种传病毒的检测方法——原理和方案
1、前言
病毒和类病毒是两类独特的病源，和其他病源，如真菌和细菌相比完全不一样。
病毒是一类颗粒，此颗粒由蛋白质外壳和核酸组成。绝大多数植物病毒的（基因组）核酸是单链RNA ；只有一小部分植物病毒的基因组是双链RNA 或者DNA 。类病毒是迄今为止已知最小的植物病源体；它只含有单链环形RNA ，并不含蛋白质外壳。马铃薯纺锤体茎病就是由类病毒引起的植物疾病之一。病毒和类病毒一样都没有蛋白质合成体系，而是完全依赖宿主（Hull ，2002）。
长久以来，科学家们认为病毒经由种子从病株传播到后代只是偶然的现象。时至
今日，我们已经知道，在已知的植物病毒中大约有七分之一可以经由种子从病株传播到后代（Hull ，2002），并且此类病毒的数量正与日俱增。病毒种传的三个重要影响是：（ⅰ）对作物造成直接损伤或间接损伤，因为即便是种植了很少量的带毒种子，也会造成病毒病源大量地、随机地扩散，从而有利于寄主对病毒的二次传播；（ⅱ）病毒可以在农作物一季又一季的耕作中存活下来；（ⅲ）毫无疑问的一点就是，带毒种子的贸易使得某些病毒和类病毒在全世界传播开来。
1．1 种传病毒和类病毒
如今，大家都已经知道，病株的种子中往往会出现多种病毒的身影，但是这些种子
并不能把病毒传递给子代，只能说这些病毒能在种子中生存，而并不是所谓的种传病毒。种传病毒的一个主要特征就是它们都能够侵染种子胚胎。当然也有例外，比如说烟草花叶病毒属的某些病毒并不能进入种子的胚胎，但是可以在种子上稳定存活，从而侵染子代。2002年，Hull 对各属病毒中种传病毒的种类进行了统计。其中，隐病毒属中含有31种种传病毒，这些病毒往往不会造成多大的经济损失，一般经由种子和花粉传播。种传病毒所占比例相对较高的病毒属有：苜蓿花叶病毒属（1/1），豇豆花叶病毒属（6/15），黄瓜花叶病毒属（3/3），烟草线条病毒属（8/17），线虫传多面体病毒（17/40），马铃薯Y 病毒属（16/179），南方菜豆花叶病毒属（4/14），烟草花叶病毒属（7/17）和烟草脆裂病毒属（3/3），而在诸如香石竹环斑病毒属，黄矮病毒属，玉米雷亚多非纳病毒属以及纤细病毒属中并没有种传病毒。在双生病毒属（102种）中也没有种传病毒。在已知的28种类病毒中有10种是种传病毒。附录一列出了种传病毒和类病毒以及它们所属的病毒属、种名，而表4.1则就对农业生产造成巨大损失的34种病毒和类病毒以及它们的主要宿主一一列出。
1．2 种传病毒的研究历程
1910年，Westerdijk 首次怀疑烟草花叶病毒在番茄上存在种传现象，在随后的很
长一段时间里，科学家们先后发现BCMV 在黄豆上、黄瓜花叶病毒在野生黄瓜上、莴苣花叶病毒在莴苣上、蚕豆花叶病毒在蚕豆上存在种传现象。截止到1951年为止，只发现了6种种传病毒，但仅仅过了六年之后，人们就在40种植物上发现了20种种传病毒。到了1964年，种传病毒的种类已经达到36种，而宿主的数量也达到63种，而1969年种传病毒的种类则达到47种，1974年85种，到1988年时，据Agarwal 和Sinclair 的估计种传病毒的数量则多达156种。
自从1951年之后，科学界先后有多篇有关种传病毒的综述发表，比如，
Bennett(1969)，Bos(1977)，Neergarrd(1977)，Mandahar(1981)，Mink(1993)以及Johansen et al. (1994)等。其中，Mink 于1993年发表的综述主要针对种传病毒研究中出现的问题进行了修正，他发现许多病毒被误归为种传病毒，并认为108种病毒（除隐病毒属之外）
和七种类病毒可以归为种传病毒。从那以后，种传病毒新的发现以及病毒分类原则的更改所导致的变更就时时地在种传病毒名称列表中体现出来。附录一中的内容也相应地进行更新（但并不一定完全）。在本书以后章节中出现的种传病毒缩写形式的全名以及种传病毒的归属请参见表4.2。
种子在植物病毒传播生态学上的重要性越来越受到各界的重视，从而也导致了国
际上检验检疫机构对种子健康加大了检查的力度。与此同时，科学界对于多种杂草作为种传病毒的宿主以及除非杂草得到控制否则杂草种子将成田间病毒库等问题的认识日渐清晰。
1．2．1 从种子中检测病毒
种子中检测病毒即使一门科学又是一门技术，它被种子检测站和植物检疫实验室用
来从大批的种子中筛选出具有耕种价值的种子。
最早用来检测种子是否携带病毒的方法是检测由种子培育的幼苗，也就是所谓的生
长实验。该方法最早被Fajardo 用于从大豆中检测BCMV 。后来该方法又被Mckinney 用于从稗草中检测稗草条状花叶病毒，此外Rohloff 和Hampton 还把该方法用于检测莴苣花叶病毒。在生长实验中，Rohloff （1966）和Phatak （1974）都认为光线的强度以及光源的类型对病毒症状的形成起着至关重要的作用，同时，病毒的株系以及宿主的种类也同病毒在幼苗上症状的发生有着紧密的关系。
与此同时，Lister 和Murant 研究发现，种子在受到由线虫所传播的病毒侵染之后的
特征就是在生长实验时不显示症状。由于病毒在种子中的潜伏性或者症状不明显以及由其它因素所引起的症状和带毒症状之间的相似，从而使得种传病毒的研究人员意识到在生长实验之外必需辅以生物学或者血清学的检测。尽管如此，生长实验在研究种子携带子株传播病毒方面依然具有无可比拟的优势。Quantz 发表了检测BCMV 的方法，首先，接种超敏大豆株系‘Top Crop’的初叶，然后将初叶剪下，接着将初叶放在培养皿中的湿润滤纸上于32℃下用恒定人造光孵育3天。后来，在1962年，这种方法又被用来从大豆种子中检测病毒，略微的修改是让种子在滤纸上预先萌发3-4天。用生物学方法从莴苣种子中高灵敏地检测莴苣花叶病毒率先由Pelet 和Gagnebin 于1963年提出，随后在1967年又得到Marrou 和Messiaen 的补充，具体的方法是，把莴苣种子在缓冲液中磨成粉末然后接种在昆诺阿黎的幼苗上，使用该方法可以从700粒种子中检测出一粒带毒种子。
Hamilton （1965）是率先把血清学技术应用于从种子中检测病毒的人之一，具体的做法就是，把从大麦种子中分离出来的胚压碎涂在小的滤纸盘上，然后把滤纸盘放在琼脂上，琼脂的另一侧则放着浸满BSMV 抗血清的另外一块滤纸盘，如果稗草种子的胚受到BSMV 侵染的话，则琼脂上则呈现用肉眼就可见到的沉淀。在琼脂中加入去污剂可以防止病毒粒子凝结的同时也可把病毒裂解成具有迁移能力的抗原，从而提高检测的灵敏度。病毒和病毒抗血清所形成的特异性条带在大约48小时后依然可见。后来，Slack 和Shepherd 对用琼脂法从小麦和稗草种质中检测BSMV 的方法进行了改良，形成了所谓的放射扩散法。在该法中，把种子刚刚萌发所生成的小叶片（1mm ）压进琼脂中，在琼脂中含有稀释过的抗血清、去污剂以及叠氮化钠。此外，此处制备的抗血清是抗经四氢吡咯消解的病毒蛋白，因此，针对完整病毒颗粒制备的抗血清和经去污剂降解的病毒粒子之间反应较弱。在经过24-36个小时的孵育之后，可以用立体显微镜观察结果。该方法可以在直径为9cm 的琼脂盘上同时观察500-600个样品，其优点就在于可以直接计算带毒率，与此同时，没有携带病毒的种子就可以直接生长，于是就使得种质资源得以保存。在美国蒙大拿州，这两种检测方法都已经成为种子商品评级的常规方法。截
止20世纪七十年代中期，适用于其它病毒的血清学检测方法也相继成型。其中之一便是由Bercks 于1967年开发的乳胶凝集测试。此法相对凝胶扩散法而言具有很高的灵敏度，已发表的文章中称其是检测大麦中BSMV 的可行方法。
电镜是分析病毒的一件利器，但它并不适用于种子是否携带病毒的常规检测，但是，
由Derrick 于1973年开发的免疫吸附电镜却时常被用来检测种子是否带毒或者被用于校正其它检测方法所得结果的合理性。在本书5.5中就早期抗血清方法以及免疫吸附法的基本原理进行了简短的介绍。
和20-30年前相比，现如今我们已经可以用高灵敏度以及高保真的方法来检测病
毒以及检测种子是否携带病毒。在基于抗体的检测方法中，酶联免疫反应法最经常被使用，它的优势在于操作简便、高灵敏度、高保真、适于大规模检测以及部分步骤自动化。建立在核酸为基础上方法，特别是PCR ，以其高特异性和奇高的灵敏度，越来越多地被用于植物病毒检测，其中就包括检测种子是否携带病毒。尽管PCR 法在原理上简单且在病毒检测上有着明显的优势，但是PCR 法和酶联免疫反应法相比其缺点依然很明显，如操作起来不简便以及不适用于大规模检测。目前，科学界对改善和简化PCR 方法的研究正在紧锣密鼓地进行中。
1．3 种传病毒的经济危害
一旦农作物受到病毒的侵染，它将终身与病毒为伍，且往往会导致产量的损失。
单从每年来看，这个损失就相当大，但对于果树这种多年生作物来讲，病毒侵染后的危害更为深远。在世界上，90%的粮食作物是通过种子繁殖的，因此，由于种子携带的病源，包括病毒，所造成的经济损失是相当巨大的。种传病毒所造成的经济损失包括产量锐减或者品质下降等直接损失也包括用于控制作物病势所耗费的间接损失。如前所述，在高效寄主存在的情况下，即便是播种下的种子中只有极少量的种子携带病毒也会造成病毒在整片农田扩散，有的时候会导致所有的植株都获病。因此，举一个例子来说，每公亩所种的种子为25万粒，也就是每平方米的土地上的种子为25粒，这个数字并不高，假若其中有0.1%的种子带毒的话，每公亩土地上感病的植株也只有250株。但是，一旦出现病情之后，这些随机种植的植株就成了病源库。表1.1显示了几种种传病毒所造成的单位面积农作物的损失率。
种传病毒对农作物生产造成严重损失的两个众所周知的例子是，在1957-1970年
间，在美国的蒙大拿州，据估计由BSMV 的侵染而造成的大麦经济损失就高达3千万美圆；在上个世纪50年代，由LMV 病毒侵染而造成的莴苣“六月黄”也导致加利福尼亚州的莴苣生产严重受创。使用完全无病毒种子或者几乎无病毒种子才使得这两件事情最终得以解决。最近的例子就是由于草原受到SCMoV 的侵染而造成澳大利亚奶制品工业巨大损失，据估计每年的损失高达3100万澳大利亚圆。对于瓜类作物来讲，小西葫芦黄花叶病毒是一种危害巨大的病源，它可以导致瓜类产量损失高达90%，但是，该病毒的种传特性在其流行性病学研究中所占角色并不重要，因为，即便是发生种传的话，也只是在极少量种子中。截止到2002年为止，只有5%的南瓜种子中携带有种传病毒。
复合侵染导致农作物产量急剧下滑的原因也许应归结为病毒间的协同效应。豇豆
矮化病是由BCMV 的黑眼豇豆花叶病毒株系和黄瓜花叶病毒共同侵染而造成的，它可导致豇豆种子在数量上和重量上分别减少84%和87%。倘若这两种病毒单独侵染豇豆，则损失要少得多，黄瓜花叶病毒造成的损失为19%和14%，BCMV 的黑眼豇豆花叶病毒株系所造成的损失仅为11%和3%。
如前所述，植物病毒经由种子传播的两大风险就是：（ⅰ）在农作物的代代种植中，
病毒病依然如影随形；（ⅱ）种子贸易使得种子作为一个载体把病害传播到新的地区。和绝大多数经由种子传播的病害相比，病毒病具有明显的特点。病毒侵染的症状往往不明显或者说田间的肉眼观测很难将其定性。相对于其他病害病源的检测而言，如真菌，检测种子是否携带病毒的所需的人力和经济成本更高。同时，尽管科学界就使种子脱毒进行了许多尝试，但是这些方法都会导致种子生命力的降低。
种传病毒所造成的间接损失主要包括农民为控制病害所付出的成本以及在种子评
级和检验检疫过程所产生的损耗。植物病害诊断的其中一个特点就是，对于拿来测试的样品来说，是‘低附加值’的。因此，我们在采取控制措施以及投入成本时，其程度必须和作物的价值以及经济损失的风险做一权衡。目前，有一些例子说明，我们可以使用合格的种子从而有效控制病毒，比如说对前面提到的受BSMV 以及LMV 严重侵害的作物，在这些例子中，经济损失大幅度降低，可以用相对少的经济投入就可几乎消除病毒。
尤其是在发展中国家，农民通常把他们省下的粮食做为来年耕种的种子。正是在
这种耕作传统下，不仅每年收获的粮食中都会有携带病毒的种子，而且病源库的规模也在逐年地扩大。当然另一方面，农民手中种子的带毒率也可能会比种子培育站的低，就如在尼泊尔会偶然在小扁豆种子中发现豇豆种媒花叶病毒。这也就使得在种子培育和生产计划中，培育者的种子以及基本种在成为种质库和商品库之外必须要确保完全无病毒化。除此之外，在培育种子的初期，控制病毒所需要的成本要比种子数量几何增长之后要少的多。
1．4 检测种子是否带毒：为何？
在许多情况下，由于病毒病害而引起的农作物产量的巨大损失是可以预防的，比
如说种植无毒或者带毒率较低的种子。仅凭田间观测来衡量种子商品种植中的带毒率往往是低效的。由于植株较为稠密或者由于病毒-宿主之间相互作用而导致病害症状不明显从而使得病株往往不被注意，也使得基于田间症状而进行诊断的难度很大，甚至无法施行。从检疫学的角度来看，健康植株的体内也可能存在着潜在的侵染，是否存在侵染以及病毒的类型唯有通过检测才可获悉。因此在检疫方面也需要特异性较高的检测方法来检测和剔除病毒或者病毒株系。在种质收集的过程中，也需要种子健康检测来把携带病毒的种子从野性型近亲或者经基因改良的基因型种子中剔除出去以及把在种质分化过程中所引入的病毒检测出来。因此，在种子生产、基因库建立和种子检疫等方面都需要可靠的、特异的以及高灵敏度的病毒检测和诊断方法。
依据病毒、作物种类以及田间条件，尤其作物种植区内存在高效寄主，the degree of freedom from seed-transmissible viruses needed to minimize disease in the field varies 。
1．4．1 种子评级
对于种子检疫和种子评级来说，它们所检测的种传病毒的最低带毒率是完全不一样
的。种子评级的目的在于给种植者提供质量最优化的种子，如果在这个过程中也包括种子健康检测的话，其目的就是通过对种子样品的检测而使得合格种子中的带毒率处于一个满足生产需求的最低限度。但是，就目前的情况来看，人们对于何为最低限度依然是存在很大的分歧。Stace-Smith 和Hamilton （1988）就曾经指出和种传病毒发病的最低阈值相关的数据极度缺乏。按照Jones 的说法，这种相关数据极度缺乏的状况在12年内依然未变。相对于检测技术的日新月异来说，科学界对于检测的结果、病源在田间扩散以及不同侵染率所造成的产量损失这三者之间相互关联所做的研究之少，达到令人惊讶的地步。正如Jones 所说的那样，“科学界需要在投入到植物病毒传播学和投入到细
胞以及分子病毒学这两方面研究的科研资源上来一个更为均衡的分配，尤其是在研究种传病毒时。”
种子携带病毒率的实际阈值必须通过在不同地区、经年的田间试验才能确定下
来，在田间试验中，不同带毒率的种子应该随机成块种植（见第三章）。
在众多的田间试验中，在加利福尼亚州塞林那谷地进行的试验最被人熟知。这个
试验发现，如果不能保证莴苣种子完全不带毒，即便是带毒率小于0.003%，那么莴苣花叶病毒依然可以在该地区大爆发。而在欧洲和那些病毒寄主压力较低的地区以及在那些莴苣并非常年种植的地区（正如塞林那谷地），莴苣种子带毒率为0.1%依然不会造成莴苣花叶病毒的大爆发。在2000年，Jones 报道称，分别历经5年、7年以及7年在西澳大利亚的不同地方于田间试验中为羽扇豆种子中CMV 、地三叶草种子中CMV 以及南苜蓿种子中苜蓿花叶病毒确定了可靠的接种物阈值。
但是，对于发展中国家的绝大多数种植者来说，把经过检验评级的合格种子拿来耕
种有点不太现实。在某些国家，种植者耕种的种子中有90%或者更多是来自上一年收获的种子。在2002年，坦桑尼亚农民96%的种子是上一年存下来的。在这些国家，由于落后的经济使得农民买不起来合格的种子来耕作。尽管农民没有能力检测种子是否携带病毒，但是他们也可以通过简单易行的方式来生产完全不携带病毒或者低带毒率的种子。
1．4．2 检疫
经由胚传播的绝大多数病毒在种子中经年都保持着生命力，且通常只要种子有生命
力，这些病毒就可生存；因此，国际间的种子贸易和交换也使得种子成为病毒长距离传播的常见途径。一些病毒在世界范围内得以迅速扩散无疑就是通过这种途径，如蚕豆花叶病毒借助蚕豆以及PSbMV 借助豌豆。因此，即便是已经知道在某个国家或者地区存在着某种病毒，检验检疫部门也得时刻注意防止该病毒危害性更大的新株系的入境。正如Mathur 所说的那样，检疫部门应该就某些重点种传病毒的现状，包括新病的发生以及病毒新株系的出现，与研究机构保持密切的联系。
在20世纪80年代，花生条纹病毒（后来被定为BCMV 的一个新株系），一种对
花生危害极大的病源，经由从中国进口而来的花生种质而被带到了美国。该种病毒在澳大利亚进出口检疫部门所扣压的花生种子中也有发现。像种子评级那样仅仅对一批种子中的代表样品进行检测是无法摒除种子所携带的病害。对于诸如种质这样小批量的种子来说，是可以获得零耐受水平。
近年来，澳大利亚进出口检疫检验部门多次从进口而来的种质库中发现种子系被侵
染现象，其中，在1978-1981年间，9.6%(29/302)的豇豆和17.5%（54/309）大豆以及菜豆的受到种传病毒的侵染。绝大多数受侵染的子代都呈现出明显的症状，病毒具体的属性通过生物学、血清学以及电镜学的方法就可确定。在澳大利亚，从外国进口的多年生作物的种子被种植在无寄主的温室中，只有那些从完全不带病毒植株收获而来的种子才进入市场。Jones 认为，目前，迫切需要建立完全无病毒的种质库，这样就使得那些检验检疫体系不完善的国家能够进口到不带病毒的种子，在改善这些国家农作物生产的同时又不会引发新的病害问题。通过这种方式摒除种质中的病毒不可避免地就会造成种子投入生产的延后。对种子非破坏性的检测会相应地缩短这段延后期。但是，这种方法只适用于一部分病毒宿主之间。
直到20世纪的70年代，PSbMV 在北美豌豆培育计划中大爆发，科学家们才意识
到美国的豌豆种质库是PSbMV 的主要来源。最近几年来，在世界性的种子公司所出售的豌豆种子也检测到这种病毒。
在由美国农业部植物引种机构引种的豌豆中，来自印度北部的豌豆种子携带
PSbMV 的频率高达138/472（批/批），与此同时，也在北印度发现了33批引种豌豆为免疫种质。相比而言，从发达国家引种的500批豌豆中无一含有针对PSbMV 的免疫种质。PSbMV 病毒库和抗PSbMV 的豌豆种质在北印度的区域性集中分布在全世界是独一无二的，这种集中分布在其它地区并不存在。因此，有人推测北印度地区是PSbMV 传播的源头，PSbMV 正是从这个地方扩散到世界的其他地方。
从美国豌豆众多的种质库系中把PSbMV 这种危害极大的病源剔除是一个长期的
工程，在1976年，由美国三个实验室组成的工作小组，它们的目的就是从豌豆种质中剔除PSbMV ，当时由于病毒的危害严重，该计划并位被种植者所看好。从每一批的种子中，选取大量的种子种植在无寄主的温室中，一旦植株出现症状就被剔除掉，进而从每一批中选择至少24个表型、外表健康的植株作为母代来繁殖种子。这些植株在生长的过程中至少要做一次酶联免疫反应来加以检测，从无毒植株收获的种子就作为完全不携毒种子贮存为种质库。在1988-1991年，这个小组一共对2700批种子进行无病毒化处理。据从事研究的科学家们称，使用这种方法仅会导致种质极少数遗传多样性的消失。 在其他作物上中建立完全不携病毒种质库的努力也已进行 ，如美国对豇豆，巴西
对花生。不幸的是，在那些种传病毒和昆虫传病毒猖獗的地区无毒种子所长出的植株最终也会受到病毒的侵染，损失依然严重。
在3.2.2和7.3中，有关种传病毒的检疫也将进一步探讨。
种传病毒的检测方法——原理和方案
1、前言
病毒和类病毒是两类独特的病源，和其他病源，如真菌和细菌相比完全不一样。
病毒是一类颗粒，此颗粒由蛋白质外壳和核酸组成。绝大多数植物病毒的（基因组）核酸是单链RNA ；只有一小部分植物病毒的基因组是双链RNA 或者DNA 。类病毒是迄今为止已知最小的植物病源体；它只含有单链环形RNA ，并不含蛋白质外壳。马铃薯纺锤体茎病就是由类病毒引起的植物疾病之一。病毒和类病毒一样都没有蛋白质合成体系，而是完全依赖宿主（Hull ，2002）。
长久以来，科学家们认为病毒经由种子从病株传播到后代只是偶然的现象。时至
今日，我们已经知道，在已知的植物病毒中大约有七分之一可以经由种子从病株传播到后代（Hull ，2002），并且此类病毒的数量正与日俱增。病毒种传的三个重要影响是：（ⅰ）对作物造成直接损伤或间接损伤，因为即便是种植了很少量的带毒种子，也会造成病毒病源大量地、随机地扩散，从而有利于寄主对病毒的二次传播；（ⅱ）病毒可以在农作物一季又一季的耕作中存活下来；（ⅲ）毫无疑问的一点就是，带毒种子的贸易使得某些病毒和类病毒在全世界传播开来。
1．1 种传病毒和类病毒
如今，大家都已经知道，病株的种子中往往会出现多种病毒的身影，但是这些种子
并不能把病毒传递给子代，只能说这些病毒能在种子中生存，而并不是所谓的种传病毒。种传病毒的一个主要特征就是它们都能够侵染种子胚胎。当然也有例外，比如说烟草花叶病毒属的某些病毒并不能进入种子的胚胎，但是可以在种子上稳定存活，从而侵染子代。2002年，Hull 对各属病毒中种传病毒的种类进行了统计。其中，隐病毒属中含有31种种传病毒，这些病毒往往不会造成多大的经济损失，一般经由种子和花粉传播。种传病毒所占比例相对较高的病毒属有：苜蓿花叶病毒属（1/1），豇豆花叶病毒属（6/15），黄瓜花叶病毒属（3/3），烟草线条病毒属（8/17），线虫传多面体病毒（17/40），马铃薯Y 病毒属（16/179），南方菜豆花叶病毒属（4/14），烟草花叶病毒属（7/17）和烟草脆裂病毒属（3/3），而在诸如香石竹环斑病毒属，黄矮病毒属，玉米雷亚多非纳病毒属以及纤细病毒属中并没有种传病毒。在双生病毒属（102种）中也没有种传病毒。在已知的28种类病毒中有10种是种传病毒。附录一列出了种传病毒和类病毒以及它们所属的病毒属、种名，而表4.1则就对农业生产造成巨大损失的34种病毒和类病毒以及它们的主要宿主一一列出。
1．2 种传病毒的研究历程
1910年，Westerdijk 首次怀疑烟草花叶病毒在番茄上存在种传现象，在随后的很
长一段时间里，科学家们先后发现BCMV 在黄豆上、黄瓜花叶病毒在野生黄瓜上、莴苣花叶病毒在莴苣上、蚕豆花叶病毒在蚕豆上存在种传现象。截止到1951年为止，只发现了6种种传病毒，但仅仅过了六年之后，人们就在40种植物上发现了20种种传病毒。到了1964年，种传病毒的种类已经达到36种，而宿主的数量也达到63种，而1969年种传病毒的种类则达到47种，1974年85种，到1988年时，据Agarwal 和Sinclair 的估计种传病毒的数量则多达156种。
自从1951年之后，科学界先后有多篇有关种传病毒的综述发表，比如，
Bennett(1969)，Bos(1977)，Neergarrd(1977)，Mandahar(1981)，Mink(1993)以及Johansen et al. (1994)等。其中，Mink 于1993年发表的综述主要针对种传病毒研究中出现的问题进行了修正，他发现许多病毒被误归为种传病毒，并认为108种病毒（除隐病毒属之外）
和七种类病毒可以归为种传病毒。从那以后，种传病毒新的发现以及病毒分类原则的更改所导致的变更就时时地在种传病毒名称列表中体现出来。附录一中的内容也相应地进行更新（但并不一定完全）。在本书以后章节中出现的种传病毒缩写形式的全名以及种传病毒的归属请参见表4.2。
种子在植物病毒传播生态学上的重要性越来越受到各界的重视，从而也导致了国
际上检验检疫机构对种子健康加大了检查的力度。与此同时，科学界对于多种杂草作为种传病毒的宿主以及除非杂草得到控制否则杂草种子将成田间病毒库等问题的认识日渐清晰。
1．2．1 从种子中检测病毒
种子中检测病毒即使一门科学又是一门技术，它被种子检测站和植物检疫实验室用
来从大批的种子中筛选出具有耕种价值的种子。
最早用来检测种子是否携带病毒的方法是检测由种子培育的幼苗，也就是所谓的生
长实验。该方法最早被Fajardo 用于从大豆中检测BCMV 。后来该方法又被Mckinney 用于从稗草中检测稗草条状花叶病毒，此外Rohloff 和Hampton 还把该方法用于检测莴苣花叶病毒。在生长实验中，Rohloff （1966）和Phatak （1974）都认为光线的强度以及光源的类型对病毒症状的形成起着至关重要的作用，同时，病毒的株系以及宿主的种类也同病毒在幼苗上症状的发生有着紧密的关系。
与此同时，Lister 和Murant 研究发现，种子在受到由线虫所传播的病毒侵染之后的
特征就是在生长实验时不显示症状。由于病毒在种子中的潜伏性或者症状不明显以及由其它因素所引起的症状和带毒症状之间的相似，从而使得种传病毒的研究人员意识到在生长实验之外必需辅以生物学或者血清学的检测。尽管如此，生长实验在研究种子携带子株传播病毒方面依然具有无可比拟的优势。Quantz 发表了检测BCMV 的方法，首先，接种超敏大豆株系‘Top Crop’的初叶，然后将初叶剪下，接着将初叶放在培养皿中的湿润滤纸上于32℃下用恒定人造光孵育3天。后来，在1962年，这种方法又被用来从大豆种子中检测病毒，略微的修改是让种子在滤纸上预先萌发3-4天。用生物学方法从莴苣种子中高灵敏地检测莴苣花叶病毒率先由Pelet 和Gagnebin 于1963年提出，随后在1967年又得到Marrou 和Messiaen 的补充，具体的方法是，把莴苣种子在缓冲液中磨成粉末然后接种在昆诺阿黎的幼苗上，使用该方法可以从700粒种子中检测出一粒带毒种子。
Hamilton （1965）是率先把血清学技术应用于从种子中检测病毒的人之一，具体的做法就是，把从大麦种子中分离出来的胚压碎涂在小的滤纸盘上，然后把滤纸盘放在琼脂上，琼脂的另一侧则放着浸满BSMV 抗血清的另外一块滤纸盘，如果稗草种子的胚受到BSMV 侵染的话，则琼脂上则呈现用肉眼就可见到的沉淀。在琼脂中加入去污剂可以防止病毒粒子凝结的同时也可把病毒裂解成具有迁移能力的抗原，从而提高检测的灵敏度。病毒和病毒抗血清所形成的特异性条带在大约48小时后依然可见。后来，Slack 和Shepherd 对用琼脂法从小麦和稗草种质中检测BSMV 的方法进行了改良，形成了所谓的放射扩散法。在该法中，把种子刚刚萌发所生成的小叶片（1mm ）压进琼脂中，在琼脂中含有稀释过的抗血清、去污剂以及叠氮化钠。此外，此处制备的抗血清是抗经四氢吡咯消解的病毒蛋白，因此，针对完整病毒颗粒制备的抗血清和经去污剂降解的病毒粒子之间反应较弱。在经过24-36个小时的孵育之后，可以用立体显微镜观察结果。该方法可以在直径为9cm 的琼脂盘上同时观察500-600个样品，其优点就在于可以直接计算带毒率，与此同时，没有携带病毒的种子就可以直接生长，于是就使得种质资源得以保存。在美国蒙大拿州，这两种检测方法都已经成为种子商品评级的常规方法。截
止20世纪七十年代中期，适用于其它病毒的血清学检测方法也相继成型。其中之一便是由Bercks 于1967年开发的乳胶凝集测试。此法相对凝胶扩散法而言具有很高的灵敏度，已发表的文章中称其是检测大麦中BSMV 的可行方法。
电镜是分析病毒的一件利器，但它并不适用于种子是否携带病毒的常规检测，但是，
由Derrick 于1973年开发的免疫吸附电镜却时常被用来检测种子是否带毒或者被用于校正其它检测方法所得结果的合理性。在本书5.5中就早期抗血清方法以及免疫吸附法的基本原理进行了简短的介绍。
和20-30年前相比，现如今我们已经可以用高灵敏度以及高保真的方法来检测病
毒以及检测种子是否携带病毒。在基于抗体的检测方法中，酶联免疫反应法最经常被使用，它的优势在于操作简便、高灵敏度、高保真、适于大规模检测以及部分步骤自动化。建立在核酸为基础上方法，特别是PCR ，以其高特异性和奇高的灵敏度，越来越多地被用于植物病毒检测，其中就包括检测种子是否携带病毒。尽管PCR 法在原理上简单且在病毒检测上有着明显的优势，但是PCR 法和酶联免疫反应法相比其缺点依然很明显，如操作起来不简便以及不适用于大规模检测。目前，科学界对改善和简化PCR 方法的研究正在紧锣密鼓地进行中。
1．3 种传病毒的经济危害
一旦农作物受到病毒的侵染，它将终身与病毒为伍，且往往会导致产量的损失。
单从每年来看，这个损失就相当大，但对于果树这种多年生作物来讲，病毒侵染后的危害更为深远。在世界上，90%的粮食作物是通过种子繁殖的，因此，由于种子携带的病源，包括病毒，所造成的经济损失是相当巨大的。种传病毒所造成的经济损失包括产量锐减或者品质下降等直接损失也包括用于控制作物病势所耗费的间接损失。如前所述，在高效寄主存在的情况下，即便是播种下的种子中只有极少量的种子携带病毒也会造成病毒在整片农田扩散，有的时候会导致所有的植株都获病。因此，举一个例子来说，每公亩所种的种子为25万粒，也就是每平方米的土地上的种子为25粒，这个数字并不高，假若其中有0.1%的种子带毒的话，每公亩土地上感病的植株也只有250株。但是，一旦出现病情之后，这些随机种植的植株就成了病源库。表1.1显示了几种种传病毒所造成的单位面积农作物的损失率。
种传病毒对农作物生产造成严重损失的两个众所周知的例子是，在1957-1970年
间，在美国的蒙大拿州，据估计由BSMV 的侵染而造成的大麦经济损失就高达3千万美圆；在上个世纪50年代，由LMV 病毒侵染而造成的莴苣“六月黄”也导致加利福尼亚州的莴苣生产严重受创。使用完全无病毒种子或者几乎无病毒种子才使得这两件事情最终得以解决。最近的例子就是由于草原受到SCMoV 的侵染而造成澳大利亚奶制品工业巨大损失，据估计每年的损失高达3100万澳大利亚圆。对于瓜类作物来讲，小西葫芦黄花叶病毒是一种危害巨大的病源，它可以导致瓜类产量损失高达90%，但是，该病毒的种传特性在其流行性病学研究中所占角色并不重要，因为，即便是发生种传的话，也只是在极少量种子中。截止到2002年为止，只有5%的南瓜种子中携带有种传病毒。
复合侵染导致农作物产量急剧下滑的原因也许应归结为病毒间的协同效应。豇豆
矮化病是由BCMV 的黑眼豇豆花叶病毒株系和黄瓜花叶病毒共同侵染而造成的，它可导致豇豆种子在数量上和重量上分别减少84%和87%。倘若这两种病毒单独侵染豇豆，则损失要少得多，黄瓜花叶病毒造成的损失为19%和14%，BCMV 的黑眼豇豆花叶病毒株系所造成的损失仅为11%和3%。
如前所述，植物病毒经由种子传播的两大风险就是：（ⅰ）在农作物的代代种植中，
病毒病依然如影随形；（ⅱ）种子贸易使得种子作为一个载体把病害传播到新的地区。和绝大多数经由种子传播的病害相比，病毒病具有明显的特点。病毒侵染的症状往往不明显或者说田间的肉眼观测很难将其定性。相对于其他病害病源的检测而言，如真菌，检测种子是否携带病毒的所需的人力和经济成本更高。同时，尽管科学界就使种子脱毒进行了许多尝试，但是这些方法都会导致种子生命力的降低。
种传病毒所造成的间接损失主要包括农民为控制病害所付出的成本以及在种子评
级和检验检疫过程所产生的损耗。植物病害诊断的其中一个特点就是，对于拿来测试的样品来说，是‘低附加值’的。因此，我们在采取控制措施以及投入成本时，其程度必须和作物的价值以及经济损失的风险做一权衡。目前，有一些例子说明，我们可以使用合格的种子从而有效控制病毒，比如说对前面提到的受BSMV 以及LMV 严重侵害的作物，在这些例子中，经济损失大幅度降低，可以用相对少的经济投入就可几乎消除病毒。
尤其是在发展中国家，农民通常把他们省下的粮食做为来年耕种的种子。正是在
这种耕作传统下，不仅每年收获的粮食中都会有携带病毒的种子，而且病源库的规模也在逐年地扩大。当然另一方面，农民手中种子的带毒率也可能会比种子培育站的低，就如在尼泊尔会偶然在小扁豆种子中发现豇豆种媒花叶病毒。这也就使得在种子培育和生产计划中，培育者的种子以及基本种在成为种质库和商品库之外必须要确保完全无病毒化。除此之外，在培育种子的初期，控制病毒所需要的成本要比种子数量几何增长之后要少的多。
1．4 检测种子是否带毒：为何？
在许多情况下，由于病毒病害而引起的农作物产量的巨大损失是可以预防的，比
如说种植无毒或者带毒率较低的种子。仅凭田间观测来衡量种子商品种植中的带毒率往往是低效的。由于植株较为稠密或者由于病毒-宿主之间相互作用而导致病害症状不明显从而使得病株往往不被注意，也使得基于田间症状而进行诊断的难度很大，甚至无法施行。从检疫学的角度来看，健康植株的体内也可能存在着潜在的侵染，是否存在侵染以及病毒的类型唯有通过检测才可获悉。因此在检疫方面也需要特异性较高的检测方法来检测和剔除病毒或者病毒株系。在种质收集的过程中，也需要种子健康检测来把携带病毒的种子从野性型近亲或者经基因改良的基因型种子中剔除出去以及把在种质分化过程中所引入的病毒检测出来。因此，在种子生产、基因库建立和种子检疫等方面都需要可靠的、特异的以及高灵敏度的病毒检测和诊断方法。
依据病毒、作物种类以及田间条件，尤其作物种植区内存在高效寄主，the degree of freedom from seed-transmissible viruses needed to minimize disease in the field varies 。
1．4．1 种子评级
对于种子检疫和种子评级来说，它们所检测的种传病毒的最低带毒率是完全不一样
的。种子评级的目的在于给种植者提供质量最优化的种子，如果在这个过程中也包括种子健康检测的话，其目的就是通过对种子样品的检测而使得合格种子中的带毒率处于一个满足生产需求的最低限度。但是，就目前的情况来看，人们对于何为最低限度依然是存在很大的分歧。Stace-Smith 和Hamilton （1988）就曾经指出和种传病毒发病的最低阈值相关的数据极度缺乏。按照Jones 的说法，这种相关数据极度缺乏的状况在12年内依然未变。相对于检测技术的日新月异来说，科学界对于检测的结果、病源在田间扩散以及不同侵染率所造成的产量损失这三者之间相互关联所做的研究之少，达到令人惊讶的地步。正如Jones 所说的那样，“科学界需要在投入到植物病毒传播学和投入到细
胞以及分子病毒学这两方面研究的科研资源上来一个更为均衡的分配，尤其是在研究种传病毒时。”
种子携带病毒率的实际阈值必须通过在不同地区、经年的田间试验才能确定下
来，在田间试验中，不同带毒率的种子应该随机成块种植（见第三章）。
在众多的田间试验中，在加利福尼亚州塞林那谷地进行的试验最被人熟知。这个
试验发现，如果不能保证莴苣种子完全不带毒，即便是带毒率小于0.003%，那么莴苣花叶病毒依然可以在该地区大爆发。而在欧洲和那些病毒寄主压力较低的地区以及在那些莴苣并非常年种植的地区（正如塞林那谷地），莴苣种子带毒率为0.1%依然不会造成莴苣花叶病毒的大爆发。在2000年，Jones 报道称，分别历经5年、7年以及7年在西澳大利亚的不同地方于田间试验中为羽扇豆种子中CMV 、地三叶草种子中CMV 以及南苜蓿种子中苜蓿花叶病毒确定了可靠的接种物阈值。
但是，对于发展中国家的绝大多数种植者来说，把经过检验评级的合格种子拿来耕
种有点不太现实。在某些国家，种植者耕种的种子中有90%或者更多是来自上一年收获的种子。在2002年，坦桑尼亚农民96%的种子是上一年存下来的。在这些国家，由于落后的经济使得农民买不起来合格的种子来耕作。尽管农民没有能力检测种子是否携带病毒，但是他们也可以通过简单易行的方式来生产完全不携带病毒或者低带毒率的种子。
1．4．2 检疫
经由胚传播的绝大多数病毒在种子中经年都保持着生命力，且通常只要种子有生命
力，这些病毒就可生存；因此，国际间的种子贸易和交换也使得种子成为病毒长距离传播的常见途径。一些病毒在世界范围内得以迅速扩散无疑就是通过这种途径，如蚕豆花叶病毒借助蚕豆以及PSbMV 借助豌豆。因此，即便是已经知道在某个国家或者地区存在着某种病毒，检验检疫部门也得时刻注意防止该病毒危害性更大的新株系的入境。正如Mathur 所说的那样，检疫部门应该就某些重点种传病毒的现状，包括新病的发生以及病毒新株系的出现，与研究机构保持密切的联系。
在20世纪80年代，花生条纹病毒（后来被定为BCMV 的一个新株系），一种对
花生危害极大的病源，经由从中国进口而来的花生种质而被带到了美国。该种病毒在澳大利亚进出口检疫部门所扣压的花生种子中也有发现。像种子评级那样仅仅对一批种子中的代表样品进行检测是无法摒除种子所携带的病害。对于诸如种质这样小批量的种子来说，是可以获得零耐受水平。
近年来，澳大利亚进出口检疫检验部门多次从进口而来的种质库中发现种子系被侵
染现象，其中，在1978-1981年间，9.6%(29/302)的豇豆和17.5%（54/309）大豆以及菜豆的受到种传病毒的侵染。绝大多数受侵染的子代都呈现出明显的症状，病毒具体的属性通过生物学、血清学以及电镜学的方法就可确定。在澳大利亚，从外国进口的多年生作物的种子被种植在无寄主的温室中，只有那些从完全不带病毒植株收获而来的种子才进入市场。Jones 认为，目前，迫切需要建立完全无病毒的种质库，这样就使得那些检验检疫体系不完善的国家能够进口到不带病毒的种子，在改善这些国家农作物生产的同时又不会引发新的病害问题。通过这种方式摒除种质中的病毒不可避免地就会造成种子投入生产的延后。对种子非破坏性的检测会相应地缩短这段延后期。但是，这种方法只适用于一部分病毒宿主之间。
直到20世纪的70年代，PSbMV 在北美豌豆培育计划中大爆发，科学家们才意识
到美国的豌豆种质库是PSbMV 的主要来源。最近几年来，在世界性的种子公司所出售的豌豆种子也检测到这种病毒。
在由美国农业部植物引种机构引种的豌豆中，来自印度北部的豌豆种子携带
PSbMV 的频率高达138/472（批/批），与此同时，也在北印度发现了33批引种豌豆为免疫种质。相比而言，从发达国家引种的500批豌豆中无一含有针对PSbMV 的免疫种质。PSbMV 病毒库和抗PSbMV 的豌豆种质在北印度的区域性集中分布在全世界是独一无二的，这种集中分布在其它地区并不存在。因此，有人推测北印度地区是PSbMV 传播的源头，PSbMV 正是从这个地方扩散到世界的其他地方。
从美国豌豆众多的种质库系中把PSbMV 这种危害极大的病源剔除是一个长期的
工程，在1976年，由美国三个实验室组成的工作小组，它们的目的就是从豌豆种质中剔除PSbMV ，当时由于病毒的危害严重，该计划并位被种植者所看好。从每一批的种子中，选取大量的种子种植在无寄主的温室中，一旦植株出现症状就被剔除掉，进而从每一批中选择至少24个表型、外表健康的植株作为母代来繁殖种子。这些植株在生长的过程中至少要做一次酶联免疫反应来加以检测，从无毒植株收获的种子就作为完全不携毒种子贮存为种质库。在1988-1991年，这个小组一共对2700批种子进行无病毒化处理。据从事研究的科学家们称，使用这种方法仅会导致种质极少数遗传多样性的消失。 在其他作物上中建立完全不携病毒种质库的努力也已进行 ，如美国对豇豆，巴西
对花生。不幸的是，在那些种传病毒和昆虫传病毒猖獗的地区无毒种子所长出的植株最终也会受到病毒的侵染，损失依然严重。
在3.2.2和7.3中，有关种传病毒的检疫也将进一步探讨。