2572中国卫生检验杂志2009年11月第19卷第11期 Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Nov 2009; Vol 19 No 11
【微生物检测方法】
LAMP 技术快速检测产肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素
占利, 叶菊莲, 罗芸, 程苏云, 梅玲玲, 杨婷婷
(浙江省疾病预防控制中心微生物检验所, 杭州 310051)
[摘要] 目的:建立环介导恒温扩增快速检测肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素的方法。方法:采用环介导恒温扩增反
应(LAMP ) 技术扩增肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素特异性基因, 优化反应条件, 并与传统PCR 比较。结果:与传统的
PCR 技术相比, LAM P 法更加简便快速, 且在等温条件下进行, 具有更高的灵敏性及特异性。结论:该方法灵敏度高, 特异性强, 操作简便快速, 不需要复杂仪器设备, 为检测产肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ方法。
[关键词] 产肠毒素性大肠埃希菌; 环介导恒温扩增技术(LAM P ) ; ([中图分类号] R44615 [文献标识码] A []--03
Rap i d and sen siti ve detecti on of hea t i n genes of en terotox i gen i c Echerich ia co li by loop -m ed i l ti on
ZHAN L i, YE Ju 2lian, CHEN M EI ing 2ling, YAN G T ing 2ting
(Zhejiang D and on, Hangzhou 310051, China )
[Abstract] O To devel op a technique for detecti on of LT Ⅰgene of enter ot oxigenic Echerichia coli (ETEC ) using a no 2vel DNA amp lificati on p r ocedure designated Loop -mediated is other mal amp lificati on (LAMP ) 1M ethods:The heat -liable Ⅰenter ot oxin genes of ETEC was amp lified by LAMP, and compared with PCR 1Results:Compared with PCR, the LAMP method was perfor med under is other mal conditi ons 1Its s pecificity was 100%and the sensitivity was 10-f old higher than that of conventi onal PCR 1Conclusi on:This LAM P -based assay is si m p le, rap id, sensitive and s pecific 1No s pecialized equi pment is needed which makes it is more econom ical and p ractical 1This assay is expected t o become a valuable t ool f or rap id diagnosis in ETEC infec 2ti on 1
[Key words] Enter ot oxigenic E 1coli ; Loop -mediated is other mal a mp lificati on; LT gene
产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC ) 是发展中国家婴幼儿、儿童腹泻及热带、亚热带旅行者腹泻的重要病原菌, 也是食源性及水源性爆发疾病的主要病原[1~3]。致腹泻的产肠毒素性大肠埃希菌可分泌耐热肠毒素(ST ) 及/或不耐热肠毒素(LT ) , 可单独表达LT 或ST, 或是同时表达两种毒素。检测毒力基因对大肠杆菌腹泻病的诊断有着重要意义, 目前检测毒力基因的方法主要有动物实验、组织培养、免疫学方法(R I A 、E L I S A ) 等, 这些方法费时费力, 具有一定的局限性。PCR 技术以其特异性高、敏感性强的特点, 成为当前常用的毒素检测技术[4~6]。
2000年Not om i 报道了一种新颖的恒温核酸扩增方法(l oop -mediated is other mal amp lificati on, LAM P ) , 与其他扩增方法技术相比, 具有简便快速、高特异性及灵敏度、鉴定简便
[7]
等特点。本研究建立并优化了产肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素的LAMP 检测方法, 现将结果报道如下:
1 材料与方法111 菌株来源
[基金项目] 浙江省钱江人才科技计划(2007R10018)
[作者简介] 占利(1978-) , 女, 主管技师, 主要从事微生物检验
大肠埃希菌C MCC 44814(ETEC, LT +) ; 大肠杆菌AT CC
25922, 香港海鸥菌分离株, 宋内志贺菌C MCC 51334, 副溶血性弧菌AT CC 17802, 肠炎沙门菌C MCC 50041, 阪崎肠杆菌AT CC 51329, 英诺克李斯特菌, 单增李斯特菌C MCC 54002, 出血性大肠杆菌C MCC 43888, 鼠伤寒C MCC 50013, 蜡样芽孢杆菌C M 2CC 63301, 志贺菌C MCC 51570, 伤寒沙门菌C MCC 50097, 金黄色葡萄球菌ATCC 25923, 铜绿假单胞菌ATCC 25873, 变形杆菌C MCC 49072, 鸭沙门菌C MCC 50083, 拟态弧菌AT CC 33653, 以上所有菌种均由本中心菌种室提供。112 主要试剂及仪器
B st DNA 聚合酶大片段(Ne w England B i olabs ) , d NTPs (大连宝生物工程有限公司) , DNA Marker (大连宝生物工程有限公司) , 琼脂糖(西班牙B i owest ) , 甜菜碱(Betaine, Sig ma -A ldrich ) , 所有试剂均在有效期内使用。Master cycler gradient PCR 扩增仪; FR -200A 全自动紫外与可见分析装置(上海复日科技有限公司) ; M inirun GE -100电泳仪(杭州博日科技有限公司) , 热裂解仪(杭州博日科技有限公司, HB -100) 。
工作。
中国卫生检验杂志2009年11月第19卷第11期 Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Nov 2009; Vol 19 No 112573
113 方法
11311 引物合成 参考文献
[7, 8]
, 进行引物设计及选择;
LAMP 引物及普通PCR 引物序列见表1、表2, 引物均由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。
表1 产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC) L T Ⅰ基因LA M P 引物
引物名称
LT Ⅰ-F3LT Ⅰ-B3LT Ⅰ-F I P LT Ⅰ-B I P LT Ⅰ-LF LT Ⅰ-LB
) 序列(5′-3′
GCCATT AT ATGCAAATGGCG CCTGCT AAGTG AGCACTTCT
CTCATT ATGCCCTCTGGGCAACTCT AG ACCCCCAG ATG A ATG ATCACGCG AG AGG AACACAAAGTGG AAACAT ATCCGTCA AAG ACCTCCGG AACGTTTT A ACCGGCTTTGTCAG AT ATG A
1:ETEC 44814; 2:阴性对照; 3:100bp DNA Marker
图1 L T ⅠLAM P 方法的建立
212 LAMP 特异性试验
表2 产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC) L T Ⅰ基因PCR 引物
引物名称
LT Ⅰ-PCR1LT Ⅰ-PCR2
) 序列(5′-3′GCAGGTTTCCCACCGG AT GTGCTCAG CT
特异性实验结果见图2, 仅标准株44814出现
LAMP , , 11312 模板制备 , μl 盐水中, , in 离心5m in, 取上清液作为℃11313 LAMP 反应25μl, 包括MgS O 4、d NTPs 、Be 2taine 、内引物、外引物、环引物、1×Ther moPol buffer 及适量的DNA 模板, 混匀后, 95℃加热5m in 后冰浴冷却, 然后加入8U 的B st DNA 聚合酶大片段, 65℃保温45m in, 随之加热至80℃持续10m in 后完成反应。产物于115%琼脂糖凝胶电泳分析, 同时肉眼观察反应体系浊度变化或高速离心后观察管底是否有沉淀。
11314 PCR 反应 配置体系25μl, 包括d NTPs 、Taq 酶、引物、1×PCR buffer 及模板, 混匀后, 于94℃变性1m in, 55℃退火1m in, 72℃延伸1m in, 共循环35次。产物于115%琼脂糖凝胶电泳分析。
11315 LAMP 特异性检测 用已建立的LAM P 方法分别对19株实验菌进行检测, 肉眼及电泳观察结果, 验证该方法的特异性。
11316 LAMP 及PCR 灵敏度检测 经平板计数, 过夜培养的产肠毒素大肠埃希菌标准株44814新鲜菌悬液浓度为1109×8
10cfu /ml, 充分混匀菌液, 10倍梯度倍比稀释至1109×0
10cfu /ml; 取各稀释度充分混匀菌液1m l, 热裂解法制备DNA 模板, 各取2μl 上清液作为模板进行LAMP 及普通PCR 扩增。
2 结果
211 LAMP 检测方法的建立
1:香港海鸥菌分离株; 2:宋内氏志贺氏菌C MCC 51334;
3:英诺克李斯特; 4:副溶血性弧菌ATCC 17802; 5:肠炎沙门氏菌C MCC 50041; 6:大肠杆菌ATCC 25922; 7:阪崎肠杆菌ATCC 51329; 8:单增李斯特菌C MCC 54002; 9:肠出血性大肠杆菌C MCC 43888; 10:金黄色葡萄球菌ATCC 25923; 11:鼠伤寒沙门氏菌C MCC 50013; 12:腊样芽
孢杆菌C MCC 63301; 13-志贺氏菌C MCC 51570;
14:产毒大肠杆菌标准株C MCC 44814(阳性对照) ;
15:阴性对照; 16:100bp DNA Marker
图2 L T ⅠLAM P 特异性实验
213 LAMP 及普通PCR 灵敏度试验
LAM P 灵敏度结果见图3, 本研究所建立的LAM P 法的检
测灵敏度为1109×10cfu /ml; 普通PCR 灵敏度结果见图4, 该
3
PCR 法的检测灵敏度为1109×10cfu /ml; 可见LAM P 法检测灵敏度高于普通PCR 法10倍。
2
以一套特异性引物对肠产毒性大肠杆菌标准株44814LT Ⅰ毒素进行LAMP 扩增, 扩增产物经短时高速离心后, 肉眼可见阳性对照管出现明显沉淀, 阴性对照未出现沉淀, 电泳检测结果如图1, 阳性对照孔出现阶梯状条带, 阴性对照未出现条带。结果显示该LAMP 法能有效扩增产肠毒素大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素。
1:1106×1054cfu /ml; 2:1106×104cfu /ml; 3:1106×103cfu /ml;
4:1106×102cfu /ml; 5:1106×101cfu /ml; 6:1106×100cfu /ml; 7:阴性对照; 8:100bp DNA Marker
图3 L T ⅠLAM P 灵敏度实验
2574中国卫生检验杂志2009年11月第19卷第11期 Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Nov 2009; Vol 19 No 11
3株菌带有LT Ⅰ毒素, 阳性率为3175%; 使用常规PCR 法进
行复检, 仅检出其中一株LT Ⅰ阳性, 阳性率为1125%, 可见
LAMP 法的灵敏度明显高于PCR 法。该实验方法所需时间仅
为1h 左右, 检测结果可通过目测直接进行判断, 相比较于普通PCR, 不仅缩短了检测时间, 而且无需特殊仪器, 具备更好的普及性。
综上所述, 本研究建立ETEC LT Ⅰ毒素的LAM P 法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低等特点, 为产毒性大肠杆菌的检测提供了新的方法依据, 在感染性疾病诊断及食品
1:阳性对照; 2:1106×107cfu /ml; 3:1106×106cfu /ml;
4:1106×105cfu /ml; 5:1106×104cfu /ml; 6:1106×103cfu /ml; 7:1106×102cfu /ml;
8:1106×101cfu /ml; 9:阴性对照; 10:100bp DNA Marker
卫生检验等领域具有广阔的应用前景。
[参考文献]
[1]A lbertMJ, Faruque S M , Faruque Contr olled study of Esch 2
erichia coli in J ]1J Clin M i 2ol, (4) :-[2]m J, A, et al 1Traveler ′s at sea:three out 2
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tr oenteritis inthe golan heights due t o enter ot oxigenic Escherichia coli [J ]1I nfecti on, 2000, 28:267-2711
[4]Yavz ori M , Porath N , Ochana O, et al 1Detecti on of enter ot oxigenic
Escherichia coli in st ool s peci m ens by poly merase chain reacti on [J ].
图4 L T ⅠPCR 灵敏度实验
3 讨论
ETEC 是引起发展中国家婴幼儿腹泻及发达国家旅行者
腹泻的主要病原菌, 其主要致病因子是不耐热肠毒素(LT 耐热肠毒素(ST ) 。十分重要, 目前检测ST 、LT 培养和免疫学方法等, , 灵敏度不高[1~6, 9], , 从基, 目前常用方法是PCR 法, 但由于该法需要特定的仪器, , Not om i 所报道的LAM P 法不需要特定的仪器, 简便快速, 更适合基层实验室筛选ETEC 的使用要求。
LAMP 技术是在传统的PCR 基础上创建的一种理想的手
D iagn M icr obi ol I nfect D is, 1998, 31(4) :503-5091
[5]Yavz ori M , Porath N, Ochana O, et al 1Detecti on of enter ot oxigenic
Escherichia coli in st ool s peci m ens bypoly merase chain reacti on [J ].D iagn M icr obi ol I nfect D is, 1998, 31:503-5091
[6]Tsen HY, Jian LZ 1Devel opment and use of a multi p lex PCR syste m f or
the rap id screening of heat -labile t oxin I, heat -stable t oxin II and shiga -like t oxin I and II genes of Escherichia coli [J ]1J App lM icr obi 2ol, 1998, 84:585-5921
[7]Not om i T, Okaya ma H, Masubuchi H, et al 1Loop -mediated is other 2
mal a mp lificati on of DNA [J ]1Nucleic Acids Res, 2000, 28(12) :e631
[8]Yano A, Ishi m aru R, Hujikata R 1Rap id and sensitive detecti on of heat
-labile I and heat -stable I enter ot oxin genes of enter ot oxigenic Esch 2
erichia coli by l oop -mediated is other mal a mp lificati on[J ]1J M icr obi ol
段
[7, 8, 10]
, 其特点是:①设备简单, 只需一恒定器, 不需要PCR
仪等昂贵的仪器, 且无需特殊试剂; ②特异性强:该技术是应用六个特异部位设定的四条引物, 因此具备很高的特异性; ③操作简单, 反应迅速, 整个反应过程从加样到结果检出只需要
1h 左右, 且通过引物的优化, 反应时间可进一步缩短; ④灵敏
度高:扩增模板可达10拷贝或更少, 检测线性范围5个数量级; ⑤本法有无扩增反应是通过反应过程中获得的副产物焦磷酸镁所形成的白色沉淀的浑浊度来判定, 因此只要用肉眼观察或浊度仪在400n m 光下, 检测沉淀浊度就能够判断扩增与否, 也可通过琼脂糖电泳进行检测。但LAMP 法也有很多自身局限性, 它对引物的设计要求很高, 且需设计多对引物, 要求扩增的靶序列长度在300bp 以下; 电泳阳性反应呈现梯度条带, 一旦产生非特异性扩增, 不易鉴别灵敏, 因此容易污染, 需要注意操作。
本研究选取LT Ⅰ基因的保守区域设计引物, 建立并优化了ETEC LT Ⅰ毒素的LAMP 检测方法, 经灵敏度检测, LAMP 法的灵敏度较普通PCR 法高10倍。将该法应用于2007年所分离的80株可疑致泻性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素检测, 共检出
[7]
Methods, 2007, 68(2) :414-4201
[9]王金良, 倪语星, 徐英春1细菌性腹泻实验诊断规范[M]1上海:
上海科技出版社, 2002:16-241
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-mediated is other mal amp lificati on (LAMP ) [J ]1Chin J Lab Med, 2005, 28(6) :761-7631
[11]肖斌, 朱永红, 邹全明1简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新
; 由于该法十分
技术[J ]1中华检验医学杂志, 2005, 28(6) :761-7631
(收稿日期:2009-07-29)
2572中国卫生检验杂志2009年11月第19卷第11期 Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Nov 2009; Vol 19 No 11
【微生物检测方法】
LAMP 技术快速检测产肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素
占利, 叶菊莲, 罗芸, 程苏云, 梅玲玲, 杨婷婷
(浙江省疾病预防控制中心微生物检验所, 杭州 310051)
[摘要] 目的:建立环介导恒温扩增快速检测肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素的方法。方法:采用环介导恒温扩增反
应(LAMP ) 技术扩增肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素特异性基因, 优化反应条件, 并与传统PCR 比较。结果:与传统的
PCR 技术相比, LAM P 法更加简便快速, 且在等温条件下进行, 具有更高的灵敏性及特异性。结论:该方法灵敏度高, 特异性强, 操作简便快速, 不需要复杂仪器设备, 为检测产肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ方法。
[关键词] 产肠毒素性大肠埃希菌; 环介导恒温扩增技术(LAM P ) ; ([中图分类号] R44615 [文献标识码] A []--03
Rap i d and sen siti ve detecti on of hea t i n genes of en terotox i gen i c Echerich ia co li by loop -m ed i l ti on
ZHAN L i, YE Ju 2lian, CHEN M EI ing 2ling, YAN G T ing 2ting
(Zhejiang D and on, Hangzhou 310051, China )
[Abstract] O To devel op a technique for detecti on of LT Ⅰgene of enter ot oxigenic Echerichia coli (ETEC ) using a no 2vel DNA amp lificati on p r ocedure designated Loop -mediated is other mal amp lificati on (LAMP ) 1M ethods:The heat -liable Ⅰenter ot oxin genes of ETEC was amp lified by LAMP, and compared with PCR 1Results:Compared with PCR, the LAMP method was perfor med under is other mal conditi ons 1Its s pecificity was 100%and the sensitivity was 10-f old higher than that of conventi onal PCR 1Conclusi on:This LAM P -based assay is si m p le, rap id, sensitive and s pecific 1No s pecialized equi pment is needed which makes it is more econom ical and p ractical 1This assay is expected t o become a valuable t ool f or rap id diagnosis in ETEC infec 2ti on 1
[Key words] Enter ot oxigenic E 1coli ; Loop -mediated is other mal a mp lificati on; LT gene
产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC ) 是发展中国家婴幼儿、儿童腹泻及热带、亚热带旅行者腹泻的重要病原菌, 也是食源性及水源性爆发疾病的主要病原[1~3]。致腹泻的产肠毒素性大肠埃希菌可分泌耐热肠毒素(ST ) 及/或不耐热肠毒素(LT ) , 可单独表达LT 或ST, 或是同时表达两种毒素。检测毒力基因对大肠杆菌腹泻病的诊断有着重要意义, 目前检测毒力基因的方法主要有动物实验、组织培养、免疫学方法(R I A 、E L I S A ) 等, 这些方法费时费力, 具有一定的局限性。PCR 技术以其特异性高、敏感性强的特点, 成为当前常用的毒素检测技术[4~6]。
2000年Not om i 报道了一种新颖的恒温核酸扩增方法(l oop -mediated is other mal amp lificati on, LAM P ) , 与其他扩增方法技术相比, 具有简便快速、高特异性及灵敏度、鉴定简便
[7]
等特点。本研究建立并优化了产肠毒素性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素的LAMP 检测方法, 现将结果报道如下:
1 材料与方法111 菌株来源
[基金项目] 浙江省钱江人才科技计划(2007R10018)
[作者简介] 占利(1978-) , 女, 主管技师, 主要从事微生物检验
大肠埃希菌C MCC 44814(ETEC, LT +) ; 大肠杆菌AT CC
25922, 香港海鸥菌分离株, 宋内志贺菌C MCC 51334, 副溶血性弧菌AT CC 17802, 肠炎沙门菌C MCC 50041, 阪崎肠杆菌AT CC 51329, 英诺克李斯特菌, 单增李斯特菌C MCC 54002, 出血性大肠杆菌C MCC 43888, 鼠伤寒C MCC 50013, 蜡样芽孢杆菌C M 2CC 63301, 志贺菌C MCC 51570, 伤寒沙门菌C MCC 50097, 金黄色葡萄球菌ATCC 25923, 铜绿假单胞菌ATCC 25873, 变形杆菌C MCC 49072, 鸭沙门菌C MCC 50083, 拟态弧菌AT CC 33653, 以上所有菌种均由本中心菌种室提供。112 主要试剂及仪器
B st DNA 聚合酶大片段(Ne w England B i olabs ) , d NTPs (大连宝生物工程有限公司) , DNA Marker (大连宝生物工程有限公司) , 琼脂糖(西班牙B i owest ) , 甜菜碱(Betaine, Sig ma -A ldrich ) , 所有试剂均在有效期内使用。Master cycler gradient PCR 扩增仪; FR -200A 全自动紫外与可见分析装置(上海复日科技有限公司) ; M inirun GE -100电泳仪(杭州博日科技有限公司) , 热裂解仪(杭州博日科技有限公司, HB -100) 。
工作。
中国卫生检验杂志2009年11月第19卷第11期 Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Nov 2009; Vol 19 No 112573
113 方法
11311 引物合成 参考文献
[7, 8]
, 进行引物设计及选择;
LAMP 引物及普通PCR 引物序列见表1、表2, 引物均由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。
表1 产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC) L T Ⅰ基因LA M P 引物
引物名称
LT Ⅰ-F3LT Ⅰ-B3LT Ⅰ-F I P LT Ⅰ-B I P LT Ⅰ-LF LT Ⅰ-LB
) 序列(5′-3′
GCCATT AT ATGCAAATGGCG CCTGCT AAGTG AGCACTTCT
CTCATT ATGCCCTCTGGGCAACTCT AG ACCCCCAG ATG A ATG ATCACGCG AG AGG AACACAAAGTGG AAACAT ATCCGTCA AAG ACCTCCGG AACGTTTT A ACCGGCTTTGTCAG AT ATG A
1:ETEC 44814; 2:阴性对照; 3:100bp DNA Marker
图1 L T ⅠLAM P 方法的建立
212 LAMP 特异性试验
表2 产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC) L T Ⅰ基因PCR 引物
引物名称
LT Ⅰ-PCR1LT Ⅰ-PCR2
) 序列(5′-3′GCAGGTTTCCCACCGG AT GTGCTCAG CT
特异性实验结果见图2, 仅标准株44814出现
LAMP , , 11312 模板制备 , μl 盐水中, , in 离心5m in, 取上清液作为℃11313 LAMP 反应25μl, 包括MgS O 4、d NTPs 、Be 2taine 、内引物、外引物、环引物、1×Ther moPol buffer 及适量的DNA 模板, 混匀后, 95℃加热5m in 后冰浴冷却, 然后加入8U 的B st DNA 聚合酶大片段, 65℃保温45m in, 随之加热至80℃持续10m in 后完成反应。产物于115%琼脂糖凝胶电泳分析, 同时肉眼观察反应体系浊度变化或高速离心后观察管底是否有沉淀。
11314 PCR 反应 配置体系25μl, 包括d NTPs 、Taq 酶、引物、1×PCR buffer 及模板, 混匀后, 于94℃变性1m in, 55℃退火1m in, 72℃延伸1m in, 共循环35次。产物于115%琼脂糖凝胶电泳分析。
11315 LAMP 特异性检测 用已建立的LAM P 方法分别对19株实验菌进行检测, 肉眼及电泳观察结果, 验证该方法的特异性。
11316 LAMP 及PCR 灵敏度检测 经平板计数, 过夜培养的产肠毒素大肠埃希菌标准株44814新鲜菌悬液浓度为1109×8
10cfu /ml, 充分混匀菌液, 10倍梯度倍比稀释至1109×0
10cfu /ml; 取各稀释度充分混匀菌液1m l, 热裂解法制备DNA 模板, 各取2μl 上清液作为模板进行LAMP 及普通PCR 扩增。
2 结果
211 LAMP 检测方法的建立
1:香港海鸥菌分离株; 2:宋内氏志贺氏菌C MCC 51334;
3:英诺克李斯特; 4:副溶血性弧菌ATCC 17802; 5:肠炎沙门氏菌C MCC 50041; 6:大肠杆菌ATCC 25922; 7:阪崎肠杆菌ATCC 51329; 8:单增李斯特菌C MCC 54002; 9:肠出血性大肠杆菌C MCC 43888; 10:金黄色葡萄球菌ATCC 25923; 11:鼠伤寒沙门氏菌C MCC 50013; 12:腊样芽
孢杆菌C MCC 63301; 13-志贺氏菌C MCC 51570;
14:产毒大肠杆菌标准株C MCC 44814(阳性对照) ;
15:阴性对照; 16:100bp DNA Marker
图2 L T ⅠLAM P 特异性实验
213 LAMP 及普通PCR 灵敏度试验
LAM P 灵敏度结果见图3, 本研究所建立的LAM P 法的检
测灵敏度为1109×10cfu /ml; 普通PCR 灵敏度结果见图4, 该
3
PCR 法的检测灵敏度为1109×10cfu /ml; 可见LAM P 法检测灵敏度高于普通PCR 法10倍。
2
以一套特异性引物对肠产毒性大肠杆菌标准株44814LT Ⅰ毒素进行LAMP 扩增, 扩增产物经短时高速离心后, 肉眼可见阳性对照管出现明显沉淀, 阴性对照未出现沉淀, 电泳检测结果如图1, 阳性对照孔出现阶梯状条带, 阴性对照未出现条带。结果显示该LAMP 法能有效扩增产肠毒素大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素。
1:1106×1054cfu /ml; 2:1106×104cfu /ml; 3:1106×103cfu /ml;
4:1106×102cfu /ml; 5:1106×101cfu /ml; 6:1106×100cfu /ml; 7:阴性对照; 8:100bp DNA Marker
图3 L T ⅠLAM P 灵敏度实验
2574中国卫生检验杂志2009年11月第19卷第11期 Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Nov 2009; Vol 19 No 11
3株菌带有LT Ⅰ毒素, 阳性率为3175%; 使用常规PCR 法进
行复检, 仅检出其中一株LT Ⅰ阳性, 阳性率为1125%, 可见
LAMP 法的灵敏度明显高于PCR 法。该实验方法所需时间仅
为1h 左右, 检测结果可通过目测直接进行判断, 相比较于普通PCR, 不仅缩短了检测时间, 而且无需特殊仪器, 具备更好的普及性。
综上所述, 本研究建立ETEC LT Ⅰ毒素的LAM P 法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低等特点, 为产毒性大肠杆菌的检测提供了新的方法依据, 在感染性疾病诊断及食品
1:阳性对照; 2:1106×107cfu /ml; 3:1106×106cfu /ml;
4:1106×105cfu /ml; 5:1106×104cfu /ml; 6:1106×103cfu /ml; 7:1106×102cfu /ml;
8:1106×101cfu /ml; 9:阴性对照; 10:100bp DNA Marker
卫生检验等领域具有广阔的应用前景。
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图4 L T ⅠPCR 灵敏度实验
3 讨论
ETEC 是引起发展中国家婴幼儿腹泻及发达国家旅行者
腹泻的主要病原菌, 其主要致病因子是不耐热肠毒素(LT 耐热肠毒素(ST ) 。十分重要, 目前检测ST 、LT 培养和免疫学方法等, , 灵敏度不高[1~6, 9], , 从基, 目前常用方法是PCR 法, 但由于该法需要特定的仪器, , Not om i 所报道的LAM P 法不需要特定的仪器, 简便快速, 更适合基层实验室筛选ETEC 的使用要求。
LAMP 技术是在传统的PCR 基础上创建的一种理想的手
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段
[7, 8, 10]
, 其特点是:①设备简单, 只需一恒定器, 不需要PCR
仪等昂贵的仪器, 且无需特殊试剂; ②特异性强:该技术是应用六个特异部位设定的四条引物, 因此具备很高的特异性; ③操作简单, 反应迅速, 整个反应过程从加样到结果检出只需要
1h 左右, 且通过引物的优化, 反应时间可进一步缩短; ④灵敏
度高:扩增模板可达10拷贝或更少, 检测线性范围5个数量级; ⑤本法有无扩增反应是通过反应过程中获得的副产物焦磷酸镁所形成的白色沉淀的浑浊度来判定, 因此只要用肉眼观察或浊度仪在400n m 光下, 检测沉淀浊度就能够判断扩增与否, 也可通过琼脂糖电泳进行检测。但LAMP 法也有很多自身局限性, 它对引物的设计要求很高, 且需设计多对引物, 要求扩增的靶序列长度在300bp 以下; 电泳阳性反应呈现梯度条带, 一旦产生非特异性扩增, 不易鉴别灵敏, 因此容易污染, 需要注意操作。
本研究选取LT Ⅰ基因的保守区域设计引物, 建立并优化了ETEC LT Ⅰ毒素的LAMP 检测方法, 经灵敏度检测, LAMP 法的灵敏度较普通PCR 法高10倍。将该法应用于2007年所分离的80株可疑致泻性大肠埃希菌的LT Ⅰ毒素检测, 共检出
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(收稿日期:2009-07-29)