第4期
2009年8月
第9卷
中国食品学报
JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology
Vol．9No．4Aug．2009
鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究
姜
勇1
纪
2
赟1高莉丽1江怀真
1
赵洪2刘天中
1
（1中国海洋大学食品科学与工程学院
青岛广播电视大学
山东青岛266003
山东青岛266012）
摘要鼠李糖乳杆菌是一类重要的L-乳酸生产菌，研究其发酵条件及其动力学对发酵工艺及其过程控制具有
重要意义。本文针对鼠李糖乳杆菌1.549，通过摇瓶悬浮试验确定其最佳培养条件及发酵培养基组成。在此基础上，研究初始葡萄糖浓度和产物乳酸的积累对发酵过程的影响，建立发酵动力学模型。结果表明，鼠李糖乳杆菌
1.549摇瓶发酵最佳培养条件：温度34℃，种龄8h，接种量5%。由正交试验确定的摇瓶最佳发酵培养基组成：
酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L，乙酸钠2g/L，MgSO40.3g/L，··MnSO4H2O0.03g/L，FeSO47H2O0.03g/L。鼠李糖乳杆菌利用葡萄糖L-乳酸发酵动力学模型结果与本试验结果吻合较好，其乳酸发酵机制属部分生长耦联型。动力学参数揭示，高浓度的初始葡萄糖底物和乳酸的积累对发酵的影响在于其对细胞生长的抑制。关键词文章编号
鼠李糖乳杆菌
乳酸发酵
培养基优化
发酵动力学
1009-7848（2009）04-0057-07
乳酸是食品、医药、化工等工业领域中广泛应用的一种重要有机酸[1～2]。随着聚乳酸作为生物可降解塑料，国内外对高光学纯度的L-乳酸需求越来越大，其市场潜力巨大[3～4]。
发酵法生产乳酸常用的微生物主要有两大类，一类为霉菌，多采用米根霉（Rhizopusoryzae），好氧发酵，可以分泌淀粉酶糖化淀粉，但该法转化率较低，理论值为75%[5～6]；另一类为细菌，多采用乳酸细菌，如德氏乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，采取厌氧或兼性厌氧的方式，以葡萄糖为碳源，不能直接利用淀粉，但转化率高[7]。两类菌各有优势。
无论是采用乳酸细菌发酵还是根霉菌发酵，较一致的结论是，乳酸发酵是一个典型的包括底物抑制和产物抑制的发酵过程。但底物抑制和产物抑制的作用机理是什么，是对细胞生长的抑制，还是直接影响代谢过程，至今尚不清楚[2，8～10]。弄清这种影响机理，对于乳酸发酵过程的优化与控制
收稿日期：2008-08-28
基金项目：教育部留学回国人员启动基金资助项目作者简介：姜勇，男，1979年出生，硕士生通讯作者：刘天中
具有重要意义。
本文以在工业乳酸生产中所应用的鼠李糖乳杆菌为目标，通过乳酸摇瓶发酵试验确定其培养基组成，分批做发酵动力学试验，建立动力学模型，了解其发酵过程中细胞生长和产物生成机制，以期对发酵工艺的改进与控制提供参考数据。
1
1.1
试验方法及动力学模型
菌种
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）
1.549购于中科院微生物所菌种保藏中心。固体斜
面培养基为MRS培养基。液体种子培养基（g/L）：
酪蛋白胨20，酵母膏6，葡萄糖20，乙酸钠2，柠檬酸二铵1，K2HPO42，MgSO40.3，MnSO4·H2O·0.03，FeSO47H2O0.03，pH6.2。0.1MPa、115℃灭菌20min。发酵培养基（g/L）：酪蛋白胨15，酵母膏
4，葡萄糖50，乙酸钠2，柠檬酸二铵1，K2HPO42，MgSO40.3，MnSO4·H2O0.03，FeSO4·7H2O0.03，CaCO330（单独灭菌），pH6.2。0.1MPa、115℃灭菌20min。
1.2试验方法
1.2.1最佳发酵培养基组成的确定由于乳酸菌
58
中国食品学报
2009年第4期
的营养要求高，发酵培养基中所含营养成分较多，所以采用两次正交试验以获得该菌株最适培养基配方。
首先考察悬浮发酵培养基中酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵和K2HPO4对发酵的影响，采用L16（45）正交表做试验。MRS斜面培养鼠李糖乳杆菌36h，接入液体种子培养基，对三角瓶封口，34℃、100r/min，振荡培养8h。发酵培养基按
表示。底物及其产物会对乳酸的生成速率有影响，引入底物对乳酸生成的抑制常数KSP，产物对乳酸生成的抑制常数KPP。用底物限制常数KiP对模型进行修正[11]，假设产物抑制采用指数形式，见式（2）。上述3个参数中，KSP的物理意义是葡萄糖底物对乳酸生成产生明显抑制的最低底物浓度，KPP表示产物乳酸的积累对乳酸产生速率产生明显抑制的最低乳酸浓度，而KiP则表示不发生底物限制乳酸生成的最低葡萄糖底物浓度。
-P/KppSKiPdP=αdX+qeX（2）p，max
（SP）（ip）100mL/250mL三角瓶装液量，接种量5%，用封口
膜封口，34℃、100r/min，振荡培养48h。取样分析。在此基础上，考察悬浮发酵培养基中乙酸钠、··MgSO4、MnSO4H2O、FeSO47H2O组成对发酵的影响。采用L16（45）正交表做试验（方法同前）。
采用酶电极法（SBA-40C型生物传感器，山东省科学院）同时分析发酵液中葡萄糖和L-乳酸的质量浓度（g/L，下同）。细胞浓度以OD600nm值表示。
式中，α———Luedeking-Piret模型中与细胞生长速率相关的常数，其表示细胞的生长速率与产物生成速率的耦联关系；qp，max———最大乳酸比生成速率〔g/（g·h）〕。
发酵过程中底物的消耗根据其代谢流向，采用简化模型式（3）表示。
1.2.2发酵动力学试验在多个250mL三角瓶
中进行平行试验。每2个三角瓶为1组，每组中每个三角瓶取样2次，每个时间点参数值（葡萄糖、乳酸、OD600）为两次测定结果的平均值。试验条件同上，做3个不同初始葡萄糖质量浓度（55、80、
-dS=1dX+1dP+mX
X/SP/S——细胞代谢维持系数。率系数；m—
（3）
式中，YX/S———细胞得率系数；YP/S———产物得式（1）、（2）、（3）即构成乳酸菌乳酸发酵的动力学模型，其中包括12个动力学参数。
模型方程组利用MATLAB程序求解，通过建立目标函数Obj，用单纯形法对3个初始葡萄糖浓度下的发酵动力学同时优化，以确定动力学参数。
110g/L）的发酵动力学试验。1.3
发酵动力学模型的建立
乳酸菌发酵动力学过程包括细胞的生产、葡萄糖消耗以及乳酸生成。
细胞生长采用Monod模型，并考虑到底物限制、产物抑制及高浓度底物的抑制作用对细胞生长的影响，引入底物对细胞生长的抑制常数KiX，产物对细胞生长的抑制常数KPX和底物限制常数
Obj=∑[wx∑（Xcal-Xexp）+wp∑（Pcal-Pexp）
1，2，3
alltime
alltime
22
KSX对模型进行修正[11]，见式（1）。从物理意义上
讲，KiX实际上是葡萄糖底物对细胞生长产生明显抑制的最低底物浓度，KPX是产物乳酸对细胞生长产生明显抑制的最低乳酸浓度，而KSX则表示不
发生底物限制的最低葡萄糖底物浓度。
-P/KμmaxSKiX=eX
dt（KSX+S）（Kix+S）
PX
+ws∑（Scal-Sexp）]
alltime
（4）
式中，wX、wP、wS为权重因子。
2
2.1
结果与讨论
发酵培养基中各种成分对发酵的影响由于乳酸菌的营养要求高，发酵培养基中所
（1）
含营养成分较多，采用两次正交试验获得该菌株最适培养基配方。
综合考察悬浮发酵培养基中酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵和K2HPO4组成下的正交试验L16（45）方案，结果见表1。
式中，X———细胞浓度（g/L）；S———底物（葡萄糖）质量浓度（g/L）；P———产物（乳酸）质量浓度（g/——最大比生长速率（h）。L）；μmax—
-1
产物乳酸的生成采用Luedeking-Piret[12]模型
第9卷第4期鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究59
表1正交试验1方案及结果
Table1
序号
Arrangementsandresultsfororthogonalexperimental1
B
（酵母膏）
A
（酪蛋白胨）
C
（葡萄糖）
D
（柠檬酸二铵）
E
（K2HPO4）
·L-乳酸/gL-1
[***********]41516
均值1均值2均值3均值4极差
1（7.5g/L）
1112（10）2223（12.5）3334（15）44438.50038.50039.00040.5002.000
1（4g/L）2（6）3（8）4（10）[1**********]439.75039.75038.75038.2501.500
1（50g/L）2（75）3（100）4（125）[1**********]144.25040.75037.75033.75010.500
1（1g/L）2（1.5）3（2）4（2.5）[1**********]340.00040.00038.00038.5002.000
1（1g/L）2（1.5）3（2）4（2.5）[1**********]239.00038.50039.50039.5001.000
[***********][1**********]143
表2正交试验1方差分析
Table2
因素
酪蛋白胨/g·L-1酵母提取物/g·L-1葡萄糖/g·L-1柠檬酸二铵/g·L-1·K2HPO4/gL-1误差
偏差平方和
Analysisofvariancesfororthogonalexperiments1
自由度
F比0.1980.1244.3930.2350.051
F0.053.2903.2903.2903.2903.290
显著性
10.7506.750238.75012.7502.750271.75
3333315
*
结果表明，葡萄糖浓度对乳酸发酵影响最显著，影响程度排序：葡萄糖>柠檬酸二铵>酪蛋白胨>酵母膏>K2HPO4。最优条件为A4B1C1D1E3，即酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L。
确定培养基酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵和K2HPO4组成后，以乙酸钠、MgSO4、Mn-··SO4H2O、FeSO47H2O浓度做L16（45）正交试验。其
试验方案和结果分析见表3、表4。
60
中国食品学报
表3
正交试验2方案及结果
2009年第4期
Table3
序号
Arrangementsandresultsfororthogonalexperimental2
B
（MgSO4）
A
（乙酸钠）
C
（MnSO4·H2O）
D
（FeSO4·7H2O）
E
（误差）
·L-乳酸/gL-1
[***********]41516
均值1均值2均值3均值4极差
1（0.5g/L）
1112（1）2223（1.5）3334（2）44439.25039.00037.25039.7502.500
1（0.1g/L）2（0.2）3（0.3）4（0.4）[1**********]438.50038.25040.50038.0002.500
1（0.01g/L）2（0.02）3（0.03）4（0.04）[1**********]138.50039.25040.75036.7504.000
1（0.01g/L）2（0.02）3（0.03）4（0.04）[1**********]338.50039.00039.50038.2501.250
[***********].50038.50040.25039.0002.750
[***********][1**********]039
表4正交试验2方差分析
Table4
因素
乙酸钠
偏差平方和
Analysisofvariancesfororthogonalexperiments2
自由度
F比0.9041.0002.1160.2351.000
F0.059.2809.2809.2809.2809.280
显著性
14.18815.68833.1883.68815.68815.69
333333
MgSO4
·H2OMnSO4
·FeSO47H2O误差误差
结果表明，在试验设定范围内各微量盐对发·酵影响不显著。影响程度排序：MnSO4H2O>Mg-·SO4>乙酸钠>FeSO47H2O。最优条件为A4B3C3D3，
即乙酸钠2g/L，MgSO40.3g/L，MnSO4·H2O0.03·g/L，FeSO47H2O0.03g/L。
综合2次正交试验结果可得鼠李糖乳杆菌
（Lactobacillusrhamnosus）最适发酵培养基组成为：酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L，乙酸钠2g/L，
MgSO40.3g/L，MnSO4·H2O0.03g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L。在最适培养基组成下的发酵试验，平均产酸45g/L左右，对葡萄糖的转化率约90%。
第9卷第4期鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究61
2.2鼠李糖乳杆菌的发酵动力学及其参数估计前述试验表明鼠李糖乳杆菌发酵培养基中，
葡萄糖浓度是显著影响因子。虽然提高培养基中初始葡萄糖浓度有利于提高最终发酵液中的乳酸浓度，进而有利于乳酸的提取。但许多文献表明，培养基中过高的初始葡萄糖浓度对发酵过程产生抑制，从而降低发酵速率。为考察不同初始葡萄糖浓度对发酵过程的影响，做3组不同初始葡萄糖浓度（55、80、110g/L）下乳酸发酵动力学试验。其结果以及模型和参数优化后的计算值见图1～图3。
可以看出，3个不同初始葡萄糖浓度下的试验结果与所建立的模型计算值吻合较好。随着发酵的进行，细胞浓度增加，葡萄糖浓度迅速降低。与之相对应，乳酸含量也迅速增加。初始葡萄糖浓度越低，其发酵时间越短。在细胞生长进入稳定期后含有大量乳酸生成，表明鼠李糖乳杆菌的乳酸产生不完全正比于细胞的生成速率，其发酵机制属部分生长耦联型。通过参数优化，得到发酵动力学参数（见表5）。
表5优化的鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学模型参数
Table5OptimizedkineticmodelparametersforlacticacidfermentationbyLactobacillusrhamnosus
μmax0.283KiP239.137
KiX127.378KSP0.082
KSX1.962KPP56.095
KPX13.368YX/S1.214
α1.298YP/S0.854
qP,max4.285m0.001
底物浓度对细胞生长的抑制常数KiX=
127.378，表明当底物（葡萄糖）质量浓度超过120g/L时，对细胞生长产生明显的抑制作用。底物浓度对乳酸生成的抑制常数KiP=239.137，表明当底
62
中国食品学报
2009年第4期
物（葡萄糖）质量浓度超过239g/L时对乳酸生成产生显著的抑制作用。该浓度远大于底物对细胞生长的抑制浓度（KiX=127.378g/L）。对鼠李糖乳杆菌而言，在高浓度的初始葡萄糖条件下，底物对发酵的影响在于对细胞生长速率的影响。本试验中最大初始葡萄糖质量浓度为110g/L，均小于上述阈值，故不产生明显的底物抑制。
产物的生成与积累对细胞生长的抑制常数
正交试验约90%的转化率。发酵过程中，底物用于乳酸细菌的维持能很少，m只有0.001。
3结论
通过2次正交试验，研究鼠李糖乳杆菌利用
葡萄糖发酵生产乳酸时发酵培养基中酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵、K2HPO4、乙酸钠、··MgSO4、MnSO4H2O、FeSO47H2O浓度对发酵的影响。结果表明，发酵培养基中葡萄糖浓度对乳酸发酵影响最显著。最佳发酵培养基组成：酪蛋白胨
KPX=13.368，表明当产物（乳酸）质量浓度超过13g/L时对细胞生长产生明显的抑制作用。与此相对
应，产物的积累对乳酸生成的抑制常数KPP（或对
葡萄糖消耗速率的抑制常数）为56.095，表明当产物（乳酸）质量浓度积累到57g/L时，产物乳酸的抑制作用明显。该浓度阈值远大于产物积累对细胞生长的抑制浓度（KPX=13.368g/L），说明对于鼠李糖乳杆菌的乳酸发酵，产物对发酵过程的抑制作用在于对细胞生长的抑制。
葡萄糖浓度作为细胞生长的底物限制因子
15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L，乙酸钠2g/L，MgSO40.3g/L，
··MnSO4H2O0.03g/L，FeSO47H2O0.03g/L。在最适培养基组成下的发酵试验，平均产酸45g/L左右，对葡萄糖的转化率为90%。
建立了鼠李糖乳杆菌利用葡萄糖发酵生产
L-乳酸的动力学模型，该模型已考虑初始葡萄糖
浓度和产物乳酸的积累对发酵过程的影响。考察了不同初始葡萄糖浓度对动力学模型的影响，该模型结果与试验结果吻合较好。鼠李糖乳杆菌的乳酸发酵机制属部分生长耦联型。动力学参数揭示高浓度的初始葡萄糖底物和乳酸的积累对发酵的影响是其对细胞生长的抑制。
KSX=1.962g/L，葡萄糖浓度作为乳酸生成的底物限
制因子KSP=0.082g/L，两者都比较小，且远小于初始培养基中的葡萄糖浓度。因此本试验条件下，葡萄糖浓度对细胞生长、乳酸生成都不产生底物限制作用。底物对乳酸的转化率为0.854，接近上述
参考文献
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2.王博彦，金其荣.发酵有机酸生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2000.349～354.3.刘雄伟.乳酸和聚乳酸的最新进展[J].食品与发酵工业，2000，26（3）：61～65.
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第9卷第4期鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究63
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12.LuedekingR，PiretE.Akineticstudyofthelacticacidfermentation：batchprocessatcontrolledpH[J].JBiochem
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StudiesonKineticsofLacticAcidFermentationbyLactobacillusRhamnosus
JiangYong1JiYun1GaoLili1JiangHuaizheng1ZhaoHong2LiuTianzhong1
（1CollegeofFoodScienceandEngineering，OceanUniversityofChina，266003
2
QingdaoTelevisionUniversity，266012）
AbstractLactobacillusrhamnosuisonekindofimportantindustrialbacteriatoproductionL-lactic.Itsfermentation
conditionsandfermentationkineticsareofinterestforprocessscale-upandcontrol.Inthiswork，thefermentationcon-ditionparametersandculturemediumcompositionwereoptimizationinshake-flasksuspensionfermentationforLactobacil-lusrhamnosus1.549.andits
kineticsusingglucosesubstratewassetuptomodelthefermentationprocesseswithdiffer-entinitialglucoseconcentrationof55g/L、80g/Land110g/L.Theresultsshowthattheoptimalcompositionofsubstrateispeptone15g/L，yeast4g/L，glucose50g/L，Diammoniumhydrogencitrate1g/L，K2HPO42g/L，sodiumacetate2g/
··L，MgSO40.3g/L，MnSO4H2O0.03g/L，FeSO47H2O0.03g/L.Themostsuitablefermentationconditionsare34℃，seed
ageof8hoursand5%forinoculumsize.Underabovefermentationconditions，thefinalconcentrationoftheL-lacticacidisaround45g/Landthemaximalyieldbasedoninitialglucoseconcentrationisabout90%.Simulatedresultshavewellaccordancewithkineticmodel.TheoptimizedkineticparametersindicatedthattheformationoflacticacidbyLacto-bacillusrhamnosusispartiallygrowthassociated.Theinhibitionofbothhighconcentrationinitialglucoseandlacticacidaccumulatedonfermentationdoesnotactedonsubstrateconsumptionandproductionformationitselfdirectly，butonthecellgrowth.
Keywordsics
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LactobacillusrhamnosusLacticacidfermentationOptimizationofculturemediumFermentationkinet-
卫生部公布新批准26种食品添加剂新品种
卫生部公布了新批准的26种食品添加剂新品种，包括食品添加剂1种，营养强化剂2种，食品用酶制剂7种，食品用香料16种以及扩大使用范围使用量的食品添加剂32种、营养强化剂16种。
本次公布食品添加剂新品种，是在卫生部等9部门联合开展的全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂的专项整治行动中，对申报的食品添加剂新品种以及扩大使用范围使用量的食品添加剂，按《食品安全法》规定的技术上确有必要和对健康无害的要求审查通过，并公开征求社会意见后确定的。这些食品添加剂新品种可以用于食品生产经营活动。
（消息来源：北京晚报）
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JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology
Vol．9No．4Aug．2009
鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究
姜
勇1
纪
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1
赵洪2刘天中
1
（1中国海洋大学食品科学与工程学院
青岛广播电视大学
山东青岛266003
山东青岛266012）
摘要鼠李糖乳杆菌是一类重要的L-乳酸生产菌，研究其发酵条件及其动力学对发酵工艺及其过程控制具有
重要意义。本文针对鼠李糖乳杆菌1.549，通过摇瓶悬浮试验确定其最佳培养条件及发酵培养基组成。在此基础上，研究初始葡萄糖浓度和产物乳酸的积累对发酵过程的影响，建立发酵动力学模型。结果表明，鼠李糖乳杆菌
1.549摇瓶发酵最佳培养条件：温度34℃，种龄8h，接种量5%。由正交试验确定的摇瓶最佳发酵培养基组成：
酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L，乙酸钠2g/L，MgSO40.3g/L，··MnSO4H2O0.03g/L，FeSO47H2O0.03g/L。鼠李糖乳杆菌利用葡萄糖L-乳酸发酵动力学模型结果与本试验结果吻合较好，其乳酸发酵机制属部分生长耦联型。动力学参数揭示，高浓度的初始葡萄糖底物和乳酸的积累对发酵的影响在于其对细胞生长的抑制。关键词文章编号
鼠李糖乳杆菌
乳酸发酵
培养基优化
发酵动力学
1009-7848（2009）04-0057-07
乳酸是食品、医药、化工等工业领域中广泛应用的一种重要有机酸[1～2]。随着聚乳酸作为生物可降解塑料，国内外对高光学纯度的L-乳酸需求越来越大，其市场潜力巨大[3～4]。
发酵法生产乳酸常用的微生物主要有两大类，一类为霉菌，多采用米根霉（Rhizopusoryzae），好氧发酵，可以分泌淀粉酶糖化淀粉，但该法转化率较低，理论值为75%[5～6]；另一类为细菌，多采用乳酸细菌，如德氏乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，采取厌氧或兼性厌氧的方式，以葡萄糖为碳源，不能直接利用淀粉，但转化率高[7]。两类菌各有优势。
无论是采用乳酸细菌发酵还是根霉菌发酵，较一致的结论是，乳酸发酵是一个典型的包括底物抑制和产物抑制的发酵过程。但底物抑制和产物抑制的作用机理是什么，是对细胞生长的抑制，还是直接影响代谢过程，至今尚不清楚[2，8～10]。弄清这种影响机理，对于乳酸发酵过程的优化与控制
收稿日期：2008-08-28
基金项目：教育部留学回国人员启动基金资助项目作者简介：姜勇，男，1979年出生，硕士生通讯作者：刘天中
具有重要意义。
本文以在工业乳酸生产中所应用的鼠李糖乳杆菌为目标，通过乳酸摇瓶发酵试验确定其培养基组成，分批做发酵动力学试验，建立动力学模型，了解其发酵过程中细胞生长和产物生成机制，以期对发酵工艺的改进与控制提供参考数据。
1
1.1
试验方法及动力学模型
菌种
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）
1.549购于中科院微生物所菌种保藏中心。固体斜
面培养基为MRS培养基。液体种子培养基（g/L）：
酪蛋白胨20，酵母膏6，葡萄糖20，乙酸钠2，柠檬酸二铵1，K2HPO42，MgSO40.3，MnSO4·H2O·0.03，FeSO47H2O0.03，pH6.2。0.1MPa、115℃灭菌20min。发酵培养基（g/L）：酪蛋白胨15，酵母膏
4，葡萄糖50，乙酸钠2，柠檬酸二铵1，K2HPO42，MgSO40.3，MnSO4·H2O0.03，FeSO4·7H2O0.03，CaCO330（单独灭菌），pH6.2。0.1MPa、115℃灭菌20min。
1.2试验方法
1.2.1最佳发酵培养基组成的确定由于乳酸菌
58
中国食品学报
2009年第4期
的营养要求高，发酵培养基中所含营养成分较多，所以采用两次正交试验以获得该菌株最适培养基配方。
首先考察悬浮发酵培养基中酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵和K2HPO4对发酵的影响，采用L16（45）正交表做试验。MRS斜面培养鼠李糖乳杆菌36h，接入液体种子培养基，对三角瓶封口，34℃、100r/min，振荡培养8h。发酵培养基按
表示。底物及其产物会对乳酸的生成速率有影响，引入底物对乳酸生成的抑制常数KSP，产物对乳酸生成的抑制常数KPP。用底物限制常数KiP对模型进行修正[11]，假设产物抑制采用指数形式，见式（2）。上述3个参数中，KSP的物理意义是葡萄糖底物对乳酸生成产生明显抑制的最低底物浓度，KPP表示产物乳酸的积累对乳酸产生速率产生明显抑制的最低乳酸浓度，而KiP则表示不发生底物限制乳酸生成的最低葡萄糖底物浓度。
-P/KppSKiPdP=αdX+qeX（2）p，max
（SP）（ip）100mL/250mL三角瓶装液量，接种量5%，用封口
膜封口，34℃、100r/min，振荡培养48h。取样分析。在此基础上，考察悬浮发酵培养基中乙酸钠、··MgSO4、MnSO4H2O、FeSO47H2O组成对发酵的影响。采用L16（45）正交表做试验（方法同前）。
采用酶电极法（SBA-40C型生物传感器，山东省科学院）同时分析发酵液中葡萄糖和L-乳酸的质量浓度（g/L，下同）。细胞浓度以OD600nm值表示。
式中，α———Luedeking-Piret模型中与细胞生长速率相关的常数，其表示细胞的生长速率与产物生成速率的耦联关系；qp，max———最大乳酸比生成速率〔g/（g·h）〕。
发酵过程中底物的消耗根据其代谢流向，采用简化模型式（3）表示。
1.2.2发酵动力学试验在多个250mL三角瓶
中进行平行试验。每2个三角瓶为1组，每组中每个三角瓶取样2次，每个时间点参数值（葡萄糖、乳酸、OD600）为两次测定结果的平均值。试验条件同上，做3个不同初始葡萄糖质量浓度（55、80、
-dS=1dX+1dP+mX
X/SP/S——细胞代谢维持系数。率系数；m—
（3）
式中，YX/S———细胞得率系数；YP/S———产物得式（1）、（2）、（3）即构成乳酸菌乳酸发酵的动力学模型，其中包括12个动力学参数。
模型方程组利用MATLAB程序求解，通过建立目标函数Obj，用单纯形法对3个初始葡萄糖浓度下的发酵动力学同时优化，以确定动力学参数。
110g/L）的发酵动力学试验。1.3
发酵动力学模型的建立
乳酸菌发酵动力学过程包括细胞的生产、葡萄糖消耗以及乳酸生成。
细胞生长采用Monod模型，并考虑到底物限制、产物抑制及高浓度底物的抑制作用对细胞生长的影响，引入底物对细胞生长的抑制常数KiX，产物对细胞生长的抑制常数KPX和底物限制常数
Obj=∑[wx∑（Xcal-Xexp）+wp∑（Pcal-Pexp）
1，2，3
alltime
alltime
22
KSX对模型进行修正[11]，见式（1）。从物理意义上
讲，KiX实际上是葡萄糖底物对细胞生长产生明显抑制的最低底物浓度，KPX是产物乳酸对细胞生长产生明显抑制的最低乳酸浓度，而KSX则表示不
发生底物限制的最低葡萄糖底物浓度。
-P/KμmaxSKiX=eX
dt（KSX+S）（Kix+S）
PX
+ws∑（Scal-Sexp）]
alltime
（4）
式中，wX、wP、wS为权重因子。
2
2.1
结果与讨论
发酵培养基中各种成分对发酵的影响由于乳酸菌的营养要求高，发酵培养基中所
（1）
含营养成分较多，采用两次正交试验获得该菌株最适培养基配方。
综合考察悬浮发酵培养基中酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵和K2HPO4组成下的正交试验L16（45）方案，结果见表1。
式中，X———细胞浓度（g/L）；S———底物（葡萄糖）质量浓度（g/L）；P———产物（乳酸）质量浓度（g/——最大比生长速率（h）。L）；μmax—
-1
产物乳酸的生成采用Luedeking-Piret[12]模型
第9卷第4期鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究59
表1正交试验1方案及结果
Table1
序号
Arrangementsandresultsfororthogonalexperimental1
B
（酵母膏）
A
（酪蛋白胨）
C
（葡萄糖）
D
（柠檬酸二铵）
E
（K2HPO4）
·L-乳酸/gL-1
[***********]41516
均值1均值2均值3均值4极差
1（7.5g/L）
1112（10）2223（12.5）3334（15）44438.50038.50039.00040.5002.000
1（4g/L）2（6）3（8）4（10）[1**********]439.75039.75038.75038.2501.500
1（50g/L）2（75）3（100）4（125）[1**********]144.25040.75037.75033.75010.500
1（1g/L）2（1.5）3（2）4（2.5）[1**********]340.00040.00038.00038.5002.000
1（1g/L）2（1.5）3（2）4（2.5）[1**********]239.00038.50039.50039.5001.000
[***********][1**********]143
表2正交试验1方差分析
Table2
因素
酪蛋白胨/g·L-1酵母提取物/g·L-1葡萄糖/g·L-1柠檬酸二铵/g·L-1·K2HPO4/gL-1误差
偏差平方和
Analysisofvariancesfororthogonalexperiments1
自由度
F比0.1980.1244.3930.2350.051
F0.053.2903.2903.2903.2903.290
显著性
10.7506.750238.75012.7502.750271.75
3333315
*
结果表明，葡萄糖浓度对乳酸发酵影响最显著，影响程度排序：葡萄糖>柠檬酸二铵>酪蛋白胨>酵母膏>K2HPO4。最优条件为A4B1C1D1E3，即酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L。
确定培养基酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵和K2HPO4组成后，以乙酸钠、MgSO4、Mn-··SO4H2O、FeSO47H2O浓度做L16（45）正交试验。其
试验方案和结果分析见表3、表4。
60
中国食品学报
表3
正交试验2方案及结果
2009年第4期
Table3
序号
Arrangementsandresultsfororthogonalexperimental2
B
（MgSO4）
A
（乙酸钠）
C
（MnSO4·H2O）
D
（FeSO4·7H2O）
E
（误差）
·L-乳酸/gL-1
[***********]41516
均值1均值2均值3均值4极差
1（0.5g/L）
1112（1）2223（1.5）3334（2）44439.25039.00037.25039.7502.500
1（0.1g/L）2（0.2）3（0.3）4（0.4）[1**********]438.50038.25040.50038.0002.500
1（0.01g/L）2（0.02）3（0.03）4（0.04）[1**********]138.50039.25040.75036.7504.000
1（0.01g/L）2（0.02）3（0.03）4（0.04）[1**********]338.50039.00039.50038.2501.250
[***********].50038.50040.25039.0002.750
[***********][1**********]039
表4正交试验2方差分析
Table4
因素
乙酸钠
偏差平方和
Analysisofvariancesfororthogonalexperiments2
自由度
F比0.9041.0002.1160.2351.000
F0.059.2809.2809.2809.2809.280
显著性
14.18815.68833.1883.68815.68815.69
333333
MgSO4
·H2OMnSO4
·FeSO47H2O误差误差
结果表明，在试验设定范围内各微量盐对发·酵影响不显著。影响程度排序：MnSO4H2O>Mg-·SO4>乙酸钠>FeSO47H2O。最优条件为A4B3C3D3，
即乙酸钠2g/L，MgSO40.3g/L，MnSO4·H2O0.03·g/L，FeSO47H2O0.03g/L。
综合2次正交试验结果可得鼠李糖乳杆菌
（Lactobacillusrhamnosus）最适发酵培养基组成为：酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L，乙酸钠2g/L，
MgSO40.3g/L，MnSO4·H2O0.03g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L。在最适培养基组成下的发酵试验，平均产酸45g/L左右，对葡萄糖的转化率约90%。
第9卷第4期鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学的研究61
2.2鼠李糖乳杆菌的发酵动力学及其参数估计前述试验表明鼠李糖乳杆菌发酵培养基中，
葡萄糖浓度是显著影响因子。虽然提高培养基中初始葡萄糖浓度有利于提高最终发酵液中的乳酸浓度，进而有利于乳酸的提取。但许多文献表明，培养基中过高的初始葡萄糖浓度对发酵过程产生抑制，从而降低发酵速率。为考察不同初始葡萄糖浓度对发酵过程的影响，做3组不同初始葡萄糖浓度（55、80、110g/L）下乳酸发酵动力学试验。其结果以及模型和参数优化后的计算值见图1～图3。
可以看出，3个不同初始葡萄糖浓度下的试验结果与所建立的模型计算值吻合较好。随着发酵的进行，细胞浓度增加，葡萄糖浓度迅速降低。与之相对应，乳酸含量也迅速增加。初始葡萄糖浓度越低，其发酵时间越短。在细胞生长进入稳定期后含有大量乳酸生成，表明鼠李糖乳杆菌的乳酸产生不完全正比于细胞的生成速率，其发酵机制属部分生长耦联型。通过参数优化，得到发酵动力学参数（见表5）。
表5优化的鼠李糖乳杆菌乳酸发酵动力学模型参数
Table5OptimizedkineticmodelparametersforlacticacidfermentationbyLactobacillusrhamnosus
μmax0.283KiP239.137
KiX127.378KSP0.082
KSX1.962KPP56.095
KPX13.368YX/S1.214
α1.298YP/S0.854
qP,max4.285m0.001
底物浓度对细胞生长的抑制常数KiX=
127.378，表明当底物（葡萄糖）质量浓度超过120g/L时，对细胞生长产生明显的抑制作用。底物浓度对乳酸生成的抑制常数KiP=239.137，表明当底
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中国食品学报
2009年第4期
物（葡萄糖）质量浓度超过239g/L时对乳酸生成产生显著的抑制作用。该浓度远大于底物对细胞生长的抑制浓度（KiX=127.378g/L）。对鼠李糖乳杆菌而言，在高浓度的初始葡萄糖条件下，底物对发酵的影响在于对细胞生长速率的影响。本试验中最大初始葡萄糖质量浓度为110g/L，均小于上述阈值，故不产生明显的底物抑制。
产物的生成与积累对细胞生长的抑制常数
正交试验约90%的转化率。发酵过程中，底物用于乳酸细菌的维持能很少，m只有0.001。
3结论
通过2次正交试验，研究鼠李糖乳杆菌利用
葡萄糖发酵生产乳酸时发酵培养基中酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵、K2HPO4、乙酸钠、··MgSO4、MnSO4H2O、FeSO47H2O浓度对发酵的影响。结果表明，发酵培养基中葡萄糖浓度对乳酸发酵影响最显著。最佳发酵培养基组成：酪蛋白胨
KPX=13.368，表明当产物（乳酸）质量浓度超过13g/L时对细胞生长产生明显的抑制作用。与此相对
应，产物的积累对乳酸生成的抑制常数KPP（或对
葡萄糖消耗速率的抑制常数）为56.095，表明当产物（乳酸）质量浓度积累到57g/L时，产物乳酸的抑制作用明显。该浓度阈值远大于产物积累对细胞生长的抑制浓度（KPX=13.368g/L），说明对于鼠李糖乳杆菌的乳酸发酵，产物对发酵过程的抑制作用在于对细胞生长的抑制。
葡萄糖浓度作为细胞生长的底物限制因子
15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO42g/L，乙酸钠2g/L，MgSO40.3g/L，
··MnSO4H2O0.03g/L，FeSO47H2O0.03g/L。在最适培养基组成下的发酵试验，平均产酸45g/L左右，对葡萄糖的转化率为90%。
建立了鼠李糖乳杆菌利用葡萄糖发酵生产
L-乳酸的动力学模型，该模型已考虑初始葡萄糖
浓度和产物乳酸的积累对发酵过程的影响。考察了不同初始葡萄糖浓度对动力学模型的影响，该模型结果与试验结果吻合较好。鼠李糖乳杆菌的乳酸发酵机制属部分生长耦联型。动力学参数揭示高浓度的初始葡萄糖底物和乳酸的积累对发酵的影响是其对细胞生长的抑制。
KSX=1.962g/L，葡萄糖浓度作为乳酸生成的底物限
制因子KSP=0.082g/L，两者都比较小，且远小于初始培养基中的葡萄糖浓度。因此本试验条件下，葡萄糖浓度对细胞生长、乳酸生成都不产生底物限制作用。底物对乳酸的转化率为0.854，接近上述
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StudiesonKineticsofLacticAcidFermentationbyLactobacillusRhamnosus
JiangYong1JiYun1GaoLili1JiangHuaizheng1ZhaoHong2LiuTianzhong1
（1CollegeofFoodScienceandEngineering，OceanUniversityofChina，266003
2
QingdaoTelevisionUniversity，266012）
AbstractLactobacillusrhamnosuisonekindofimportantindustrialbacteriatoproductionL-lactic.Itsfermentation
conditionsandfermentationkineticsareofinterestforprocessscale-upandcontrol.Inthiswork，thefermentationcon-ditionparametersandculturemediumcompositionwereoptimizationinshake-flasksuspensionfermentationforLactobacil-lusrhamnosus1.549.andits
kineticsusingglucosesubstratewassetuptomodelthefermentationprocesseswithdiffer-entinitialglucoseconcentrationof55g/L、80g/Land110g/L.Theresultsshowthattheoptimalcompositionofsubstrateispeptone15g/L，yeast4g/L，glucose50g/L，Diammoniumhydrogencitrate1g/L，K2HPO42g/L，sodiumacetate2g/
··L，MgSO40.3g/L，MnSO4H2O0.03g/L，FeSO47H2O0.03g/L.Themostsuitablefermentationconditionsare34℃，seed
ageof8hoursand5%forinoculumsize.Underabovefermentationconditions，thefinalconcentrationoftheL-lacticacidisaround45g/Landthemaximalyieldbasedoninitialglucoseconcentrationisabout90%.Simulatedresultshavewellaccordancewithkineticmodel.TheoptimizedkineticparametersindicatedthattheformationoflacticacidbyLacto-bacillusrhamnosusispartiallygrowthassociated.Theinhibitionofbothhighconcentrationinitialglucoseandlacticacidaccumulatedonfermentationdoesnotactedonsubstrateconsumptionandproductionformationitselfdirectly，butonthecellgrowth.
Keywordsics
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LactobacillusrhamnosusLacticacidfermentationOptimizationofculturemediumFermentationkinet-
卫生部公布新批准26种食品添加剂新品种
卫生部公布了新批准的26种食品添加剂新品种，包括食品添加剂1种，营养强化剂2种，食品用酶制剂7种，食品用香料16种以及扩大使用范围使用量的食品添加剂32种、营养强化剂16种。
本次公布食品添加剂新品种，是在卫生部等9部门联合开展的全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂的专项整治行动中，对申报的食品添加剂新品种以及扩大使用范围使用量的食品添加剂，按《食品安全法》规定的技术上确有必要和对健康无害的要求审查通过，并公开征求社会意见后确定的。这些食品添加剂新品种可以用于食品生产经营活动。
（消息来源：北京晚报）
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