从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰。包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2）主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而后者则属于基因重组和定点突变的方法。下面对蛋白质的四种化学修饰进行了介绍：
1 蛋白质的磷酸化修饰
1.1 蛋白质磷酸化的主要类型与功能
磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类, 即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐.O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的, 如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸, 羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚;N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的; 酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成; 而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成.
蛋白质磷酸化具有以下功能: (1) 磷酸化参与酶作用机制, 在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐), 如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统( PTR) 的组氨酸蛋白激酶(HPr) ; (2) 磷酸化介导蛋白活性, 蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化, 如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基) ; (3) 天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离.
1.2 磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记
传统磷酸化蛋白质分析大多利用P 放射性标记.Lees-Miller 和Anderson 利用放射性P 对人体内的两种热休克蛋白进行了标记, 最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点. de Carvalho等在昆虫细胞表达了人的单核细胞中的细胞质磷脂酶A2 ,并采用放射性P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点. 尽管人们至今仍广泛地运用放射性同位素标记法分析蛋白质磷酸化, 但是这种方法的固有缺点是显而易见的. 首先, 这种方法存在放射性污染问题; 其次, 在某一专一蛋白激酶或者蛋白质体外磷酸化条件还不清楚的情况下, 需要分析内源性蛋白质磷酸化时, 这种方法就无能为力了.
从20世纪80年代起, 人们开始研究蛋白质磷酸化分析的非放射性方法.Meyer 等报道了用ABI470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸, 并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH 衍生物. 车发云等进一步建立了运用毛细管电泳同时非放射性分析蛋白质或多肽中的各种O-磷酸化氨基酸的方法, 可以在低pmol 范围同时分析所有3种PTH-磷酸化氨基酸, 进而可分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基, 运用此方法他们对3个模型磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β-酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析. 车发云和夏其昌还对磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记进行了报道, 他们以七肽LRRASLG(肯普肽Kemptide) 为蛋白激酶A 的底物模型, 研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件, 以及标记产物的性质, 为荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性研究提供了一种新的方法. 杨琴等利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究.
同位素编码亲和标签(ICAT)作为蛋白水平定量的质量标签, 已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究. 磷酸同位素标记亲和标签(PhIAT)是一种含两个不同质量的生物素亲和标签, 实际上就是用不同的化学方法处理磷酸肽, 从而标记出修饰位点. 现已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白/肽的方法. Goshe 等将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中, 通过β消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H 3PO 4, 形成的双键受到硫代二乙醇的作用, 巯基取代磷酸根. 生物素与巯基相连, 标记过的蛋白肽用色谱分离. Zhou等用另外一种方法修饰磷酸化肽, 用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分, 修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合, 酸洗涤释放. 此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸.
1.3 磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集
目前, 在磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集的研究中经常使用的方法有以下几种:固相金属亲和色谱，免疫沉淀，双向凝胶电泳，高效液相色谱，双相磷酸多肽谱图，流式细胞仪。
1.4 磷酸化肽及磷酸化位点分析
随着质谱技术的产生和蛋白质组学的发展, 各种质谱技术逐渐被应用于磷酸肽分析及磷酸化位点鉴定研究, 常用的方法有以下几
种:MALDI-TOF-MS与磷酸酯酶处理相结合，源后裂解，基于MALDI-TOF-MS 的其他分析方法，前体离子扫描， 中性丢失扫描，逐级改变取样锥电势，P 检测，电子捕获解离。 31[7][6][7][5][4][3][2][1]323232
2 蛋白质的PEG 化学修饰
蛋白质的PEG 修饰主要包括:蛋白质分子的侧链基团的改变和蛋白质分子中主链结构的改变两个方面。关于侧链基团修饰的研究较多。化学修饰反应的活性和选择性主要由蛋白质功能基的反应活性及修饰剂的反应活性决定。其中蛋白质功能基的活性由微区极性和空阻效应决定。修饰剂的反应活性主要取决于修饰剂分子中官能团的类型。
2.2 化学修饰方法
PEG 修饰的基团主要是氨基、巯基和羧基等。现已获得一些PEG 定向修饰蛋白质的方法。下面主要介绍常用的一些方法。
2.2.1 氨基修饰
蛋白质分子表面的游离氨基(主要为Lys 残基侧链的氨基) 具有较高的亲核反应活性。因此Lys 残基的氨基成为最方便, 最常用的被修饰基团。PEG 的分子量大多为5kD 。目前最常用的活化剂有氰尿酰氯(亦称三聚氯氰) 和N-羟基琥珀酰亚胺。
(1)氰尿酰氯法特点是试剂易得、活化简单、反应时间短、方便经济。但其对有些酶(例如:SOD)的活性有影响。这种活化中间物有两种形式:一种是一分子氰尿酰氯与一分子PEG 偶联(PEG1);另一种是一分子氰尿酞氯与两分子PEG 偶联(PEG2)。通常PEG2修饰的蛋白质效果要更好。它可以在较低的修饰程度下获得解除免疫原性产物, 而且生物活性保留明显高于PEG1修饰的产物。
(2)在pH=7～9条件下,PEG 的N-羟基琥珀酰亚胺酯类化合物可以直接修饰残基上的氨基。将PEG 上的羟基转化为羧基, 其中最常用的是通过羟基与琥珀酸酐反应, 所得衍生物化合物为PEG 琥珀酰亚胺琥珀酸酯。
此外,N-末端氨基修饰也是一种常用的修饰方法。蛋白质N 端氨基的pKa(7.6～8.0), 小于蛋白质其他部位的氨基(如赖氨酸的pKa 为10.0～10.2) 。因此, 在较低pH 值(如pH 5.0)溶液中,PEG-醛主要与N-端氨基反应生产希夫碱, 后被还原为仲胺。
2.2.2 巯基修饰
蛋白质上的修饰基团多为亲核性的, 其活性的顺序是:巯基>α-氨基>ε-氨基>羟基。所以可以选取能够特异性PEG 修饰剂对数目稀少巯基进行定向修饰。此类PEG 修饰剂主要有:
(1)PEG-马来酰亚胺(PEG-maleimide);
(2)PEG-邻-吡啶-二硫醚(PEG-ortho-pyridyl-disulphide);
(3)PEG-乙烯基砜(PEG-vinyl sulfone);
(4)PEG-碘乙酰胺(PEG-idoacetamide)。
其中,PEG-马来酰亚胺应用较多。但产物在水中不够稳定, 容易发生开环反应。Winslow 等在PEG 与马来酰亚胺之间添加芳香环作连接基团, 并用来修饰血红蛋白质, 取得了更佳的修饰专一性。
对于缺少巯基的蛋白质, 可以通过基因工程在蛋白质的合适位置引入巯基, 再用相应PEG 进行修饰。常用的引入位置有糖基化蛋白质的糖基化位置、蛋白质的抗原决定簇和蛋白质末端等。此外, 还可用Traut 试剂处理蛋白质引入巯基。此方法方便可靠, 目前应用最为广泛。但缺点是半胱氨酸在蛋白质内多为重要活性基团。因此这样修饰有可能影响活性。
2.2.3 羧基的修饰
把PEG 分子中的羟基转化为氨基, 然后在羧二亚胺存在下与蛋白质的羧基缩合, 得到修饰的蛋白质。
对蛋白质进行修饰时, 关键是修饰剂的选择和修饰路线的确定。修饰路线的确定, 要考虑使修饰蛋白质能最大限度地保留原来生物活性, 要能使其免疫原性降至最小程度, 甚至完全解除, 其中最佳修饰度的确定非常重要。修饰剂的选择要考虑其结构与性质, 还要考虑其分子量大小。所以这两方面的选择是很重要的。
蛋白质的PEG 修饰在抗肿瘤蛋白质中有一些应用，例如PEG-重组人白细胞介素-2（rhIL-2），PEG-天门冬酞胺酶。 [9][8]
3 蛋白质糖基化修饰
3.1 糖基化类型
糖蛋白中的糖部分被称为聚糖。而己糖则是聚糖中最常见的组分。包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖以及他们的一些简单修饰形式，如葡萄糖的α-羟基被酰化氨基取代生成N-乙酰葡糖胺。根据蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分成以下四类[10]：
3.1.1 O位糖基化
聚糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的氧连接来修饰蛋白质。此糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上, 但并没有发现特异的序列作为糖基化位点.O 位多聚糖以逐步加接单糖的形式形成低聚糖，但也有些只连接一个单糖的。
3.1.2 N位糖基化
聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰蛋白质。在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺（GlcNAc ），而且连接方式总是β构型。
N 位糖基化根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。在N 位糖基化中Asn-Xaa-Ser ／Thr （Xaa 是除Pro 外的任何氨基酸）被认为是N 位糖基化的先决条件，不过少数情况下Asn-Xaa-Cys 序列也可以糖基化。
3.1.3 C位糖基化
一分子甘露糖基通过C-C 键连接到色氨酸吲哚环2号位C 上，以此形式修饰蛋白质。这种糖基化多发生在W-X-X-W W-X-X-C 或者W-X-X-F 序列的第一个色氨酸残基上。在生命体中，这种糖基化并不多见。
3.1.4 糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphophatidyl inositol，GPI ）锚定连接
糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphophatidyl inositol ，GPI ）锚定连接是指包含糖核心在内的GPI 锚通过与蛋白C 端部位结合把蛋白连接到细胞膜上。不同GPI 锚结构中的多糖成分是不同的。GPI 锚的一般结构主要是由乙醇胺，糖核心和肌醇连接而成，肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，乙醇胺则与蛋白质的羧基端相连。生物体中，许多蛋白质存在此类糖基化，包括一些水解酶、黏附蛋白、免疫蛋白、补体调节蛋白等。
3.2 糖基化修饰的研究方法
3.2.1 糖蛋白分离
3.2.1.1 “糖基捕获”（glyco-catching ）法
此法主要根据凝集素能特异性识别并结合一个或几个特异糖基这一性质，对糖蛋白进行的分离纯化。常用的凝集素有菜豆凝集素（phaseolus vulgaris agglutinin，PHA ），麦芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA ），伴刀豆凝集素A （Concanavalin ，Con A）等。“糖基捕获”法的基本步骤，首先是把样品通过第一次凝集素亲和层析，然后进行酶解，再把酶解的肽段进行第二次凝集素亲和层析，所用的凝集素与第一次的相同，最后再通过高效液相色谱分离，进入后续质谱测序等研究工作。
3.2.1.2 荧光染料染色法
该方法建立在蛋白质组学技术基础上，利用高通量的双向凝胶电泳技术先分离总蛋白，然后再结合一些特殊荧光染料对糖蛋白进行染色。如Pro-Q Emerald 488染料能够与高碘酸氧化后的糖蛋白共价结合，产生高荧光共轭化合物，此共轭化合物在473 nm或者488 nm波长激发下能产生绿色荧光信号，这样就能很好的将糖蛋白在凝胶上显示出来了，此凝胶还可以用SYPRORuby 染料等进行后染色，显示总蛋白。此方法能检测到5～8 ng的糖蛋白，这主要取决于蛋白糖基化程度的不同和糖成分的不同。该灵敏度比标准的PAS 法（eriodic acid Schiff’s mechanism ， 高碘酸Schiff ’s 法）高出8～16倍。Zhou 等利用此方法比较了正常人肝细胞系Chang ’s liver，无转移潜能人肝细胞肝癌细胞系Hep3B 和高转移潜能人肝细胞肝癌细胞系MHCC97H 三者之间的糖蛋白差异，并发现了一些差异，为肝细胞性肝癌的诊治打下了良好的基础。
3.2.1.3 液相色谱技术
该技术主要根据糖蛋白的独特性质把它从蛋白混合物中分离出来，包括分子排阻层析（SEC ），亲水作用液相色谱（HILIC ），毛细管液相色谱（CapLC ）等等。几种色谱串连可以形成多维液相色谱，提高分离效果。Takahashi 等建立三维糖谱图技术分离并鉴定人血清糖蛋白．用N-寡聚糖糖肽酶消化糖肽释放出聚糖，经PA 衍生在HPLC 上，先后经过二乙基氨基乙基离子交换柱、C18疏水柱和硅酰胺亲水柱分离，洗脱数据分别列在z 、x 和y 轴，获得人血清糖蛋白的三维液相糖谱图，借助连续的外切糖苷酶消化目标聚糖点获得结构信息。
3.2.2 糖基化位点分析
随着质谱技术的不断发展，质谱已成为蛋白质组中最主要的技术之一。同时它也是分析糖蛋白应用最广泛的技术。特别是在糖基化位点分析，质谱技术有其独特的优势。其基本原理是通过电泳、层析等方法先富集糖蛋白，然后进行质谱分析，由于在质谱中，糖蛋白骨架包括糖骨架和蛋白骨架都会有一定的断裂规律，所以根据质谱所得到的图谱我们可以进行糖基化位点，蛋白序列，糖结构等分析工作。质谱发展到现在已经形成了多种体系，可以满足不同的研究需要。目前主要的电离方法是ESI 和MALDI ， 主要的质量分析器飞行时间
（time-of-flight ）、四级杆（quadrupole ）、离子阱（ion trap ）和傅立叶变换离子回旋共振质谱（fourier transform ion cyclotron) 。另外还有一些主要的解离技术， 如碰撞诱导解离（CID ）、电子捕获解离（ECD ）、电子转移解离（ETD ）和红外线多光子解离（IRMPD ）等。他们之间的不同组合可以产生不同的信息。在实际研究中我们可以根据需要选用不同的质谱技术。例如，在分析糖蛋白时，我们只需要糖骨架信息时，我们可以选用低能量的碰撞诱导解离肽段（或者用红外线辐射解离）， 然后用ESI-Q-TOF MS即可，因为此种条件主要只是糖骨架的段裂，肽骨架很少发生段裂。但是如果同时还需要肽段的信息时，就要用高能量的碰撞诱导解离肽段或者选用MALDI-TOF ／ TOF MS ，当然ECD 和ETD 也可以参考使用。在得到质谱图后，后面的分析工作同样非常繁重，需要借助计算机，用软件（如：GlycoMod 、GlycoX ）来帮助完成。Wada 等利用MALDI 离子阱质谱仪，将经酶消化后的糖肽段，通过碰撞诱导解离（CID ），将其变为小片段，再经过多级串联质谱技术分析， 有效地鉴定了β2-糖蛋白I 及其4个N-糖基化位点。Suzuki 等用木瓜蛋白酶酶解小鸡血浆中的IgG ，通过HPLC 纯化后， 采用MALDI —TOF 技术分析了小鸡血浆IgG 的N-糖基化类型及其特异性糖基化位点。Cieniewski-Bernard 等利用MALDI —TOF 鉴定出老鼠骨骼肌中的14种0-糖基化蛋白，分别参与信号转导、能量代谢和肌肉收缩等生理过程。
另外，同位素标记结合质谱分析在糖基化位点分析中也起着重要作用。主要过程同glycocatching 法类似，只是在第二次亲和层析之后，增加了用特异性酶（如PNGase F ）在H 2 O 中酶解糖基化蛋白这一过程， 然后再进入LCMS 过程。这样在质谱图中通过H182O 所引起的2个单位分子量的差异就可以鉴定糖基化位点的存在。
18
4 蛋白质异戊二烯化修饰[11]
已知Ras 等100多种与信号传递或肿瘤发生有关的蛋白质要行使功能, 翻译后必需进行异戊二烯化修饰, 这些蛋白质明显的一个结构特点就是它们的羧基端为CysAAX 结构; 修饰这些蛋白质的聚异戊二烯基团有2种; 法尼基和忧牛儿基拢牛儿基分别经过法尼基蛋白转移酶和牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶的催化而加到CysAAX 结构中的Cys 残基上; 两种酶都是由α和β两种亚基组成的二聚体, 它们的α亚基相同, 而β亚基不同, 正是β亚基很有希望成为癌症治疗过程中药物的靶子。
从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰。包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2）主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而后者则属于基因重组和定点突变的方法。下面对蛋白质的四种化学修饰进行了介绍：
1 蛋白质的磷酸化修饰
1.1 蛋白质磷酸化的主要类型与功能
磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类, 即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐.O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的, 如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸, 羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚;N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的; 酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成; 而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成.
蛋白质磷酸化具有以下功能: (1) 磷酸化参与酶作用机制, 在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐), 如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统( PTR) 的组氨酸蛋白激酶(HPr) ; (2) 磷酸化介导蛋白活性, 蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化, 如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基) ; (3) 天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离.
1.2 磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记
传统磷酸化蛋白质分析大多利用P 放射性标记.Lees-Miller 和Anderson 利用放射性P 对人体内的两种热休克蛋白进行了标记, 最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点. de Carvalho等在昆虫细胞表达了人的单核细胞中的细胞质磷脂酶A2 ,并采用放射性P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点. 尽管人们至今仍广泛地运用放射性同位素标记法分析蛋白质磷酸化, 但是这种方法的固有缺点是显而易见的. 首先, 这种方法存在放射性污染问题; 其次, 在某一专一蛋白激酶或者蛋白质体外磷酸化条件还不清楚的情况下, 需要分析内源性蛋白质磷酸化时, 这种方法就无能为力了.
从20世纪80年代起, 人们开始研究蛋白质磷酸化分析的非放射性方法.Meyer 等报道了用ABI470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸, 并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH 衍生物. 车发云等进一步建立了运用毛细管电泳同时非放射性分析蛋白质或多肽中的各种O-磷酸化氨基酸的方法, 可以在低pmol 范围同时分析所有3种PTH-磷酸化氨基酸, 进而可分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基, 运用此方法他们对3个模型磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β-酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析. 车发云和夏其昌还对磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记进行了报道, 他们以七肽LRRASLG(肯普肽Kemptide) 为蛋白激酶A 的底物模型, 研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件, 以及标记产物的性质, 为荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性研究提供了一种新的方法. 杨琴等利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究.
同位素编码亲和标签(ICAT)作为蛋白水平定量的质量标签, 已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究. 磷酸同位素标记亲和标签(PhIAT)是一种含两个不同质量的生物素亲和标签, 实际上就是用不同的化学方法处理磷酸肽, 从而标记出修饰位点. 现已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白/肽的方法. Goshe 等将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中, 通过β消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H 3PO 4, 形成的双键受到硫代二乙醇的作用, 巯基取代磷酸根. 生物素与巯基相连, 标记过的蛋白肽用色谱分离. Zhou等用另外一种方法修饰磷酸化肽, 用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分, 修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合, 酸洗涤释放. 此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸.
1.3 磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集
目前, 在磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集的研究中经常使用的方法有以下几种:固相金属亲和色谱，免疫沉淀，双向凝胶电泳，高效液相色谱，双相磷酸多肽谱图，流式细胞仪。
1.4 磷酸化肽及磷酸化位点分析
随着质谱技术的产生和蛋白质组学的发展, 各种质谱技术逐渐被应用于磷酸肽分析及磷酸化位点鉴定研究, 常用的方法有以下几
种:MALDI-TOF-MS与磷酸酯酶处理相结合，源后裂解，基于MALDI-TOF-MS 的其他分析方法，前体离子扫描， 中性丢失扫描，逐级改变取样锥电势，P 检测，电子捕获解离。 31[7][6][7][5][4][3][2][1]323232
2 蛋白质的PEG 化学修饰
蛋白质的PEG 修饰主要包括:蛋白质分子的侧链基团的改变和蛋白质分子中主链结构的改变两个方面。关于侧链基团修饰的研究较多。化学修饰反应的活性和选择性主要由蛋白质功能基的反应活性及修饰剂的反应活性决定。其中蛋白质功能基的活性由微区极性和空阻效应决定。修饰剂的反应活性主要取决于修饰剂分子中官能团的类型。
2.2 化学修饰方法
PEG 修饰的基团主要是氨基、巯基和羧基等。现已获得一些PEG 定向修饰蛋白质的方法。下面主要介绍常用的一些方法。
2.2.1 氨基修饰
蛋白质分子表面的游离氨基(主要为Lys 残基侧链的氨基) 具有较高的亲核反应活性。因此Lys 残基的氨基成为最方便, 最常用的被修饰基团。PEG 的分子量大多为5kD 。目前最常用的活化剂有氰尿酰氯(亦称三聚氯氰) 和N-羟基琥珀酰亚胺。
(1)氰尿酰氯法特点是试剂易得、活化简单、反应时间短、方便经济。但其对有些酶(例如:SOD)的活性有影响。这种活化中间物有两种形式:一种是一分子氰尿酰氯与一分子PEG 偶联(PEG1);另一种是一分子氰尿酞氯与两分子PEG 偶联(PEG2)。通常PEG2修饰的蛋白质效果要更好。它可以在较低的修饰程度下获得解除免疫原性产物, 而且生物活性保留明显高于PEG1修饰的产物。
(2)在pH=7～9条件下,PEG 的N-羟基琥珀酰亚胺酯类化合物可以直接修饰残基上的氨基。将PEG 上的羟基转化为羧基, 其中最常用的是通过羟基与琥珀酸酐反应, 所得衍生物化合物为PEG 琥珀酰亚胺琥珀酸酯。
此外,N-末端氨基修饰也是一种常用的修饰方法。蛋白质N 端氨基的pKa(7.6～8.0), 小于蛋白质其他部位的氨基(如赖氨酸的pKa 为10.0～10.2) 。因此, 在较低pH 值(如pH 5.0)溶液中,PEG-醛主要与N-端氨基反应生产希夫碱, 后被还原为仲胺。
2.2.2 巯基修饰
蛋白质上的修饰基团多为亲核性的, 其活性的顺序是:巯基>α-氨基>ε-氨基>羟基。所以可以选取能够特异性PEG 修饰剂对数目稀少巯基进行定向修饰。此类PEG 修饰剂主要有:
(1)PEG-马来酰亚胺(PEG-maleimide);
(2)PEG-邻-吡啶-二硫醚(PEG-ortho-pyridyl-disulphide);
(3)PEG-乙烯基砜(PEG-vinyl sulfone);
(4)PEG-碘乙酰胺(PEG-idoacetamide)。
其中,PEG-马来酰亚胺应用较多。但产物在水中不够稳定, 容易发生开环反应。Winslow 等在PEG 与马来酰亚胺之间添加芳香环作连接基团, 并用来修饰血红蛋白质, 取得了更佳的修饰专一性。
对于缺少巯基的蛋白质, 可以通过基因工程在蛋白质的合适位置引入巯基, 再用相应PEG 进行修饰。常用的引入位置有糖基化蛋白质的糖基化位置、蛋白质的抗原决定簇和蛋白质末端等。此外, 还可用Traut 试剂处理蛋白质引入巯基。此方法方便可靠, 目前应用最为广泛。但缺点是半胱氨酸在蛋白质内多为重要活性基团。因此这样修饰有可能影响活性。
2.2.3 羧基的修饰
把PEG 分子中的羟基转化为氨基, 然后在羧二亚胺存在下与蛋白质的羧基缩合, 得到修饰的蛋白质。
对蛋白质进行修饰时, 关键是修饰剂的选择和修饰路线的确定。修饰路线的确定, 要考虑使修饰蛋白质能最大限度地保留原来生物活性, 要能使其免疫原性降至最小程度, 甚至完全解除, 其中最佳修饰度的确定非常重要。修饰剂的选择要考虑其结构与性质, 还要考虑其分子量大小。所以这两方面的选择是很重要的。
蛋白质的PEG 修饰在抗肿瘤蛋白质中有一些应用，例如PEG-重组人白细胞介素-2（rhIL-2），PEG-天门冬酞胺酶。 [9][8]
3 蛋白质糖基化修饰
3.1 糖基化类型
糖蛋白中的糖部分被称为聚糖。而己糖则是聚糖中最常见的组分。包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖以及他们的一些简单修饰形式，如葡萄糖的α-羟基被酰化氨基取代生成N-乙酰葡糖胺。根据蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分成以下四类[10]：
3.1.1 O位糖基化
聚糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的氧连接来修饰蛋白质。此糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上, 但并没有发现特异的序列作为糖基化位点.O 位多聚糖以逐步加接单糖的形式形成低聚糖，但也有些只连接一个单糖的。
3.1.2 N位糖基化
聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰蛋白质。在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺（GlcNAc ），而且连接方式总是β构型。
N 位糖基化根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。在N 位糖基化中Asn-Xaa-Ser ／Thr （Xaa 是除Pro 外的任何氨基酸）被认为是N 位糖基化的先决条件，不过少数情况下Asn-Xaa-Cys 序列也可以糖基化。
3.1.3 C位糖基化
一分子甘露糖基通过C-C 键连接到色氨酸吲哚环2号位C 上，以此形式修饰蛋白质。这种糖基化多发生在W-X-X-W W-X-X-C 或者W-X-X-F 序列的第一个色氨酸残基上。在生命体中，这种糖基化并不多见。
3.1.4 糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphophatidyl inositol，GPI ）锚定连接
糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphophatidyl inositol ，GPI ）锚定连接是指包含糖核心在内的GPI 锚通过与蛋白C 端部位结合把蛋白连接到细胞膜上。不同GPI 锚结构中的多糖成分是不同的。GPI 锚的一般结构主要是由乙醇胺，糖核心和肌醇连接而成，肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，乙醇胺则与蛋白质的羧基端相连。生物体中，许多蛋白质存在此类糖基化，包括一些水解酶、黏附蛋白、免疫蛋白、补体调节蛋白等。
3.2 糖基化修饰的研究方法
3.2.1 糖蛋白分离
3.2.1.1 “糖基捕获”（glyco-catching ）法
此法主要根据凝集素能特异性识别并结合一个或几个特异糖基这一性质，对糖蛋白进行的分离纯化。常用的凝集素有菜豆凝集素（phaseolus vulgaris agglutinin，PHA ），麦芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA ），伴刀豆凝集素A （Concanavalin ，Con A）等。“糖基捕获”法的基本步骤，首先是把样品通过第一次凝集素亲和层析，然后进行酶解，再把酶解的肽段进行第二次凝集素亲和层析，所用的凝集素与第一次的相同，最后再通过高效液相色谱分离，进入后续质谱测序等研究工作。
3.2.1.2 荧光染料染色法
该方法建立在蛋白质组学技术基础上，利用高通量的双向凝胶电泳技术先分离总蛋白，然后再结合一些特殊荧光染料对糖蛋白进行染色。如Pro-Q Emerald 488染料能够与高碘酸氧化后的糖蛋白共价结合，产生高荧光共轭化合物，此共轭化合物在473 nm或者488 nm波长激发下能产生绿色荧光信号，这样就能很好的将糖蛋白在凝胶上显示出来了，此凝胶还可以用SYPRORuby 染料等进行后染色，显示总蛋白。此方法能检测到5～8 ng的糖蛋白，这主要取决于蛋白糖基化程度的不同和糖成分的不同。该灵敏度比标准的PAS 法（eriodic acid Schiff’s mechanism ， 高碘酸Schiff ’s 法）高出8～16倍。Zhou 等利用此方法比较了正常人肝细胞系Chang ’s liver，无转移潜能人肝细胞肝癌细胞系Hep3B 和高转移潜能人肝细胞肝癌细胞系MHCC97H 三者之间的糖蛋白差异，并发现了一些差异，为肝细胞性肝癌的诊治打下了良好的基础。
3.2.1.3 液相色谱技术
该技术主要根据糖蛋白的独特性质把它从蛋白混合物中分离出来，包括分子排阻层析（SEC ），亲水作用液相色谱（HILIC ），毛细管液相色谱（CapLC ）等等。几种色谱串连可以形成多维液相色谱，提高分离效果。Takahashi 等建立三维糖谱图技术分离并鉴定人血清糖蛋白．用N-寡聚糖糖肽酶消化糖肽释放出聚糖，经PA 衍生在HPLC 上，先后经过二乙基氨基乙基离子交换柱、C18疏水柱和硅酰胺亲水柱分离，洗脱数据分别列在z 、x 和y 轴，获得人血清糖蛋白的三维液相糖谱图，借助连续的外切糖苷酶消化目标聚糖点获得结构信息。
3.2.2 糖基化位点分析
随着质谱技术的不断发展，质谱已成为蛋白质组中最主要的技术之一。同时它也是分析糖蛋白应用最广泛的技术。特别是在糖基化位点分析，质谱技术有其独特的优势。其基本原理是通过电泳、层析等方法先富集糖蛋白，然后进行质谱分析，由于在质谱中，糖蛋白骨架包括糖骨架和蛋白骨架都会有一定的断裂规律，所以根据质谱所得到的图谱我们可以进行糖基化位点，蛋白序列，糖结构等分析工作。质谱发展到现在已经形成了多种体系，可以满足不同的研究需要。目前主要的电离方法是ESI 和MALDI ， 主要的质量分析器飞行时间
（time-of-flight ）、四级杆（quadrupole ）、离子阱（ion trap ）和傅立叶变换离子回旋共振质谱（fourier transform ion cyclotron) 。另外还有一些主要的解离技术， 如碰撞诱导解离（CID ）、电子捕获解离（ECD ）、电子转移解离（ETD ）和红外线多光子解离（IRMPD ）等。他们之间的不同组合可以产生不同的信息。在实际研究中我们可以根据需要选用不同的质谱技术。例如，在分析糖蛋白时，我们只需要糖骨架信息时，我们可以选用低能量的碰撞诱导解离肽段（或者用红外线辐射解离）， 然后用ESI-Q-TOF MS即可，因为此种条件主要只是糖骨架的段裂，肽骨架很少发生段裂。但是如果同时还需要肽段的信息时，就要用高能量的碰撞诱导解离肽段或者选用MALDI-TOF ／ TOF MS ，当然ECD 和ETD 也可以参考使用。在得到质谱图后，后面的分析工作同样非常繁重，需要借助计算机，用软件（如：GlycoMod 、GlycoX ）来帮助完成。Wada 等利用MALDI 离子阱质谱仪，将经酶消化后的糖肽段，通过碰撞诱导解离（CID ），将其变为小片段，再经过多级串联质谱技术分析， 有效地鉴定了β2-糖蛋白I 及其4个N-糖基化位点。Suzuki 等用木瓜蛋白酶酶解小鸡血浆中的IgG ，通过HPLC 纯化后， 采用MALDI —TOF 技术分析了小鸡血浆IgG 的N-糖基化类型及其特异性糖基化位点。Cieniewski-Bernard 等利用MALDI —TOF 鉴定出老鼠骨骼肌中的14种0-糖基化蛋白，分别参与信号转导、能量代谢和肌肉收缩等生理过程。
另外，同位素标记结合质谱分析在糖基化位点分析中也起着重要作用。主要过程同glycocatching 法类似，只是在第二次亲和层析之后，增加了用特异性酶（如PNGase F ）在H 2 O 中酶解糖基化蛋白这一过程， 然后再进入LCMS 过程。这样在质谱图中通过H182O 所引起的2个单位分子量的差异就可以鉴定糖基化位点的存在。
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4 蛋白质异戊二烯化修饰[11]
已知Ras 等100多种与信号传递或肿瘤发生有关的蛋白质要行使功能, 翻译后必需进行异戊二烯化修饰, 这些蛋白质明显的一个结构特点就是它们的羧基端为CysAAX 结构; 修饰这些蛋白质的聚异戊二烯基团有2种; 法尼基和忧牛儿基拢牛儿基分别经过法尼基蛋白转移酶和牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶的催化而加到CysAAX 结构中的Cys 残基上; 两种酶都是由α和β两种亚基组成的二聚体, 它们的α亚基相同, 而β亚基不同, 正是β亚基很有希望成为癌症治疗过程中药物的靶子。