九孔鲍鱼纤维素酶的分离纯化与性质分析

第3期

2010年6月

第10卷

中国食品学报

Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology

Vol．10No．3Jun ．2010

九孔鲍鱼纤维素酶的分离纯化与性质分析

孙乐常

巫朝华

蔡秋凤

张凌晶

苏文金

曹敏杰*

（集美大学生物工程学院

摘要

福建厦门361021）

采用SP-Sepharose 阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析、Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析和Hydrox -

yapatite 羟基磷灰石柱层析，从九孔鲍鱼（Haliotis diversicolor ）消化腺中分离纯化到一种纤维素酶。SDS-PAGE

结果显示，该酶的分子质量约为55kDa 。该酶水解羧甲基纤维素钠的最适温度50℃，最适pH 5.5。该酶在温度

40℃以下，pH 5.0～7.0之间具有较好的稳定性。

关键词文章编号

鲍鱼；纤维素酶；纯化；性质

1009-7848（2010）03-0076-07

每年地球上绿色植物的光合作用产生大于题[3]，限制了纤维素酶的发展。因此，如何获得一种稳定性好，活力好的纤维素酶是当今该领域的关键问题。

100亿t 的植物材料，其中至少三分之一是纤维

素[1]。除少数软体动物、甲虫自身能产生纤维素酶，反刍动物通过瘤胃微生物发酵利用纤维素外，其它动物对纤维素利用率很低或因自身缺乏纤维素酶而不能利用纤维素。对人类而言，纤维素是自然界中数量最大的可再生性物质，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。对纤维素酶的研究已成为21世纪各国饲料、营养等领域科研人员共同关注的课题。

纤维素酶（cellulase ）是降解纤维素糖苷键生成葡萄糖的一类多组分酶系。1924年Cleveland 在研究白蚁（Reticulitermes flavipes ）的纤维素酶时发现其体内的纤维素酶是消化肠腺中的微生物分泌产生的[2]。此后，人们对纤维素酶的研究主要集中在微生物的身上，并长期致力于分离、鉴定能降解纤维素和产生纤维素酶的各种微生物。迄今为止，微生物纤维素酶的分离纯化方法已成熟，其作用机制及分子结构也已解明，然而现有纤维素酶产生菌存在产酶能力低下且组分不平衡等问

1963年，Marshall 等人首次证明了蜗牛中动物内源性酶的存在[2]；1998年，Smant 等用分子生

物学方法从植物寄生的线虫中得到内切β-1，4-葡聚糖酶的cDNA [4]，进一步证明了动物体内存在内源性纤维素酶。动物内源性纤维素酶因其特殊性质，故成为纤维素酶研究领域的热点。2000年，

Xu 等在紫贻贝（Mytilus edulis ）中分离到一种耐

热的低分子质量（约19.7kDa ）的纤维素酶并确定其一级结构[5]；同年，Nakashima 等人从一种低等白蚁（Coptotermes formosanus ）中分离到一分子质量为48kDa 的内切β-1，4-葡聚糖酶[6]。2003年

Wang 等从软体动物福寿螺（Ampullaria crossean ）

中分离到一个具有外切β-1，4-葡聚糖酶、内切

β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，4-木聚糖酶3种活性，分子质量为41.5kDa 的多功能纤维素酶（EGX ）[7-8]；同年，Suzuki 等在皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai ）中也分离到一种分子质量为66kDa 的纤维素酶，并确定其一级结构[9]。2004年Crawford 等人从小龙虾中分离到两种分子质量分别为47.8kDa 与50.3kDa 的纤维素酶[10]。2005年，Li 等从福寿螺中分离到两种纤维素酶[11]。2007

年，Nishida 等在海胆中分离到分子质量为54kDa 的纤维素酶，属于GHF9家族[12]。不难发现，对动物内源性纤维素酶的研究逐渐由陆上动物转到海

收稿日期：2009-08-01

基金项目：国家自然科学基金（20872049）作者简介：孙乐常，男，1985年出生，研究生通讯作者：曹敏杰

第10卷第3期九孔鲍鱼纤维素酶的分离纯化与性质分析

洋生物。海洋中存在着大量以海藻等为食的生物，其消化腺中的纤维素酶有着与陆生动物不同的特征。

近年，随着我国水产品加工业的不断发展，下脚料的高效利用问题已引起人们的关注。大多数水产品下脚料中含有丰富的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等，如何合理利用这些天然酶资源是值得研究的课题。

本文以我国东南沿海常见的经济水产动物———九孔鲍为研究对象，从中分离纯化活性较高的纤维素酶，并对其性质进行研究。

材料与方法

1.1

材料

九孔鲍鱼（Haliotis diversicolor ），购于厦门市

集美菜市场。其平均体重28g ，即杀后取其内脏，立即使用或存于-80℃待用。

1.2主要仪器与试剂

1.2.1仪器设备高速冷冻离心机，美国Avanti ，Beckman ；瑞士组织捣碎机，PT2100；恒温水浴，德国MEMMERT ；电泳槽及电转移装置，美国Bio-Rad ；AKTA 蛋白纯化系统UPC 900，美国GE Healthcare ；凝胶成像仪，法国VILBER LOUR -MAT ；紫外分光光度计，中国龙尼科UV-2600等。1.2.2试剂SP-Sepharose Fast Flow 阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析、Sephacryl S-200丙烯葡聚

糖凝胶过滤柱层析、Phenyl Sepharose Fast Flow 苯基葡聚糖凝胶疏水层析和Superdex G-200凝胶过滤预装柱层析，美国GE Healthcare 公司；

Hydroxyapatite （CHT-ⅡCartridge ）羟基磷灰石预装柱，Bio-Rad 公司；蛋白标准分子质量，Fermen -tas 公司产品；其它试剂均为国产化学纯或分析

纯。

1.3方法

1.3.1

鲍鱼纤维素酶的提取与纯化1.3.1.1

纤维素粗酶的提取

鲍鱼内脏（14.7g ）用

剪刀剪切成小块，与60mL pH 6.0的10mmol/L磷酸缓冲液[PBS，含0.02%叠氮钠、1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF ）和1mmol/LEDTA]混合，用组织捣碎机捣碎，在4℃下提取30min ，12000g 离心

20min 。4层绢布过滤得上清。

1.3.1.2纤维素酶的纯化

1）SP-Sepharose Fast Flow 阳离子葡聚糖凝

胶交换柱层析纯化：将所得上清液加入已用10

mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）平衡的柱（1.5cm ×

16.5cm ）中。被吸附的蛋白用pH 6.0的10mmol/L PBS （含0～500mmol/LNaCl ）进行线性梯度洗

脱。收集活性峰，用YM-10膜超滤浓缩。

2）丙烯葡聚糖凝胶过滤：将SP-Sepharose 阳

离子葡聚糖凝胶交换柱活性峰处收集的浓缩样品上样于已用pH 7.5的25mmol/LPBS （含0.15

mol/LNaCl ）平衡过的丙烯葡聚糖凝胶柱（1.5cm ×98cm ），收集活性峰。

3）羟基磷灰石层析预装柱纯化：将丙烯葡聚糖凝胶柱活性峰处收集的样品用5mmol/LPBS

（pH 7.5）透析过夜，上样于羟基磷灰石层析预装柱。吸附的蛋白用5～200mmol/LPBS （pH 7.5）线性梯度洗脱，收集活性峰蛋白。

4）Phenyl Sepharose 苯基葡聚糖凝胶疏水层

析纯化上述活性峰样品中若含有杂蛋白带，则在样品中加入（NH 4）2SO 4至终浓度1mol/L，再经

12000g ，20min 离心处理，所得上清液上样于1mol/L（NH 4）2SO 4+50mmol/LPBS （pH 7.0）平衡的

苯基葡聚糖凝胶疏水层析。吸附蛋白用1～0mol/L（NH 4）2SO 4，50mmol/LPBS （pH 7.0）线性梯度洗脱。收集活性峰的蛋白，检测纯度、酶活力。

1.3.2纤维素酶活力检测方法酶活力的测定方

法主要参考Suzuki 等人[10]的方法并作部分改进，具体步骤：在50μL 酶液中加入600μL 1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）+10mmol/LPBS （pH 6.0）中，37℃水浴反应30min ，立即置于100℃沸水浴锅中灭活15min ，终止反应。经10000g ，10min 离心，取上清液200μL ，加入600μL DNS ，混匀，

100℃显色15min ，立即用冰水冷却，加水定容到

5mL ，于波长540nm 处测量其吸光值。

将每分钟分解产生相当于1μmol 葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。

1.3.3蛋白质浓度测定方法蛋白质含量按Lowry 法测定[13]。用紫外分光光度计于波长280nm 处检测柱层析过程中的蛋白质浓度。1.3.4纤维素酶的性质分析

1）SDS-PAGE 电泳分析：参照Laemmli 法[14]，

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期

使用12%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS -PAGE ）、考马斯亮蓝R-250染色法或银染色法分

析纤维素酶蛋白的纯化效果，用标准蛋白质（116.0～14.4kDa ）作对照。

2）最适温度与温度稳定性的测定：在10～70℃范围确定最适温度。不改变其它条件，测定不

同温度下的酶活力。

温度稳定性试验：将酶在不同温度下孵育

12h ，测其剩余的酶活力。

3）最适pH 与pH 稳定性的测定

在pH 4～10范围确定最适pH 。所用缓冲液：20mmol/LNaAc-HCl （pH 4.0）、20mmol/LNaAc-HAc （pH 4.5～5.5）、20mmol/LPBS （pH 5.5～7.5）、20mmol/LTris -HCl （pH 8.0～9.0）、20mmol/LNa 2CO 3-NaHCO 3（pH 10.0）。

pH 稳定性试验：将酶置于各pH 缓冲液中孵

育3h ，测其剩余活力。

4）酶谱分析

①酶谱分析参考文献[9]的方法，并稍加改进。②Native-PAGE 酶谱：配胶时在胶中加入0.1%CMC ，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。样品在4℃下恒流（8mA ）电泳，然后用0.1%

刚果红染色15min ，于1mol/LNaCl 溶液中脱色，最后用0.2mol/L醋酸定影。胶上出现亮带，说明该处的蛋白具有降解CMC-Na 的能力。

③SDS-PAGE 酶谱：取一定量酶液，加入SDS 上样缓冲液，直接上样于12%聚丙烯酰胺凝胶，于4℃下恒流（8mA ）电泳，然后在含25%异丙醇的10mmol/L磷酸钠PBS （pH6.0）缓冲液中去SDS ，4℃下震荡30min ，2次；再于10mmol/L磷酸钠PBS （pH 6.0）缓冲液中4℃下复性30min ，2次，之后覆盖于2%琼脂胶（含0.1%CMC ）上，37℃反应30min ；取出琼脂胶，于0.1%刚果红染色15min ，再于1mol/LNaCl 溶液中脱色，最后用0.2mol/L醋酸定影。

2结果与讨论

2.1纤维素酶的层析柱纯化

2.1.1阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析纯化效果由图1可知，粗酶过阳离子葡聚糖凝胶交换柱时，

经0～0.5mol/LNaCl 线性梯度洗脱得到3个活性

峰。由于第1个活性峰峰值最大，且相对蛋白含量较低，故优先分离第1个峰处的纤维素酶，其它2个峰有待下阶段研究。收集最大活性峰组分105

mL ，经超滤膜（Amicon ，YM-10）浓缩至6mL ，上样于用0.15mol/LNaCl+25mmol/LPBS （pH 7.0）缓

冲液平衡过的丙烯葡聚糖凝胶过滤柱层析。

2.1.2Sephacryl S-200HR 丙烯葡聚糖凝胶过滤

柱层析纯化效果

样品于丙烯葡聚糖凝胶过滤柱

上的洗脱结果见图2。活性峰与蛋白峰比较相近，故尽量减少收集组分，以避免带入杂蛋白。用5

mmol/LPBS （pH 7.5）透析过夜，上样于已用相同

缓冲液平衡的羟基磷灰石层析预装柱。

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2.1.3羟基磷灰石层析纯化效果羟基磷灰石层析过程中，未吸附部分的较多蛋白被洗脱。吸附蛋白用5~200mmol/LPBS 缓冲液（pH 7.5）线性洗脱，结果如图3所示。酶活性峰与蛋白峰基本对应，但电泳后仍有少量的杂蛋白（结果未给出）。故收集活性峰组分（40~47管），加入（NH 4）2SO 4至1

mol/L，上样于已平衡的苯基葡聚糖凝胶疏水层析。

2.1.4

苯基葡聚糖凝胶疏水层析纯化效果

吸附

的蛋白用1~0mol/L（NH 4）2SO 4，50mmol/LPBS 缓冲液（pH 7.0）线性洗脱。洗脱结果如图4所示。经该层析柱后，酶活性峰与主要蛋白峰重合。收集活性峰部分，取部分样品经浓缩上样于用0.5mol/L

NaCl+50mmol/LPBS （pH 7.0）平衡过的Superdex G-200凝胶过滤预装柱层析。

2.1.5Superdex G-200凝胶过滤预装柱层析

如图5所示，样品过凝胶过滤预装柱层析后，在洗脱体积15mL （对应分子质量45kDa ）处得到单一的蛋白峰，而在洗脱体积20.0mL 处出现的微弱蛋白峰，可能是样品轻微降解的产物或其它杂蛋白。

2.2

纯化结果及分子质量的确定

2.2.1SDS-PAGE 与Native-PAGE 聚丙烯酰胺凝

胶电泳检验、纯化酶

纯化的纤维素酶经聚丙烯

酰胺凝胶电泳与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色，结果显示呈现单一条带，表明该酶已得到高度纯化（见图6）。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，推测纤维素酶分子质量约为55kDa ，比经凝胶过

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滤柱推测的结果（45kDa ）稍大，这可能与天然蛋白的二级结构有关。该结果与皱纹盘鲍中提取到的纤维素酶的分子质量（66kDa ）小10kDa 左右[9]，而与日本海胆纤维素酶（54kDa ）的分子质量相近[12]。此外，从小龙虾中分离到的两种纤维素酶的分子质量分别为47.8kDa 与50.3kDa [10]，从福寿螺中分离到的两种纤维素酶的分子质量分别为

β-1，4-葡聚糖酶，但纤维素酶的分子质量大小却

因种的差异而各异。

2.2.2纤维素酶的纯化结果经阳离子葡聚糖凝

胶交换柱层析、丙烯葡聚糖凝胶过滤柱层析、羟基磷灰石柱层析和苯基葡聚糖凝胶疏水层析4个层析柱后，从九孔鲍内脏中纯化到一高纯度纤维素酶。具体的纯化结果见表1。纯化倍数124倍，收率7.4%，酶的比活力为14.84U/mg。

27kDa 与45kDa [11]，从贻贝中提取到的纤维素酶分子质量更小，仅为19.7kDa [5]。可见，虽然同为

表1

鲍鱼纤维素酶的纯化结果

Table 1

纯化步骤

粗酶液

阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析丙烯葡聚糖凝胶过滤柱层析羟基磷灰石柱层析苯基葡聚糖凝胶疏水层析

Purification results of cellulose from abalone （Haliotis diversicolor ）

总蛋白/mg

比活力/U·mg -1

总活力/U

纯化倍数

得率/%

1378.0056.706.451.050.81

0.121.823.1012.8814.84

161.54103.7420.8013.5212.02

[1**********]

10064.712.88.47.4

2.32.3.1

性质分析

最适反应温度及温度稳定性

如图7所

较好的稳定性。该结果与福寿螺纤维素酶EG45的性质非常相近[11]。相比之下，日本北海道产皱纹盘鲍的最适温度却在38℃左右[9]，这可能与这两种鲍鱼的生存环境温度有关

。

示，从九孔鲍中分离到的纤维素酶在pH 6.0的缓冲体系中，其最适温度为50℃，且在40℃以下有

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2.3.2最适pH 如图8所示，九孔鲍纤维素酶在pH （pH 6.3）略有差异[9]。孵育3h 后，该酶在pH 5~7之间保持较高的稳定性，而当pH 高于8或者低

于4时，基本丧失活力。

37℃下的最适反应pH 为5.5，此结果与福寿螺纤

维素酶EG45相近[11]，与皱纹盘鲍纤维素酶的最适

如图8所示，九孔鲍纤维素酶在37℃下的最适反应pH 为5.5，此结果与福寿螺纤维素酶

酰胺凝胶电泳都显示出明显的亮带。值得注意的是，对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，酶在泳动过程中对CMC 也有降解，而从最适温度的结果可知，该纤维素酶在10℃时仍保留约40%的活性，说明该酶在低温下也能较有效的降解CMC 底物，所以在Native-PAGE 非变性电泳中（图9A ）检测到拖尾的条带，二者的结果相一致。纤维素酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用吐温-20去除SDS （复性处理），在酶谱上仍表现出较高的活性带，说明该酶在SDS 中的稳定性较好。

EG45相近[11]，与皱纹盘鲍纤维素酶的最适pH （pH 6.3）略有差异[9]。孵育3h 后，该酶在pH 5~7之间保持较高的稳定性，而当pH 高于8或者低于4

时，基本丧失活力。

2.3.3酶谱分析以CMC 为底物的酶谱分析结

果见图9。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯

3结论

本试验从九孔鲍鱼内脏中分离到一种纤维素

酶，纯化倍数为124，收率7.4%，酶比活力14.84

U/mg。通过SDS -PAGE 推测其分子质量约55kDa 。以1.0%CMC 为底物，测得该酶的最适温度50℃，最适pH 5.5，该酶在40℃以下以及pH 5.0～7.0之间的稳定性较好。

鲍鱼消化腺中含有丰富的纤维素酶。鲍鱼独特的生存环境及摄食来源，使其消化腺的纤维素酶除具有陆生动物纤维素酶的功能外，还具有高效降解藻类植物的细胞壁作用，可用于生物医药

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成为可能。

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领域的原生质体的制备。此外，鲍鱼纤维素酶对表面活性剂SDS 的耐受性，使其应用于洗涤剂生产

参

[1][2][3][4][5]

考文献

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Isolation 、Purification and Characterization Analysis of a Cellulase from Abalone

（Haliotis Diversicolor ）

Sun Lechang

Wu Chaohua

Cai Qiufeng

Zhang Lingjing Su Wenjin

Cao Minjie*

（Collge of Biological Engineering ，Jimei University ，Xiamen 361021，Fujian ）

Abstract A cellulase was isolated and purified from the digestive tract of abalone （Haliotis diversicolor ）by column

chromatographies of SP -Sepharose ，Sephacryl S -200HR ，hydroxyapatite and phenyl sepharose FF prepacked column. The molecular mass of the enzyme was approximately 55kDa as estimated by SDS-PAGE. Optimal temperature and pH were 50℃and 5.5，respectively. The enzyme was stable up to 40℃under the pH range of 5.0～7.0.

Key words

Haliotis diversicolor ；cellulase ；purification ；characterization