特别重要， 例如人们饮入的乙醇几乎有一半是以这种方式被氧化成乙醛的，从而解除了乙醇对细胞的毒性作用。
● 对氧浓度的调节作用
过氧化物酶体与线粒体对氧的敏感性是不一样的，线粒体氧化所需的最佳氧浓度为2%左右，增加氧浓度，并不提高线粒体的氧化能力。过氧化物酶体的氧化率是随氧张力增强而成正比地提高(图7-43)。因此，在低浓度氧的条件下，线粒体利用氧的能力比过氧化物酶体强，但在高浓度氧的情况下，过氧化物酶体的氧化反应占主导地位，这种特性使过氧化物酶体具有使细胞免受高浓度氧的毒性作用。
图7-43 过氧化物酶体和线粒体中氧浓度与呼吸速率的关系
● 脂肪酸的氧化
动物组织中大约有25～50%的脂肪酸是在过氧化物酶体中氧化的，其他则是在线粒体中氧化的。另外，由于过氧化物酶体中有与磷脂合成相关的酶，所以过氧化物酶体也参与脂的合成。
● 含氮物质的代谢
在大多数动物细胞中，尿酸氧化酶(urate oxidase)对于尿酸的氧化是必需的。尿酸是核苷酸和某些蛋白质降解代谢的产物，尿酸氧化酶可将这种代谢废物进一步氧化去除。另外，过氧化物酶体还参与其他的氮代谢，如转氨酶(aminotransferase)催化氨基的转移。
7.6.3 过氧化物酶体生物发生
过氧化物酶体也象线粒体一样通过二裂法进行增殖， 所需的蛋白质和脂都是转运而来(图7-44)。
图7-44 过氧化物酶体的生物发生
7. 线粒体与过氧化物酶体
细胞的生存需要两个基本的要素∶构成细胞结构的化学元件和能量。生物从食物中获取能量，根据对氧的需要情况分为两种类型∶厌氧的，即不需要氧；好氧的，即需要氧的参与。在真核生物中，需氧的能量转化过程与线粒体有关，并且伴随着一系列的化学反应；而在原核生物中，能量转化与细胞质膜相关。
1850年发现的一种细胞器，1898年命名。是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所(图7-1)。
过氧化物酶体是细胞内另一个需要氧的细胞器，不过过氧化物酶体需要氧不是用于ATP的合成而是用于有毒物质的氧化，对线粒体具有氧调节作用。
图7-1 线粒体结构及功能示意图
7.1 线粒体的形态结构
线粒体是能够在光学显微镜进行观察的显微结构，它具有渗透性，在低渗溶液中会膨胀，而在高渗溶液中能够收缩。
7.1.1 线粒体的发现与功能研究
人们对线粒体的研究有一个多世纪的历史。
● 1850年，德国生物学家Rudolph Kölliker第一个发现线粒体， 并推测∶这种颗粒是由半透性的膜包被的。
● 1898年对线粒体进行命名。
● 1900年，Leonor Michaelis用染料Janus green对肝细胞进行染色，发现细胞消耗氧之后，线粒体的颜色逐渐消失了，从而提示线粒体具有氧化还原反应的作用。
后又经过几十年的研究, 逐步证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化的作用,从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的主要部位。
7.1.2 线粒体的形态结构
■ 线粒体的形态和分布 ● 大小:
线粒体的形状多种多样， 一般呈线状(图7-2)，也有粒状或短线状。
图7-2 电子显微镜观察的蝙蝠胰腺细胞线粒体
● 数量:
在不同类型的细胞中线粒体的数目相差很大， 但在同一类型的细胞中数目相对稳定。有些细胞中只有一个线粒体，有些则有几十、几百、甚至几千个线粒体。
● 分布
在多数细胞中，线粒体均匀分布在整个细胞质中，但在某些些细胞中，线粒体的分布是不均一的。
线粒体较多分布在需要ATP的部位(如肌细胞和精细胞， 图7-3);或较为集中分布在有较多氧化反应底物的区域，如脂肪滴(图7-4)，因为脂肪滴中有许多要被氧化的脂肪。
图 7-3 肌细胞和精子的尾部聚集较多的线粒体， 以提供能量
图7-4 线粒体包围着脂肪滴，内有大量要被氧化的脂肪
● 存在方式
线粒体在细胞中并非都是单个存在的，有时可形成由几个线粒体构成的网络结构，有些线粒体具有分支,可以相互交错在一起。如通过相差显微镜检查完整的肝细胞,发现线粒体并非是单个存在的,而是以交织的网络状态存在(图7-5)。
图7-5 细胞中线粒体分支交织连接而成的网状二维结构
7.2 线粒体的结构与化学组成 7.2.1 线粒体的结构
线粒体由内、外两层彼此平行和高度特化的膜包围而成， 内外膜都是典型的单位膜。线粒体外膜(outer membrane)起界膜作用，线粒体内膜(inner membrane)向内皱折形成嵴(cristae)，嵴上有一些颗粒朝向线粒体基质，这些颗粒称为F1颗粒(F1 particle)，似把手状。线粒体的外膜和内膜将线粒体分成两个不同的区室:一个是膜间间隙(intermembrane space)，是两个膜之间的空隙;另一个是线粒体基质(matrix)，它是由内膜包裹的空间(图7-6)。
图7-6 线粒体结构模式图
7.2.2 线粒体膜通透性
很早就认识到线粒体的膜具有半透性，通过对半透性的研究导致线粒体各组分分离方法的建立。
■ 线粒体通透性研究
将线粒体放在100 mM蔗糖溶液中，蔗糖穿过外膜进入线粒体的膜间间隙；然后将线粒体取出测定线粒体内部蔗糖的平均浓度，结果只有50 mM， 比环境中蔗糖的浓度低。据此推测:线粒体外膜对蔗糖是通透的，而内膜对蔗糖是不通透的(图7-7)。
图7-7 线粒体通透性测定
左:将线粒体置于含有100 mM的蔗糖溶液中; 中:蔗糖穿过线粒体外膜，达到平衡;右:将线粒体从蔗糖溶液中取出，测定线粒体中蔗糖的浓度。如果测得线粒体的蔗糖平均浓度是50 mM，就可以推测:100mM的蔗糖仅仅穿过了线粒体外膜，而线粒体中有一半流动的液体在线粒体基质，由于内膜对蔗糖不通透，所以测得的
线粒体平均浓度只有50 mM。
■ 线粒体各组分的分离
由于线粒体外膜的通透性比内膜高，利用这一性质，Donal Parsons 和他的同事最先建立了分离线粒体内膜、外膜及其他组分的方法(图7-8)，
图7-8 线粒体组分的分离
首先将线粒体置于低渗溶液中使外膜破裂，此时线粒体内膜和基质(线粒体质)仍结合在一起，通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂毛地黄皂苷处理线粒体质，破坏线粒体内膜，释放线粒体基质，破裂的内膜重新闭合形成小泡，其表面有F1颗粒。
请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一行特性，设计分离线粒体各组份的方法
7.2.3 线粒体各部分的化学组成和特性
■ 线粒体的化学组成
经过对线粒体各结构组分的生化分析， 线粒体的化学组分主要是由蛋白质、
● 膜间隙 线粒体内膜和外膜之间的间隙称为膜间隙， 宽6～8 nm，由于外膜通透性很强，而内膜的通透性又很低，所以膜间隙中的化学成分很多，几乎接近胞质溶胶。功能是建立和维持氢质子梯度。
● 线粒体基质 内膜和嵴包围着的线粒体内部空间是线粒体基质，与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中；此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。
比较线粒体外膜、内膜、膜间隙和基质的化学特性和功能的主要差别
7.2.4 线粒体内膜的主动运输系统
由于线粒体对于大多数亲水物质的透性极低，所以它必须具备特殊的主动运输系统，完成下列运输作用:
①糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；
②线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A必须运输到细胞质中，它们分别是细胞质中葡萄糖和脂肪酸的前体物质;
③线粒体产生的ATP必须进入到胞质溶胶，以便供给细胞反应所需的能量，同时，ATP水解形成的ADP和Pi又要被运入线粒体作为氧化磷酸化的底物。
■ 丙酮酸、脂肪酸、Pi等的运输
在线粒体内膜上具有完善的运输系统,主要是运输蛋白和一些起促进运输作用的脂类(如心磷脂)。运输系统也包括参与电子传递和氢质子传递的复合物,内膜上有运输丙酮酸、脂肪酸和特殊氨基酸的运输蛋白,其中某些运输蛋白(包括同向和逆向)的运输作用是靠质子梯度驱动的(图7-9)。
图7-9 线粒体内膜中的运输系统
■ 线粒体对细胞内Ca2+的调节
线粒体、内质网和细胞外基质都是Ca2+的储藏地，在内质网、肌质网和细胞质膜上都有Ca2+泵的存在。线粒体内膜上有两种类型的Ca2+运输系统，能够将Ca2+输入到线粒体基质中，或
将Ca2+从线粒体基质运输到膜间隙(图7-10)。
图7-10 线粒体的两种Ca2+离子运输系统
系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质;系统2是通过与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。
7.3 导向信号与线粒体蛋白定位
线粒体中的蛋白质绝大多数都是核基因编码，在细胞质的游离核糖体上合成后运输到线粒体的(表7-3)。
表7-3 细胞质中合成的某些线粒体蛋白质
7.3.1 蛋白质寻靶(protein targeting)和蛋白质分选(protein sorting)
■ 蛋白质的两种转运方式
细胞质中的核糖体在合成蛋白质时有两种可能的存在状态，一种是在蛋白质合成的全过程一直保持游离状态（实际上是与细胞骨架结合在一起的），这种核糖体称为游离核糖体(free ribosomes)。另一种情况是核糖体在合成蛋白质的初始阶段处于自由状态，但是随着肽链的合成，核糖体被引导到内质网上与内质网结合在一起，这种核糖体称为。这两种核糖体上合成的蛋白质不仅在细胞内的去向不同，它们的转运方式也是不同的。
● 翻译后转运(post-translational translocation)与蛋白质寻靶
游离核糖体上合成的蛋白质释放到胞质溶胶后被运送到不同的部位， 即先合成，后运输。由于在游离核糖体上合成的蛋白质在合成释放之后需要自己寻找目的地，因此又称为蛋白质寻靶(7-11)。
图7-11 蛋白质翻译后转运
定位在线粒体、叶绿体、细胞核、细胞质、过氧化物酶体的蛋白质在游离核糖体上合成后释放到胞质溶胶中，进入细胞核的蛋白质通过核孔运输，与定位到其
他翻译后转运的细胞器蛋白的运输机制不同。
● 与蛋白质分选
膜结合核糖体上合成的蛋白质通过定位信号，一边翻译，一边进入内质网，由于这种转运定位是在蛋白质翻译的同时进行的，故称为共翻译转运(图7-12)。在膜结合核糖体上合成的蛋白质通过信号肽，经过连续的膜系统转运分选才能到达最终的目的地，这一过程又称为蛋白质分选。
图7-12 蛋白质的共翻译转运
膜结合核糖体合成的蛋白质经内质网、高尔基体进行转运，运输的目的地包括
内质网、高尔基体、溶酶体、细胞质膜、细胞外基质等。
■ 导向序列(targeting sequence)与信号序列(signal sequence)
● 导向序列
将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号称为导向信号(targeting signal)，或导向序列(targeting sequence)，由于这一段序列是氨基酸组成的肽，所以又称为转运肽(transit peptide)，或。
● 信号序列
将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列(signal
sequence)，将组成该序列的肽称为信号肽（signal peptide)。
在不需要特别区分时，可将它们统称为信号序列或信号肽。
比较导向序列与信号序列有什么不同7.3.2 线粒体蛋白转运
构成线粒体的蛋白主要是核基因编码的,少量是线粒体基因编码的,无论是核基因还是线粒体基因编码的蛋白质都要转运定位。线粒体有四个组成部分,其中有两层膜,所以由细胞质核糖体合成的蛋白质转运到线粒体基质必须穿过两层膜障碍(图7-13)。
图7-13 线粒体蛋白转运的部位
■ 线粒体基质蛋白(mitochondrial matrix protein)转运
线粒体基质蛋白， 除极少数外， 都是游离核糖体合成， 并通过转运肽转运进来的，转运过程十分复杂(图7-14)。
图7-14 蛋白质输入线粒体基质
■ 线粒体膜间隙蛋白的转运
线粒体膜间隙蛋白，如细胞色素c的定位需要两个导向序列，位于N端最前面的为基质导向序列(matrix-targeting sequence)，其后还有第二个导向序列，即膜间隙导向序列(intermembrane-space-targeting sequence)，功能是将蛋白质定位于内膜或膜间隙，这类蛋白有两种转运定位方式。
● 保守性寻靶(conservative targeting) 前体蛋白在N-端的基质导向序列引导下采用与线粒体基质蛋白同样的运输方式，将前体蛋白转运到线粒体基质，在基质中由转肽酶切除基质导向序列后， 膜间隙导向序列就成了N端的导向序列， 它能够识别内膜的受体和转运通道蛋白，引导蛋白质穿过内膜，进入线粒体膜间隙，然后由
线粒体膜间隙中的转肽酶将膜间隙导向序列切除(图7-15)。
图7-15 线粒体内膜蛋白的保守性寻靶，详见正文
● 非保守性寻靶(nonconservative targeting)
与保守性寻靶不同,蛋白质的非保守性寻靶首先在线粒体基质导向序列的引导下,通过线粒体的外膜和内膜,但是疏水的膜间隙导向序列作为停止转运序列
(stop-transfer sequence) 锚定在内膜上,从而阻止了蛋白质的C-末端穿过内膜进入线粒体基质；然后通过蛋白质的扩散作用,锚定在内膜上的蛋白逐渐离开转运通道,
最后在转肽酶的作用下,将膜间隙导向序列切除,蛋白质释放到膜间隙,结合血红素后,蛋白质折叠成正确的构型(图7-16)。
图7-16 线粒体膜间隙蛋白的非保守性寻靶
■ 线粒体内膜和外膜蛋白的转运
图7-17显示线粒体内膜蛋白的N-端只有一个基质导向序列，内膜蛋白在基质导向序列的引导下，按基质蛋白的转运方式进入线粒体基质后，由转肽酶切除导向序列，然后通过构型的变化或与别的蛋白结合形成复合物后再插入到内膜中，详细机理尚不清楚。
图7-17中的P70是线粒体外膜的一个重要的蛋白质, 通过体外实验获得有关外膜蛋白转运的一些线索。在P70的N-端有一个短的基质导向序列,紧随其后是一段较长的、强疏水性氨基酸序列。实验中,如果将疏水性氨基酸序列缺失, P70进入线粒体基质, 并且其基质导向序列依然连接在一起。这一结果提示, 长的疏水性氨基酸序列可作为停止转运信号, 既防止了外膜蛋白进入线粒体基质, 又作为锚定序列将外膜蛋白锚定在外膜上。正常情况下,外膜蛋白N-端的基质导向序列和长的疏水性序列都不会被切除。
图7-17 线粒体内膜、外膜的导向序列
7.3.3 线粒体蛋白转运的实验研究
上面所讨论的线粒体蛋白的转运方式已得到许多实验的支持。
■ 线粒体蛋白转运的实验证明
通过脉冲示踪研究发现酵母线粒体蛋白合成之后存在于胞质溶胶中,后来逐渐进入线粒体各部位, 通过无细胞系统进一步证明这一结果。
■ 转运中间体与导向序列的特异性研究
在线粒体蛋白转运中一个很重要的中间过程是基质导向序列穿过内外膜，如果能够证明线粒体基质蛋白正在穿过内外膜通道形成的中间体的存在则是对上述转运机制的最有力的证明。
另外，线粒体导向序列对所引导的蛋白质是否具特异性也是人们所关心的问题。
科学家通过实验证明了中间体的存在,同时也证明了导肽没有特异性。
7.4 线粒体的功能----氧化磷酸化作用
线粒体是真核生物氧化代谢的部位，是糖、脂肪和氨基酸最终氧化放能的场所。最终氧化的共同途径是三羧酸循环和呼吸链的氧化磷酸化。
7.4.1 真核细胞中的氧化作用(oxidation)
葡萄糖和脂肪酸是真核细胞能量的主要来源，细胞通过对葡萄糖的代谢获取能量。葡萄糖进入细胞后先在细胞质中通过酵解作用生成丙酮酸，如果有氧存在时，
丙酮酸进入线粒体基质经过三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化，最后生成ATP和水。如果没有氧，丙酮酸经过发酵生成乳酸(图7-18)。
图7-18真核细胞中碳水化合物代谢俯瞰
■ 葡萄糖酵解生成丙酮酸
细胞质中的葡萄糖(或糖原)在一系列酶的催化下生成丙酮酸的过程称为
反应的主要过程包括∶①葡萄糖在磷酸化酶的作用下形成1，6二磷酸果糖，此过程需要消耗两个ATP；②二磷酸6-碳糖被裂解生成两个3-碳糖；③三碳糖被逐步转变成丙酮
酸(图7-19)。
图7-19 葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸的过程
■ 线粒体中乙酰CoA的生成
● 丙酮酸生成乙酰CoA
细胞质膜中由糖酵解生成的丙酮酸分子经过线粒体外膜的孔蛋白进入线粒体膜间隙，然后在运输蛋白的作用下穿过内膜进入线粒体基质。在基质中，丙酮酸被丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)氧化成乙酰辅酶A， 同时生成一分子NADH和一分子CO2。
● 脂肪酸在线粒体基质中通过β氧化途径(β-oxidation pathway)循环氧化生成乙酰辅酶A。
生物需要能量时首先利用多糖，必要时也会利用脂肪。脂肪被水解生成脂肪酸后进入线粒体。每两个脂肪酸碳产生一分子乙酰辅酶A，同时产生一分子NADH、一分子FADH2(图7-20)。
图7-20 脂肪酸氧化
脂肪酸氧化的第一步是与辅酶A的巯基(-SH)结合而被激活。这一反应发生在脂肪酸的脂酰基团在线粒体内膜运输蛋白帮助下穿过内膜之后。在线粒体中，脂酰CoA经过β氧化循环，每循环一次，脱去两个C，产生一分子乙酰CoA进入TCA循环，同时产生一分子NADH、一分子FADH2。
● 乙酰辅酶A是线粒体能量代谢的核心分子，无论是糖还是脂肪酸作为能源，都要在线粒体中被转变成乙酰辅酶A才能进入三羧酸循环彻底氧化。
■ 三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle， TCA cycle)
乙酰CoA一旦形成，立即进入线粒体基质的循环氧化途径，即TCA循环。TCA循环又称Krebs循环、柠檬酸循环(图7-21)。每循环一次生成两分子的CO2、一分子GTP、四分子的NADH(连同丙酮酸脱羧形成乙酰CoA时产生的一分子NADH在内)和一分子的FADH2，释放5对电子。
图7-21 TCA循环，特别标出从丙酮酸氧化开始释放的5对用于ATP合成的电
子形成部位
■ 辅酶在能量传递中的作用 ● 能量传递中的辅酶
催化细胞的氧化还原反应中的酶常常利用辅酶作为电子供体或受体，具有这种作用的辅酶是NAD+、NADP+、FAD和FMN(图7-22)。
图7-22 辅酶NAD+、NADP+、FAD和FMN在氧化和还原状态下的结构 在NAD+和NADP+还原期间转移一个质子和两个电子，FAD和FMN还原过程中转移两个质子和两个电子。尽管它们转移的质子数量不同，但是每次转移的电子数量是相同的，都是两个电子。
● TCA循环产生还原型的辅酶
一次TCA循环共产生1分子FADH2、4分子NADH，它们总共接受了5对电子。
这些电子可用于ATP的合成。
● 苹果酸-天冬氨酸穿梭(malate-aspartate shuttle)与甘油磷酸穿梭
(glycerol-phosphate shuttle)，将胞质溶胶中产生的1分子NADH的电子传递到线粒体内膜参与电子传递(图7-23)。
图7-23 甘油-磷酸穿梭
在甘油-磷酸穿梭过程中，电子从NADH转移给二羟丙酮磷酸（DHAP）生成甘油-3-磷酸，进入线粒体膜间隙，甘油3-磷酸被线粒体内膜中的甘油3-磷酸脱氢酶脱氢，使内膜中FAD还原成FADH2。脱氢的甘油3-磷酸又穿梭回到胞质溶胶。FADH2中的电子再转移给线粒体内膜的电子传递链中的电子载体。
7.4.2 呼吸链与电子传递
在三羧酸循环中，乙酰CoA氧化释放的大部分能量都储存在辅酶(NADH和FADH2)分子中。细胞利用线粒体内膜中一系列的电子载体(呼吸链)，伴随着逐步电子传递，将NADH或FADH2进行氧化，逐步收集释放的自由能最后用于ATP的合成，将能量储存在ATP的高能磷酸键。
■ 电子载体(electron carriers)
在电子传递过程中与释放的电子结合并将电子传递下去的物质称为电子载体。参与传递的电子载体有四种∶黄素蛋白、细胞色素、铁硫蛋白和辅酶Q，在这四类电子载体中，除了辅酶Q以外，接受和提供电子的氧化还原中心都是与蛋白相连的辅基。
● 黄素蛋白是由一条多肽结合1个辅基组成的酶类，
每个辅基能够接受和提供两个质子和电子(图7-22)。
● 细胞色素(cytochromes) 细胞色素是含有血红素辅基(图7-24)的一类蛋白质。在氧化还原过程中，血红素基团的铁原子可以传递单个的电子。血红素中的铁通过Fe3+和 Fe2+两种状态的变化传递电子；在还原反应时，铁原子由Fe3+状态转变成Fe2+状态；在氧化反应中，铁由Fe2+转变成Fe3+。
图7-24 细胞色素c的血红素基团的结构及氧化还原状态的变化
四个卟啉环都含有侧链,不同的细胞色素所含侧链不同。图中所示是细胞色素c,血红素与多肽的两个半胱氨酸共价结合,但在大多数细胞色素分子中,血红素并
不与多肽共价结合。
● 铁硫蛋白是含铁的蛋白质，也是细胞色素类蛋白。在铁硫蛋白分子的中央结合的不是血红素而是铁和硫，称为铁-硫中心(iron-sulfur centers， 图7-25)。
图7-25 两种类型的铁硫蛋白的结构 (a)2Fe-2S型铁硫蛋白; (b)4Fe-4S型铁硫蛋白
醌(uniquinone UQ)或辅酶Q(coenzyme Q) 辅酶Q是一种脂溶性的分子，含有
长长的疏水链，由五碳类戊二醇构成。如同黄素蛋白，每一个醌能够接受和提供两个电子和质子(图7-26)，部分还原的称为半醌，完全还原的称为全醌(UQH2)。
图7-26 辅酶Q的氧化和还原形式
辅酶Q的氧化还原分两步进行，先接受一个电子，得到部分还原，称为半醌，再得到一个电子，成为完全还原的醌，称为全醌。全醌失去一个电子是部分氧化，成为半醌，两个电子全部失去，即完全氧化则称为还原型的醌。
■ 氧化还原电位与载体排列顺序
● 氧还电位(oxidation-reduction potentials， redox potentials)
不同的还原剂具有不同的电子传递电位，而氧化与还原又是偶联的，如NAD+
和NADH.它们的差别主要是电子数量不同，所以二者间就有一个电位差，即氧还
图7-27 电子传递链中几种电子载体及电子传递
图中给出各电子载体近似的氧还电位，并标出了电子对沿呼吸链向分子氧传递形成的自由能，垂直箭头线表示产生的能量足够驱使质子穿过线粒体内膜，其后可为ATP合成提供能量。
图中每一个载体都是从呼吸链中上一个载体获得电子被还原，而上一个载体由于失去电子被氧化，因此电子是从一个载体传向另一个载体，直至最终的受体被还原为止，在该呼吸链中的最终的受体是O2，接收电子后生成水。
■ 呼吸链的组成和排列
呼吸链由四种复合物、细胞色素c和辅酶Q组成。辅酶Q和细胞色素c是独立存在的，四种复合物又都是由几种不同的蛋白组成的多蛋白复合体(图7-28，表7-5)，功能是参与氧化还原作用，由于这些复合物在线粒体内膜中不停地移动，所以它们没有稳定的结构。
● 复合物I又称NADH 脱氢酶(NADH dehydrogenase)或NADH-CoQ 还原酶复合物， 功能是催化一对电子从NADH传递给CoQ，一对电子从复合物Ⅰ传递时伴随着4个质子被传递到膜间隙。
● 复合物Ⅱ(complex Ⅱ) 复合物Ⅱ又称为琥珀酸脱氢酶(succinate
图7-29 细胞色素氧化酶对电子与质子传递
(a)细胞色素氧化酶c中电子传递路线; (b)推测的O2被还原成水的中间过程
■ 递氢体与电化学梯度的建立 ● 递氢体
组成呼吸链的成员中除了电子载体外,有些还具有将氢质子跨膜传递到膜间隙的作用,将能够传递氢质子的复合物称为递氢体,或称递质子体。在呼吸链的四个复合物中,复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ既是电子载体,又是递氢体; 复合物Ⅱ只是电子载体,而不是递氢体。
什么是递氢体?有什么作用?
● 电化学梯度(electrochemical gradient)
质子跨膜转运使得膜间隙积累了大量的质子，建立了质子梯度。由于膜间隙质
子梯度的建立， 使内膜两侧发生两个显著的变化∶线粒体膜间隙产生大量的正电荷，而线粒体基质产生大量的负电荷，使内膜两侧形成电位差；第二是两侧氢离子浓度的不同因而产生pH梯度(ΔpH)，这两种梯度合称为电化学梯度(electrochemical gradient)。
7.4.3 氧化磷酸化:ATP形成机制
氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)是指在活细胞中伴随着呼吸链的氧化作用所发生的能量转换和ATP的形成过程。
■ 呼吸链含有三个氧化磷酸化偶联位点 ● 电子传递与ATP合成偶联的假设
早在20世纪30年代， Vladimir Belitzer首先提出电子传递与ATP合成偶联的假设。他在体外测定肌组织制备物合成ATP与氧消耗比值时发现，呼吸链每传递一对电子至少可合成两个ATP。后来有人发现P/O比值(形成的ATP数与每个还原氧的比值)接近3，也就是说可合成三分子ATP。
● 氧化磷酸化偶联位点
根据对呼吸链中不同复合物间氧化还原电位的研究，发现复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ每传递一对电子，释放的自由能都足够合成一分子ATP，因此将复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ看成是呼吸链中电子传递与氧化磷酸化偶联的三个位点。
如果以FADH2作为电子供体，则只有两个ATP合成偶联位点。因为FADH2
提供的电子是经复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ传递的，而复合物Ⅱ不能作为ATP合成的偶联位点，所以只有两个偶联位点，这就意味着由FADH2作为电子供体时，只能合成两分子的ATP。
● 实验证明
上述ATP合成的数量和偶联位点得到实验的支持。如将分离的线粒体内膜小泡与抗霉素(antimycin)一起温育，由于抗霉素阻止电子通过细胞色素b-c1(复合物Ⅲ)，NADH释放的电子只能传递到辅酶Q，其结果，每传递一对电子只合成一分
子ATP。因此可以推论复合物Ⅰ是ATP合成的偶联位点。用同样的方法证明复合物Ⅲ和复合物Ⅳ也都是ATP合成与电子传递偶联位点。
■ 偶联因子1(coupling factor 1)的发现及功能预测
● 发现: 在二十世纪七十年代初，Humberto-Fernandez Moran 用负染技术检查分离的线粒体时发现:线粒体内膜的基质一侧的表面附着一层球形颗粒，球形颗粒通过柄与内膜相连(图7-30)。几年后，Efraim Racker分离到内膜上的颗粒，称为偶联因子1，简称F1。
图7-30 ATP偶联因子电镜照片
牛心脏线粒体的负染电镜照片，可见球形颗粒通过小柄附着在线粒体内膜嵴上。
● 功能预测
Racker发现这种颗粒很像水解ATP的酶，即ATPase，这似乎是一个特别的发现，为什么线粒体内膜需要如此多的水解ATP的酶?
如果按照常规的方式思考所发现颗粒的问题,似难理解线粒体内膜上需要ATP水解酶,如果将ATP的水解看成是ATP合成的相反过程,F1球形颗粒的功能就显而易见了:它含有ATP合成的功能位点,即ATPase既能催化ATP的水解,又能催化ATP的合成,到底行使何种功能,视反应条件而定。
● 实验证明
通过体外实验证明上述的推测是正确的，现在将该酶称为ATP合酶。
请设计一个实验证明ATPase既能催化ATP的水解，又能催化ATP的合成 ● 线粒体ATP合酶的发现和功能预测及实验证实表明,在科学研究中，不能总是按常规思维去认识事物，反向理论也有很重要的作用。
■ ATP合酶功能的鉴定: 线粒体膜重建实验
为了证明F1具有ATP合酶的作用，人们试图进行线粒体膜的重建实验，主要是将线粒体内膜与其嵴上的F1颗粒分离出来，重新装配后研究F1的功能。
实验的结果确证从线粒体内膜中分离的F1颗粒具有偶联电子传递和ATP合成的功能。
请推测线粒体膜重建实验是如何进行的?
■ 的结构和功能 ● 电镜下的结构
从电镜照片(图7-31)看， 线粒体内膜内侧的F1颗粒结构可分为两个基本部分:F1(头部，head section)、F0(基部，base section)，在F1和F0之间有一个细细的柄部(stalk section)。
图7-31 ATP合酶的形态
(a) 电镜照片; (b)根据电镜照片绘制的模式图和各部分的大小。
● 组成
F1颗粒是一个多组分的结构，将它称为F0F1 ATP酶复合物， 或ATP合酶，在分离状态下具有ATP水解酶的活性，在结合状态下具有ATP合成酶的活性。除了线粒体中有ATP合酶外，植物叶绿体的类囊体和好氧细菌都有ATP合酶的同源物，线粒体ATP合酶有F0和F1两部分组成(图7-32)， 主要功能是进行ATP的合成。也有学者将它看成是线粒体内膜呼吸链的第五个复合物(complex Ⅴ)。
图7-32 ATP合酶的结构和组成
■ 氧化磷酸化偶联机理:化学渗透假说
关于氧化磷酸化的偶联机理，先后提出过几种假说，如化学偶联假说(chemical coupling hypothesis)和构象偶联假说(conformational coupling hypothesis)，这些假说由于证据不足得不到公认。
英国生物化学家P.Mitchell 于1961年提出了化学渗透偶联假说(chemiosmotic 解释氧化磷酸化的偶联机理。该学说认为:在电子传递过程中, 伴随着质子从线粒体内膜的里层向外层转移, 形成跨膜的氢离子梯度,这种势能驱动了氧化磷酸化反应(提供了动力), 合成了ATP。这一学说具有大量的实验支持，
得到公认并获得了1978年诺贝尔奖。化学渗透学说可以很好地说明线粒体内膜中电子传递、质子电化学梯度建立、ADP磷酸化的关系(图7-33)。
图7-33 线粒体在有氧呼吸中的主要作用
化学渗透假说的主要内容是什么?主呼吸链每传递一对电子会将多少氢质子传递到膜间隙?次呼吸链呢?
■ ATP合酶合成ATP的机理
● 结合变构模型(binding-change model)
ATP合酶合成ATP的分子机理的研究一直是研究的热点， 为多数人接受的ATP合酶合成ATP的模型是“结合变构模型”。该模型认为F1中的γ亚基作为C亚基旋转中心中固定的转动杆， 旋转时会引起αβ复合物构型的改变。有三种不同的构型，对ATP和ADP具有不同的结合能力: ①O型几乎不与ATP、ADP和Pi结合;②L型同ADP和Pi的结合较强;③T型与ADP和Pi的结合很紧，并能自动形成ATP，并能与ATP牢牢结合。当γ亚基旋转并将αβ复合物转变成O型则会释放ATP(图7-34)。
图7-34 结合变构模型
什么是结合变构模型?
● 定子（stator）和转子（rotor）
Timothy等人提出了一个ATP合酶中能量转化过程的模型（图7-35），该模型认为由abα3β3δ组成了“定子（stator）”，cγε则形成“转子（rotor）”。当H+质子穿过a和c之间的通道时产生了力矩，从而推动了转子与定子间的相对转动，这样在F1中合成了ATP。
图7-35 F0 F1-ATP合酶作用机理图解
● γ亚基旋转的离体培养证明
目前已经可以在光学显微镜下观察到F1中γ亚基的旋转运动(图7-36)，但现在还没有直接的证据显示在F0中有某些亚基作旋转运动。
图7-36 F1和γ旋转的实验证明
实验中对F1进行人工改造， 使之带上组氨酸(每个亚基一个)，由于组氨酸能够同覆盖有金属还原剂(Ni)的玻片结合， 因此可使F1固定到这种玻片上。通过人工的方法将γ结合上一条荧光标记的肌动蛋白纤维， 然后在供给ATP的情况下用荧光显微镜观察γ亚基的转动。
7.5 线粒体的遗传、增殖和起源
7.5.1 线粒体遗传
线粒体是一种半自主性的细胞器，它除了有自己的遗传物质--线粒体DNA外，还有蛋白质合成系统(mRNA、rRNA、tRNA)和线粒体核糖体等。线粒体中的蛋白质只有少数几种是线粒体基因编码的，大多数线粒体蛋白质还是由核基因编码。所以线粒体的生物合成涉及两个彼此分开的遗传系统。
■ 线粒体的基因组
线粒体DNA(mt DNA)是双链环状分子(图7-37)，基因组的大小变化很大，动物细胞线粒体基因组较小，约～16.5kb，每个细胞中有几百个线粒体，每个线粒体有多个DNA拷贝， mtDNA通常与线粒体内膜结合在一起。
人的线粒体基因没有发现内含子，但在酵母线粒体至少两个基因中发现有内含子，如细胞色素氧化酶复合物亚基Ⅰ蛋白基因中就有9个内含子。
图7-37 人的线粒体基因组 tRNA基因用相应氨基酸的三个字母表示
■ 线粒体基因及线粒体DNA的复制和转录 ● 线粒体基因
在人的线粒体DNA中有两个线粒体rRNA基因: 12S rRNA和16S rRNA 基因、22种线粒体合成蛋白质所需的tRNA基因和13种编码蛋白质的基因。
由于不同生物线粒体基因组大小不同，遗传信息量也不相同(表7-6)。
表7-6 已鉴定的线粒体基因
注: +：表示存在；-：表示不存在；*：某些真菌可编码6个亚基。 ● mtDNA复制
线粒体DNA在核
基因编码的DNA聚合酶的作用下以D-环方式进行复制，这种DNA聚合酶是线粒体特异的。线粒体的复制期主要在细胞周期的S期和G2期，与细胞周期同步。
● mtDNA转录
线粒体DNA是对称转录的， 即在线粒体DNA的H链(重链)和L链(轻链)上各有一个启动区，从各自的启动区开始全长对称转录合成前体RNA，经切割加工后履行生物学功能。
■ 线粒体密码 ● 特异密码
线粒体使用核基因的通用密码，但也有些例外(表7-7)。
表7-7 线粒体中特殊遗传密码
● 线粒体的蛋白质合成
基本上属于原核类型,具有原核生物蛋白质合成的特点，如∶mRNA的转录和翻译是在同一时间和地点进行、蛋白质合成的起始tRNA与原核生物的相同、蛋白质合成对药物的敏感性与细菌一样。如氯霉素可抑制线粒体的蛋白质合成,而不抑制细胞质的蛋白质合成; 放线菌酮可抑制细胞质蛋白质的合成而不抑制线粒体蛋白质的合成。
■ 两套遗传体系的协同性
通过离体实验发现两套遗传体系的遗传机制不同。如放
线菌酮是细胞质蛋白质合成抑制剂，但是对细胞器蛋白质的翻译却没有作用。另外，一些抗生素，如氯霉素、四环素、红霉素等能够抑制线粒体蛋白质的合成，但对细胞质蛋白质合成没有多大影响。通过对转录的抑制研究，发现线粒体基因转录的RNA聚合酶也是特异的(图7-38)。
图7-38 线粒体蛋白的生物合成
粗箭头所指是蛋白质合成抑制剂作用位点，线粒体与细胞核基因转录的抑制剂
是不同的。
7.5.2 线粒体的增殖与起源
■ 线粒体增殖的方式 ● 线粒体增殖的几种假说
关于线粒体增殖， 曾提出过三种解释:①现有线粒体生长到一定的大小就要开始分裂，形成两个小的、新的线粒体;②旧的线粒体被吞噬，细胞内利用脂、蛋白、DNA等重新合成线粒体;③利用其他的膜，如质膜、核膜、内质网膜等重新装配新的线粒体。
● 显微镜观察的结果
在显微镜下观察到生活细胞中线粒体的分裂(图7-39)，支持了第一种观点:线粒体通过分裂进行增殖。
图7-39 脂肪细胞中正在分裂的线粒体电镜照片
● 实验证明
为了证明显微镜下观察到的线粒体分裂增殖的可靠性，1965年David Luck通过放射性标记实验，进一步支持了线粒体分裂增殖的观点。
请推测David Luck通过什么样的实验证明线粒体是通过分裂增殖的?实验过程如何?
■ 线粒体起源
关于线粒体的起源有两种假说:内共生学说和非内共生学说。
● 内共生学说endosymbiont hypothesis)认为线粒体来源于细菌，即细菌被真核生物吞噬后，在长期的共生过程中，通过演变，形成了线粒体(图7-40)。
图7-40 线粒体的进化途径
● 非内共生学说
又称细胞内分化学说。认为线粒体的发生是质膜内陷的结果。 ● 过氧化物酶体(peroxisome)
1954年，在电子显微镜下检查肾小管时发现一种膜结合的颗粒(图7-41)，直径
约为
0.5～1.0μm。由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)，并有两种主要类型∶过氧化物酶体和乙醛酸循环体(glyoxysomes)，后者只在植物中发现。
图7-41 动物细胞中的过氧化物酶体
图示鼠肝细胞的过氧化物酶体的电子显微镜照片，每一个微体中有
一个晶核，
动物细胞微体中的晶核几乎都是尿酸氧化酶。
7.6 过氧化物酶体(peroxisome)
1954年，在电子显微镜下检查肾小管时发现一种膜结合的颗粒(图7-41)，直径约为0.5～1.0μm。由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)。微体有两种主要类型∶过氧化物酶体和乙醛酸循环体(glyoxysomes),后者只在植物中发现。
图7-41 动物细胞中的过氧化物酶体
图示鼠肝细胞的过氧化物酶体的电子显微镜照片,每一个微体中有一个晶核,动
物细胞微体中的晶核几乎都是尿酸氧化酶。
7.6.1 过氧化物酶体的发现及所含酶类 ■ 过氧化物酶体的发现
过氧化物酶体、溶酶体都是de Duve 和他的同事发现的，发现的过程很简单，但是实验的设计却给我们以极大的启发。
● 离心分离实验
de Duve和他的同事通过梯度离心分离到溶酶体之后发现至少有一种酶与溶酶体酶的性质不同: 尿酸氧化酶不是酸性水解酶，但离心时总是与酸性水解酶在一起， 只是沉降行为稍有不同。
通过蔗糖密度梯度离心，发现尿酸氧化酶存在的密度区是1.25g/cm3，而线粒体和溶酶体分别是1.19g/cm3和1.20g/cm3～1.24g/cm3，由于密度差异太小，而溶酶体自身的密度范围又很宽，如何将尿酸氧化酶与溶酶体的酶分开?
他们根据一次偶然的实验观察，设计了一个很好的方法:用一种去垢剂Triton WR1339注射小鼠，这种去垢剂在细胞内主要积累在溶酶体中，并使溶酶体的浮力密度降低到1.1-1.14g/cm3，这样就可以将尿酸氧化酶与溶酶体和线粒体分开。
● 酸性磷酸酶和过氧化氢酶的释放实验
用去垢剂(毛地黄皂苷)破坏细胞器使之释放酸性磷酸酶和过氧化氢酶。实验结果表明要加十倍量的去垢剂才能释放过氧化氢酶(图7-42)，这就说明溶酶体和过氧化物酶体是两种不同的细胞器，两种细胞器的膜对去垢剂的耐受性是不同的。
图7-42 酸性磷酸酶和过氧化氢酶释放实验
过氧化物酶体是怎样被发现的? 涉及哪些技术关键？ ● 过氧化物酶体的酶类
过氧化物酶体含有丰富的酶类，目前已知的有40余种，主要是氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶(表7-8)。
表7-8 微体中发现的主要酶类
说明：＋：存在，-;：不存在；空白：未测。
● 氧化酶(oxidase)氧化酶作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢:
RH2 + O2 → R + H2O2
● 过氧化氢酶(catalase) 过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，它的作用是使过氧化氢还原成水: 2H2O2 → O2 + 2H2O
7.6.2 过氧化物酶体的功能 ● 使毒性物质失活
这种作用是过氧化氢酶利用过氧化氢氧化各种底物， 如酚、甲酸、甲醛和乙醇等，氧化的结果使这些有毒性的物质变成无毒性的物质，同时也使H2O2进一步转变成无毒的H2O。这种解毒作用对于肝、肾特别重要， 例如人们饮入的乙醇几乎有一半是以这种方式被氧化成乙醛的，从而解除了乙醇对细胞的毒性作用。
● 对氧浓度的调节作用
过氧化物酶体与线粒体对氧的敏感性是不一样的，线粒体氧化所需的最佳氧浓度为2%左右，增加氧浓度，并不提高线粒体的氧化能力。过氧化物酶体的氧化率是随氧张力增强而成正比地提高(图7-43)。因此，在低浓度氧的条件下，线粒体利用氧的能力比过氧化物酶体强，但在高浓度氧的情况下，过氧化物酶体的氧化反应占主导地位，这种特性使过氧化物酶体具有使细胞免受高浓度氧的毒性作用。
图7-43 过氧化物酶体和线粒体中氧浓度与呼吸速率的关系
● 脂肪酸的氧化
动物组织中大约有25～50%的脂肪酸是在过氧化物酶体中氧化的，其他则是在线粒体中氧化的。另外，由于过氧化物酶体中有与磷脂合成相关的酶，所以过氧化物酶体也参与脂的合成。
● 含氮物质的代谢
在大多数动物细胞中，尿酸氧化酶(urate oxidase)对于尿酸的氧化是必需的。尿酸是核苷酸和某些蛋白质降解代谢的产物，尿酸氧化酶可将这种代谢废物进一步氧化去除。另外，过氧化物酶体还参与其他的氮代谢，如转氨酶(aminotransferase)催化氨基的转移。
7.6.3 过氧化物酶体生物发生
过氧化物酶体也象线粒体一样通过二裂法进行增殖， 所需的蛋白质和脂都是转运而来(图7-44)。
图7-44 过氧化物酶体的生物发生