土 壤 通 报Vol . 37, No . 3第37卷第3期
Jun . , 2006
Chinese Journal of Soil Science 2006年6月
土壤多酚氧化酶性质研究及意义
郝建朝, 吴沿友
1
23
, 连 宾, 吴春笃
12
(1. 贵州大学发酵工程与生物制药重点实验室, 贵州贵阳 550003; 2. 江苏大学农业装备工程研究院, 江苏镇江 212013)
摘 要:土壤多酚氧化酶是一类以铜、锰为活性中心的氧化还原酶。本文以滨江带生态湿地土壤为材料, 系统研究了土壤多酚氧化酶活性随着干湿状态、溶解氧、pH 值、温度而变化的情况。结果表明, 湿土壤比风干土壤和烘干土壤活性高; 氧气充足时活性高于缺氧时活性; 多酚氧化酶活性在强酸强碱条件下失活, pH 值(9～11) 或温度45℃时活性最高。通过对土壤多酚氧化酶性质研究, 对一些现象进行了初步解释, 如荷花出淤泥而不染成因; 为加快土壤多酚氧化酶在环境修复中应用和开发它的广阔应用前景奠定基础。
关 键 词:土壤; 多酚氧化酶; 性质; 温度; pH 值
中图分类号:S 15412 文献标识码:A 文章编号:056423945(2006) 0320470205
土壤多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, 简称PP O )
主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物及动植物残
[1, 2, 3, 4, 5]
体分解释放的酶, 它是一种复合性酶。土壤多酚氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌, 醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成大小分子量不等有机质和色素, 完成土壤芳香族化合物循[6, 7, 8]环。利用土壤多酚氧化酶的反应机制, 人们把多
[9]
酚氧化酶用于土壤环境修复, 丁克强麦草对菲污染土壤修复。[10]
解产生酚类物质, , 体造成污染。的意义。, 存在潜在危险, 故目前只限于把土壤多酚氧化酶的活性测试出来, 而对它的性质研究甚少, 这就限制了土壤中多酚氧化酶的应用和快速发展。为了防止植物果实褐变, 人们对植物多酚氧化酶性质研究较多, 这为土壤多酚氧化酶性质研究提供了理论依据。本文通过研究土壤多酚氧化酶活性随着干湿状态、溶解氧、pH 值、温度的变化, 找到了土壤多酚氧化酶催化反应最佳反应
[11]
条件; 对传统测试土壤多酚氧化酶的方法提出了一些建议, 对一些现象进行了初步解释, 如荷花出淤泥而不染成因。这为加快土壤多酚氧化酶在环境修复中应
[12, 13, 14, 15]
用和开发它的广阔应用前景奠定基础。
为北亚热带, 年降雨量达800～1600毫米, 年平均气温
15. 4℃, 全年无霜期为240～260天, 年积温5000～6500℃, 而且四季分明, 适合多种植物生长, 并且此湿地植被以芦苇和鹝草为主。供试土壤性质如表1。
表1 0～30c m (mg kg -1)
1 r of the marsh 0～30c m s oil in K Available Ca 有效镁
Available Mg 有效铜
Available Cu 有效锌
Available Zn 有效铁
Available Fe 有效锰
Available Mn 速效磷
Available
P 有机质
O rganic material 速效氮
Available N 1. 2 采样方法和样品预处理
采样位置处于滨江带湿地中部, 距离堤边约170m , 高程范围在3. 5～3. 75m , 此处芦苇生长茂盛。用便携式土壤采样器从地表向下取0～5c m 、5～10c m 、10～15c m 、15～20c m 、20～25c m 、25～30c m 共六个层次, 取出土壤用镊子把土样中能用肉眼看到的根系和杂物去掉并把每个样本平均分成两份, 一份用于研究酶活性随着层次的变化; 另一份把六个样本混合均匀, 研究土壤多酚氧化酶活性随着土壤干湿状态、溶解氧、pH 值、温度而变化的情况以及土壤的基本性质。最后把土壤装在保鲜袋中放在冰箱内4℃保[16]
存。研究土壤多酚氧化酶活性时, 所选用的土壤是相同土壤, 每个样品平行测试三次。
1 材料与方法
1. 1 滨江带生态湿地基本情况
湿地处于长江中下游平原的镇江北固山脚下, 位于东经119°82′89″, 北纬32°81′59″, 属于东部季风湿润区,
收稿日期:2005204218; 修订日期:2005-07-01基金项目:国家“十五”重大科技专项(2003AA601100-3) 资助
作者简介:郝建朝(1980-) , 男, 河北保定人, 贵州大学在读研究生, 环境生物学。3通讯作者:yanyouwu@ujs . edu . cn
3期 郝建朝等:土壤多酚氧化酶性质研究及意义471
1. 3 多酚氧化酶的测试方法
烘箱中烘干。湿土壤多酚氧化酶活性降低百分率公式为:%×100%。
湿土壤活性
表2 土壤不同状态下多酚氧化酶的活性
Table 2 The activity of PP O in different conditi onal s oil
取1g 湿土样置于50m l 磨口三角瓶中, 然后注入
10m l 1%邻苯三酚溶液, 将磨口三角瓶放在恒温震荡
-1
培养箱中两小时, 震荡速度为170r m in 。研究多酚氧化酶每一个性质时, 除处理样品的方式不同外, 反应样品同时同地进行, 旨在找到不同处理样品方式下多酚氧化酶活性的变化规律, 故我们在室温下进行反应, 恒温震荡培养箱只有做多酚氧化酶随着温度变化时才进行温度控制。如果单纯的测试不同土壤多酚氧化酶活性高低, 为了便于最后比较, 一般培养温度在30℃。震荡培养反应的磨口三角瓶不加塞子。取出后加4m l pH4. 5柠檬酸磷酸缓冲液, 再加入25m l 乙醚萃取, 萃
土壤状态
Soil conditi on
湿土壤
W et s oil 1. 35
风干土壤烘干土壤
A ir drying s oil Heat drying s oil
0. 38
0. 24
毫克没食子素每克土
(mg gallnut /gs oil )
通过表2可知, 湿土壤多酚氧化酶的活性最高, 是风干土壤的3. 5倍, 是烘干土壤5. 6倍。湿土壤和干土壤多酚氧化酶活性相差如此之大, 使我对传统测试多酚氧化酶方法提出疑问。传统土壤多酚氧化酶检测方法中把土壤风干、磨细、过筛, 最后测出它的活性。这可能会使土壤多酚氧化酶活性测试值偏低, 从而遏制它的应用和发展。通过以上分析建议测试土壤多酚, , 一方面可用土壤匀。
表3 湿地不同层次湿土和烘干土壤酶活性和降低率
Table 3 The activity of PP O bet w een wet s oil and dry s oil and reduced percent in wetland
取30m in 。最后将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚
相在紫外分光光度计430nm 处进行比色。再与标准曲线进行对比, 就可以得出1g 湿土样多酚氧化酶的活力。为了在不同样品之间进行比较, 要把湿土样换算成干土样多酚氧化酶的活力。多酚氧化酶的活性以2h 后1g 干土样中紫色没食子素的毫克数表[17, 18, 19]示。1. 4 实验方法1. 4. 1 干湿状态 , 在120℃1. , 按照1. 315. 5℃, 培养震荡的磨口三角瓶不加塞子。1. 4. 2溶解氧 测试土壤多酚氧化酶活性不能严格控制溶氧量, 为了说明氧气浓度对多酚氧化酶活性影响, 规定塞上磨口塞子的锥形瓶为缺氧状态, 直接暴露在空气中反应为氧气充足, 室温为10. 3℃。尽管这种方法不能做到绝对缺氧和读出溶解氧数值, 但是通过测试结果可以说明在不同状态下的变化情况。
1. 4. 3 pH 值 把反应底物邻苯三酚溶液调到不同pH 值, 酸性范围用0. 1mol L
-1
-1
土壤深度
(cm )
烘干土壤Heat drying soil 湿土壤Wet soil
Soil depth 活性(毫克没食子素每克土) 活性(毫克没食子素每克土) 降低率(%)
0～55～1010～1515～2020～250. 0. 0. 1. 1. [1**********]. 0. 0. 0. 0. [1**********]7. 68. 66. 73. 65. 6908673391Activity (mg gallnut /gsoil ) Activity (mg gallnut /gsoil ) Reduced percent (%)
HCl 溶液调节, 碱性范
围用0. 1mol L Na OH 溶液调节。pH 值范围1. 21～13. 5014个等级。按照1. 3方法测试多酚氧化酶的活性。室温为16. 0℃, 培养震荡的磨口三角瓶不加塞子。
1. 4. 4 温 度 按照1. 3方法测试土壤多酚氧化酶
由表3可知, 不同层次湿土壤多酚氧化酶活性降
低百分率是不同的。15～20c m 土壤降幅最高, 可达73. 33%; 25～30c m 土壤降幅最低, 为45. 37%。通过统计分析可知, 湿土壤和烘干土壤六个层次酶活性相关系数为0. 81, α在0. 05置信范围有显著性差异, 湿土壤和烘干土壤酶活性不相关。土壤多酚氧化酶在高温下会失去活性(由后面测试土壤多酚氧化酶随温度变化可以看出) , 烘干土壤在120℃的烘箱中烘干, 多酚氧化酶已经失去活性, 但是为什么烘干土壤还表现出一定活性呢? 土壤成分复杂, 一些具有氧化性的物质也能把邻苯三酚氧化成醌。故测试土壤多酚氧化酶时会包含非酶类物质氧化带来的误差, 并且这种非酶
活性, 只是在振荡培养箱中培养反应温度不同。反应温度分为六个等级, 分别为17℃、25℃、35℃、45℃、50℃、54℃。培养震荡的磨口三角瓶不加塞子。
2 结果与讨论
2. 1 土壤在不同状态下多酚氧化酶的活性
风干的土壤在室温下风干, 烘干土壤在120℃的
472土 壤 通 报 37卷
类物质引起的误差随土壤变化而变化, 随机性很大, 使测试结果不准确。传统的测试方法是以无基质的土壤和无土壤的基质为参比。通过上述分析可知这种对照不科学, 不能反映采样的随机性。为了消除非酶类物质氧化带来的误差, 建议以120℃烘干的土壤为参比, 用湿土壤的活性减去烘干土壤活性就是酶类物质绝对活性, 这样得到的数据更加稳定准确。湿土壤绝对活性可以更好分析土壤中多酚氧化酶活性随着土壤层次变化, 判断根系对土壤多酚氧化酶贡献大小和土壤多酚氧化酶的积累情况, 为土壤多酚氧化酶提取和酶谱分析奠定基础。
2. 2 土壤多酚氧化酶活性随溶解氧变化
2C 6H 3(OH ) 3多酚氧化酶22C 6H 3O 3+3H 2O 2
的表现。因此荷花出淤泥而不染是它本身适应环境的一种表现, 也是自己一种本能。鉴于荷花本身特性, 把荷花用于酚类废水处理有广阔的发展前景。现在一些人工生态湿地已经选择它为优势植物, 一方面可以美化环境; 另一方面可以加快酚类物质转化, 增加土壤肥力。
湿土壤不同层次之间多酚氧化酶活性并不相同, 由表3可知, 0～5c m 湿土壤的活性最低, 15～20c m 湿土壤活性最高, 并且前三个层次活性低, 后三个层次活性高。0～5c m 土壤和大气层接触, 溶氧量高, 下层溶氧量低, 所以测试土壤多酚氧化酶活性高的层次由于溶解氧低而不能完全表现它与空气接触充分的活性。因此要提高土壤底层多酚氧化酶活性必须通一定量氧气, 特别是处理酚类废水的生态湿地。还田的秸秆含有大量木质素, 木质素经过微生物分解会产生大量的酚类物质, 要加快酚类物质转化, 增加土壤有机质数量和质量, 酶活性, 2. 3, 土壤多酚氧化酶, 因此受pH 的影响较大。由图1看出, 土壤多酚氧化酶活性在pH 值1～4逐渐上升, 上升的比较平稳; pH 4～7之间趋于平稳, 受pH 值影响不大; pH 值7～9多酚氧化酶活性上升的非常快, pH 值9活性是pH 值7的2. 7倍; pH 值9～11又趋于稳定, 活性达到最高; pH 值11～12活性急剧下降, 从活性峰值降低到几乎没有活性; pH 值12～14完全失去活性。土壤多酚氧化酶活性在碱性条件下高, 在酸性环境下低, 在强酸强碱环境中失去活性。pH 值9～11酶活性最高, 但是为了提高土壤多酚氧化酶活性, 不能人为提高土壤pH 值, 这会给植被造成损害。土壤呈中性时, 酶活性较高并且趋于平稳, 不会给植被造成损害, 故应以中性为宜。强酸条件下, 土壤多酚氧化酶失去活性, 可能是因为多酚氧化酶在强酸条件下发生了水解, 导致失去活性。强碱条件下, 土壤多酚氧化酶也失去活性, 可
-[20, 21]
能是OH 与酶活性中心反应, 导致酶失去活性。为了验证酶在强碱条件下使酶活性中心失活, 把湿土
-1
壤放在0. 5mol L 氢氧化钠溶液中浸泡20分钟, 按照测试多酚氧化酶方法测试土壤多酚氧化酶活性, 结果发现也没有活性。通过上述分析可知, 土壤多酚氧化酶活性在强碱和强酸条件下失去活性, 但是保证酶不失活性pH 值范围比较广, 为多酚氧化酶在土壤修复中的应用开辟了广阔道路。
(1)
多酚氧化酶催化反应机理如⑴所示, 根据反应方程式可以看出此反应是一个以氧气为反应底物的反应, 氧气浓度对酶活性影响非常大。实验结果也证实了这一点, 由表4可知, 土壤多酚氧化酶活性在氧气充
表4 土壤多酚氧化酶活性随溶解氧变化
Table 4 The activity of PP O changes with s oluble 土壤状态
S oil conditi on
0. 74
oxygen
0. 46
毫克没食子素每克土
足情况下高, 在缺氧条件下低, 氧气充足时酶活性是缺氧时的1. 6倍, 并且本实验还不是在严格缺氧状态下进行的, 如果在隔绝空气条件下进行, 活性将会降得更低。因此要提高土壤多酚氧化酶活性, 必须保证足量的氧气供应, 但是土壤中溶解氧浓度低, 地表下土壤更低, 故降低了土壤多酚氧化酶活性。有些植物通过自己呼吸作用可以供给根部大量氧气, 增强土壤多酚氧化酶活性。荷花就是其中一种, 下面从土壤多酚氧化酶角度对荷花出淤泥而不染的成因进行解释。通过测试可知荷花根部多酚氧化酶活性为1. 30OD m in , 多酚类物质为2%, 多酚类物质和酶活性高, 为酚的催化反应提供了反应底物和催化剂。而荷花的颈部和叶子都有气孔, 呼吸时也可以吸收大量的氧气, 这就组成一个完整酚类催化反应体系, 一方面产生的醌类物质进行本身的新陈代谢, 形成坚韧的细胞壁和所需物质, 使得荷花更适合在水中生长。另一方面释放出的醌类物质与池塘污泥中氨基酸、蛋白质、多糖、矿物等反应形成腐殖质一些芳香族化合物, 腐殖质呈黑色和褐色, 所以荷花生长环境看起来比较浑浊, 其实这是土壤肥沃
-1
3期 郝建朝等:土壤多酚氧化酶性质研究及意义473
析, 总结出一套土壤多酚氧化酶测试方法可供大家参考。测试多酚氧化酶活性时用湿土壤, 以120℃烘干
后的土壤为参比测试酶活性, 湿土壤要混合均匀或者通过测试多个样品求均值使测试结果稳定; 通过震荡使反应三角瓶与空气充分接触; pH 值以中性为宜; 反应温度30℃; 反应结束后, 用乙醚作萃取剂, 为了防止乙醚泄漏挥发引起中毒, 萃取时一定要保证密闭性并且要在通风橱中进行。土壤多酚氧化酶处在土壤这个复杂的反应体系中, 限制了对它更深入的研究, 比如酶的提取、酶谱分析和动力学研究, 通过对土壤多酚氧化酶基本性质的研究对研究上述问题提供思路。参考文献:
[1] 杨万勤, 王开运. 土壤酶研究动态与展望[J ].应用与环境生物学
图1 多酚氧化酶活性随pH 值变化
Fig . 1 Activity of PP O changes with pH
2. 4 土壤多酚氧化酶随温度的变化
土壤多酚氧化酶活性在17～45℃之间逐渐升高, 上升的比较慢, 到45℃达到最大值。在45～55℃之
间活性急剧下降, 下降速度快, 多酚氧化酶活性在温度过高时会失去活性。自然条件下不会达到这么高的温度, 为土壤多酚氧化酶活性提供了合适的反应环境, 但是对于一些用于生态湿地处理废水的厂房来说, 一定要控制排放废水的温度, 处理效果
。
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图2 土壤多酚氧化酶活性与温度关系
Fig . 2 Activity of PP O changes with te mperature
3 结 论
通过对土壤多酚氧化酶的研究, 完善了土壤多酚氧化酶的测试方法, 认识到传统方法测试出的酶活性偏低并不能说明土壤多酚氧化酶活性低, 处理样品时导致酶活性降低, 湿土壤是风干土壤的3. 5倍; 多酚氧化酶在氧气充足时活性高, 从这个角度解释了荷花出淤泥而不染成因, 为生态湿地选择合适生长植物提供
了前提; 多酚氧化酶活性在pH (9～11) 活性最高, 但是不利于植被的生长, 应以中性为宜; 多酚氧化酶在45℃活性最高, 提高酶活性要提高温度。通过以上分
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Properti es of Polyphenol O x i da se i n So il and its S i gn i f i cance
HAO J ian -chao , WU Yan -you , L I A N B in , WU Chun -du
1
2
1
2
(1. Guizhou Province Key Laboratory of Fer m entation Engineering and B iophar m acy , Guiyang, Guizhou, 550003, China;
2. Institute of Agricultural Engineering of J iangSu U niversity, Zhenjiang , J iangSu, 210213, China )
Abstract:Polyphenol oxidase (PP O ) is one of the redox enzy mes, which contain Cu or Mn as an active centre . Some p r operties of polyphenol oxidase in marsh s oil of B injiang are studied under different dry and wet , s oluble oxygen, pH, and te mperature .
The PP O activity in wets oil was higher than that in drys oil 1affected the PP O activity
significantly, for instance, both acidic and alkaline conditi ons at 45℃was the best 1Key words:Soil ; Polyphenol oxidase; Pr operties;
土 壤 通 报Vol . 37, No . 3第37卷第3期
Jun . , 2006
Chinese Journal of Soil Science 2006年6月
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郝建朝, 吴沿友
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, 连 宾, 吴春笃
12
(1. 贵州大学发酵工程与生物制药重点实验室, 贵州贵阳 550003; 2. 江苏大学农业装备工程研究院, 江苏镇江 212013)
摘 要:土壤多酚氧化酶是一类以铜、锰为活性中心的氧化还原酶。本文以滨江带生态湿地土壤为材料, 系统研究了土壤多酚氧化酶活性随着干湿状态、溶解氧、pH 值、温度而变化的情况。结果表明, 湿土壤比风干土壤和烘干土壤活性高; 氧气充足时活性高于缺氧时活性; 多酚氧化酶活性在强酸强碱条件下失活, pH 值(9～11) 或温度45℃时活性最高。通过对土壤多酚氧化酶性质研究, 对一些现象进行了初步解释, 如荷花出淤泥而不染成因; 为加快土壤多酚氧化酶在环境修复中应用和开发它的广阔应用前景奠定基础。
关 键 词:土壤; 多酚氧化酶; 性质; 温度; pH 值
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酚氧化酶用于土壤环境修复, 丁克强麦草对菲污染土壤修复。[10]
解产生酚类物质, , 体造成污染。的意义。, 存在潜在危险, 故目前只限于把土壤多酚氧化酶的活性测试出来, 而对它的性质研究甚少, 这就限制了土壤中多酚氧化酶的应用和快速发展。为了防止植物果实褐变, 人们对植物多酚氧化酶性质研究较多, 这为土壤多酚氧化酶性质研究提供了理论依据。本文通过研究土壤多酚氧化酶活性随着干湿状态、溶解氧、pH 值、温度的变化, 找到了土壤多酚氧化酶催化反应最佳反应
[11]
条件; 对传统测试土壤多酚氧化酶的方法提出了一些建议, 对一些现象进行了初步解释, 如荷花出淤泥而不染成因。这为加快土壤多酚氧化酶在环境修复中应
[12, 13, 14, 15]
用和开发它的广阔应用前景奠定基础。
为北亚热带, 年降雨量达800～1600毫米, 年平均气温
15. 4℃, 全年无霜期为240～260天, 年积温5000～6500℃, 而且四季分明, 适合多种植物生长, 并且此湿地植被以芦苇和鹝草为主。供试土壤性质如表1。
表1 0～30c m (mg kg -1)
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Available Zn 有效铁
Available Fe 有效锰
Available Mn 速效磷
Available
P 有机质
O rganic material 速效氮
Available N 1. 2 采样方法和样品预处理
采样位置处于滨江带湿地中部, 距离堤边约170m , 高程范围在3. 5～3. 75m , 此处芦苇生长茂盛。用便携式土壤采样器从地表向下取0～5c m 、5～10c m 、10～15c m 、15～20c m 、20～25c m 、25～30c m 共六个层次, 取出土壤用镊子把土样中能用肉眼看到的根系和杂物去掉并把每个样本平均分成两份, 一份用于研究酶活性随着层次的变化; 另一份把六个样本混合均匀, 研究土壤多酚氧化酶活性随着土壤干湿状态、溶解氧、pH 值、温度而变化的情况以及土壤的基本性质。最后把土壤装在保鲜袋中放在冰箱内4℃保[16]
存。研究土壤多酚氧化酶活性时, 所选用的土壤是相同土壤, 每个样品平行测试三次。
1 材料与方法
1. 1 滨江带生态湿地基本情况
湿地处于长江中下游平原的镇江北固山脚下, 位于东经119°82′89″, 北纬32°81′59″, 属于东部季风湿润区,
收稿日期:2005204218; 修订日期:2005-07-01基金项目:国家“十五”重大科技专项(2003AA601100-3) 资助
作者简介:郝建朝(1980-) , 男, 河北保定人, 贵州大学在读研究生, 环境生物学。3通讯作者:yanyouwu@ujs . edu . cn
3期 郝建朝等:土壤多酚氧化酶性质研究及意义471
1. 3 多酚氧化酶的测试方法
烘箱中烘干。湿土壤多酚氧化酶活性降低百分率公式为:%×100%。
湿土壤活性
表2 土壤不同状态下多酚氧化酶的活性
Table 2 The activity of PP O in different conditi onal s oil
取1g 湿土样置于50m l 磨口三角瓶中, 然后注入
10m l 1%邻苯三酚溶液, 将磨口三角瓶放在恒温震荡
-1
培养箱中两小时, 震荡速度为170r m in 。研究多酚氧化酶每一个性质时, 除处理样品的方式不同外, 反应样品同时同地进行, 旨在找到不同处理样品方式下多酚氧化酶活性的变化规律, 故我们在室温下进行反应, 恒温震荡培养箱只有做多酚氧化酶随着温度变化时才进行温度控制。如果单纯的测试不同土壤多酚氧化酶活性高低, 为了便于最后比较, 一般培养温度在30℃。震荡培养反应的磨口三角瓶不加塞子。取出后加4m l pH4. 5柠檬酸磷酸缓冲液, 再加入25m l 乙醚萃取, 萃
土壤状态
Soil conditi on
湿土壤
W et s oil 1. 35
风干土壤烘干土壤
A ir drying s oil Heat drying s oil
0. 38
0. 24
毫克没食子素每克土
(mg gallnut /gs oil )
通过表2可知, 湿土壤多酚氧化酶的活性最高, 是风干土壤的3. 5倍, 是烘干土壤5. 6倍。湿土壤和干土壤多酚氧化酶活性相差如此之大, 使我对传统测试多酚氧化酶方法提出疑问。传统土壤多酚氧化酶检测方法中把土壤风干、磨细、过筛, 最后测出它的活性。这可能会使土壤多酚氧化酶活性测试值偏低, 从而遏制它的应用和发展。通过以上分析建议测试土壤多酚, , 一方面可用土壤匀。
表3 湿地不同层次湿土和烘干土壤酶活性和降低率
Table 3 The activity of PP O bet w een wet s oil and dry s oil and reduced percent in wetland
取30m in 。最后将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚
相在紫外分光光度计430nm 处进行比色。再与标准曲线进行对比, 就可以得出1g 湿土样多酚氧化酶的活力。为了在不同样品之间进行比较, 要把湿土样换算成干土样多酚氧化酶的活力。多酚氧化酶的活性以2h 后1g 干土样中紫色没食子素的毫克数表[17, 18, 19]示。1. 4 实验方法1. 4. 1 干湿状态 , 在120℃1. , 按照1. 315. 5℃, 培养震荡的磨口三角瓶不加塞子。1. 4. 2溶解氧 测试土壤多酚氧化酶活性不能严格控制溶氧量, 为了说明氧气浓度对多酚氧化酶活性影响, 规定塞上磨口塞子的锥形瓶为缺氧状态, 直接暴露在空气中反应为氧气充足, 室温为10. 3℃。尽管这种方法不能做到绝对缺氧和读出溶解氧数值, 但是通过测试结果可以说明在不同状态下的变化情况。
1. 4. 3 pH 值 把反应底物邻苯三酚溶液调到不同pH 值, 酸性范围用0. 1mol L
-1
-1
土壤深度
(cm )
烘干土壤Heat drying soil 湿土壤Wet soil
Soil depth 活性(毫克没食子素每克土) 活性(毫克没食子素每克土) 降低率(%)
0～55～1010～1515～2020～250. 0. 0. 1. 1. [1**********]. 0. 0. 0. 0. [1**********]7. 68. 66. 73. 65. 6908673391Activity (mg gallnut /gsoil ) Activity (mg gallnut /gsoil ) Reduced percent (%)
HCl 溶液调节, 碱性范
围用0. 1mol L Na OH 溶液调节。pH 值范围1. 21～13. 5014个等级。按照1. 3方法测试多酚氧化酶的活性。室温为16. 0℃, 培养震荡的磨口三角瓶不加塞子。
1. 4. 4 温 度 按照1. 3方法测试土壤多酚氧化酶
由表3可知, 不同层次湿土壤多酚氧化酶活性降
低百分率是不同的。15～20c m 土壤降幅最高, 可达73. 33%; 25～30c m 土壤降幅最低, 为45. 37%。通过统计分析可知, 湿土壤和烘干土壤六个层次酶活性相关系数为0. 81, α在0. 05置信范围有显著性差异, 湿土壤和烘干土壤酶活性不相关。土壤多酚氧化酶在高温下会失去活性(由后面测试土壤多酚氧化酶随温度变化可以看出) , 烘干土壤在120℃的烘箱中烘干, 多酚氧化酶已经失去活性, 但是为什么烘干土壤还表现出一定活性呢? 土壤成分复杂, 一些具有氧化性的物质也能把邻苯三酚氧化成醌。故测试土壤多酚氧化酶时会包含非酶类物质氧化带来的误差, 并且这种非酶
活性, 只是在振荡培养箱中培养反应温度不同。反应温度分为六个等级, 分别为17℃、25℃、35℃、45℃、50℃、54℃。培养震荡的磨口三角瓶不加塞子。
2 结果与讨论
2. 1 土壤在不同状态下多酚氧化酶的活性
风干的土壤在室温下风干, 烘干土壤在120℃的
472土 壤 通 报 37卷
类物质引起的误差随土壤变化而变化, 随机性很大, 使测试结果不准确。传统的测试方法是以无基质的土壤和无土壤的基质为参比。通过上述分析可知这种对照不科学, 不能反映采样的随机性。为了消除非酶类物质氧化带来的误差, 建议以120℃烘干的土壤为参比, 用湿土壤的活性减去烘干土壤活性就是酶类物质绝对活性, 这样得到的数据更加稳定准确。湿土壤绝对活性可以更好分析土壤中多酚氧化酶活性随着土壤层次变化, 判断根系对土壤多酚氧化酶贡献大小和土壤多酚氧化酶的积累情况, 为土壤多酚氧化酶提取和酶谱分析奠定基础。
2. 2 土壤多酚氧化酶活性随溶解氧变化
2C 6H 3(OH ) 3多酚氧化酶22C 6H 3O 3+3H 2O 2
的表现。因此荷花出淤泥而不染是它本身适应环境的一种表现, 也是自己一种本能。鉴于荷花本身特性, 把荷花用于酚类废水处理有广阔的发展前景。现在一些人工生态湿地已经选择它为优势植物, 一方面可以美化环境; 另一方面可以加快酚类物质转化, 增加土壤肥力。
湿土壤不同层次之间多酚氧化酶活性并不相同, 由表3可知, 0～5c m 湿土壤的活性最低, 15～20c m 湿土壤活性最高, 并且前三个层次活性低, 后三个层次活性高。0～5c m 土壤和大气层接触, 溶氧量高, 下层溶氧量低, 所以测试土壤多酚氧化酶活性高的层次由于溶解氧低而不能完全表现它与空气接触充分的活性。因此要提高土壤底层多酚氧化酶活性必须通一定量氧气, 特别是处理酚类废水的生态湿地。还田的秸秆含有大量木质素, 木质素经过微生物分解会产生大量的酚类物质, 要加快酚类物质转化, 增加土壤有机质数量和质量, 酶活性, 2. 3, 土壤多酚氧化酶, 因此受pH 的影响较大。由图1看出, 土壤多酚氧化酶活性在pH 值1～4逐渐上升, 上升的比较平稳; pH 4～7之间趋于平稳, 受pH 值影响不大; pH 值7～9多酚氧化酶活性上升的非常快, pH 值9活性是pH 值7的2. 7倍; pH 值9～11又趋于稳定, 活性达到最高; pH 值11～12活性急剧下降, 从活性峰值降低到几乎没有活性; pH 值12～14完全失去活性。土壤多酚氧化酶活性在碱性条件下高, 在酸性环境下低, 在强酸强碱环境中失去活性。pH 值9～11酶活性最高, 但是为了提高土壤多酚氧化酶活性, 不能人为提高土壤pH 值, 这会给植被造成损害。土壤呈中性时, 酶活性较高并且趋于平稳, 不会给植被造成损害, 故应以中性为宜。强酸条件下, 土壤多酚氧化酶失去活性, 可能是因为多酚氧化酶在强酸条件下发生了水解, 导致失去活性。强碱条件下, 土壤多酚氧化酶也失去活性, 可
-[20, 21]
能是OH 与酶活性中心反应, 导致酶失去活性。为了验证酶在强碱条件下使酶活性中心失活, 把湿土
-1
壤放在0. 5mol L 氢氧化钠溶液中浸泡20分钟, 按照测试多酚氧化酶方法测试土壤多酚氧化酶活性, 结果发现也没有活性。通过上述分析可知, 土壤多酚氧化酶活性在强碱和强酸条件下失去活性, 但是保证酶不失活性pH 值范围比较广, 为多酚氧化酶在土壤修复中的应用开辟了广阔道路。
(1)
多酚氧化酶催化反应机理如⑴所示, 根据反应方程式可以看出此反应是一个以氧气为反应底物的反应, 氧气浓度对酶活性影响非常大。实验结果也证实了这一点, 由表4可知, 土壤多酚氧化酶活性在氧气充
表4 土壤多酚氧化酶活性随溶解氧变化
Table 4 The activity of PP O changes with s oluble 土壤状态
S oil conditi on
0. 74
oxygen
0. 46
毫克没食子素每克土
足情况下高, 在缺氧条件下低, 氧气充足时酶活性是缺氧时的1. 6倍, 并且本实验还不是在严格缺氧状态下进行的, 如果在隔绝空气条件下进行, 活性将会降得更低。因此要提高土壤多酚氧化酶活性, 必须保证足量的氧气供应, 但是土壤中溶解氧浓度低, 地表下土壤更低, 故降低了土壤多酚氧化酶活性。有些植物通过自己呼吸作用可以供给根部大量氧气, 增强土壤多酚氧化酶活性。荷花就是其中一种, 下面从土壤多酚氧化酶角度对荷花出淤泥而不染的成因进行解释。通过测试可知荷花根部多酚氧化酶活性为1. 30OD m in , 多酚类物质为2%, 多酚类物质和酶活性高, 为酚的催化反应提供了反应底物和催化剂。而荷花的颈部和叶子都有气孔, 呼吸时也可以吸收大量的氧气, 这就组成一个完整酚类催化反应体系, 一方面产生的醌类物质进行本身的新陈代谢, 形成坚韧的细胞壁和所需物质, 使得荷花更适合在水中生长。另一方面释放出的醌类物质与池塘污泥中氨基酸、蛋白质、多糖、矿物等反应形成腐殖质一些芳香族化合物, 腐殖质呈黑色和褐色, 所以荷花生长环境看起来比较浑浊, 其实这是土壤肥沃
-1
3期 郝建朝等:土壤多酚氧化酶性质研究及意义473
析, 总结出一套土壤多酚氧化酶测试方法可供大家参考。测试多酚氧化酶活性时用湿土壤, 以120℃烘干
后的土壤为参比测试酶活性, 湿土壤要混合均匀或者通过测试多个样品求均值使测试结果稳定; 通过震荡使反应三角瓶与空气充分接触; pH 值以中性为宜; 反应温度30℃; 反应结束后, 用乙醚作萃取剂, 为了防止乙醚泄漏挥发引起中毒, 萃取时一定要保证密闭性并且要在通风橱中进行。土壤多酚氧化酶处在土壤这个复杂的反应体系中, 限制了对它更深入的研究, 比如酶的提取、酶谱分析和动力学研究, 通过对土壤多酚氧化酶基本性质的研究对研究上述问题提供思路。参考文献:
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图1 多酚氧化酶活性随pH 值变化
Fig . 1 Activity of PP O changes with pH
2. 4 土壤多酚氧化酶随温度的变化
土壤多酚氧化酶活性在17～45℃之间逐渐升高, 上升的比较慢, 到45℃达到最大值。在45～55℃之
间活性急剧下降, 下降速度快, 多酚氧化酶活性在温度过高时会失去活性。自然条件下不会达到这么高的温度, 为土壤多酚氧化酶活性提供了合适的反应环境, 但是对于一些用于生态湿地处理废水的厂房来说, 一定要控制排放废水的温度, 处理效果
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图2 土壤多酚氧化酶活性与温度关系
Fig . 2 Activity of PP O changes with te mperature
3 结 论
通过对土壤多酚氧化酶的研究, 完善了土壤多酚氧化酶的测试方法, 认识到传统方法测试出的酶活性偏低并不能说明土壤多酚氧化酶活性低, 处理样品时导致酶活性降低, 湿土壤是风干土壤的3. 5倍; 多酚氧化酶在氧气充足时活性高, 从这个角度解释了荷花出淤泥而不染成因, 为生态湿地选择合适生长植物提供
了前提; 多酚氧化酶活性在pH (9～11) 活性最高, 但是不利于植被的生长, 应以中性为宜; 多酚氧化酶在45℃活性最高, 提高酶活性要提高温度。通过以上分
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HAO J ian -chao , WU Yan -you , L I A N B in , WU Chun -du
1
2
1
2
(1. Guizhou Province Key Laboratory of Fer m entation Engineering and B iophar m acy , Guiyang, Guizhou, 550003, China;
2. Institute of Agricultural Engineering of J iangSu U niversity, Zhenjiang , J iangSu, 210213, China )
Abstract:Polyphenol oxidase (PP O ) is one of the redox enzy mes, which contain Cu or Mn as an active centre . Some p r operties of polyphenol oxidase in marsh s oil of B injiang are studied under different dry and wet , s oluble oxygen, pH, and te mperature .
The PP O activity in wets oil was higher than that in drys oil 1affected the PP O activity
significantly, for instance, both acidic and alkaline conditi ons at 45℃was the best 1Key words:Soil ; Polyphenol oxidase; Pr operties;