常见细菌感染PCR 鉴定流程
一、细菌核酸的提取
1. 取1 ml培养肉汤13000 g离心10 min弃去上清。 2. 用1 ml蒸馏水洗涤细胞沉淀后再次13000 g离心10 min弃去上清。
3. 取200 ul InstaGene Matrix（Bio-Rad ）重悬细胞颗粒。 （注）：采用平板培养时挑取单个菌落直接用200 ul InstaGene Matrix（Bio-Rad ）混匀后从
第4步开始。
4.56℃温育30 min后剧烈振荡10 s。 5.95℃温育1 min后剧烈振荡10 s。 6.13000 g离心10 min，上清即可用于PCR 。 二、PCR 反应液的配置
Takara Taq 酶（目录号：DR001A ），包装内含有10×PCR buffer （已添加镁离子）、dNTP Mixture及6×Loading Buffer。
核酸模板 Taq 酶 10×Buffer dNTP Mixture 上游引物（20 uM） 下游引物（20 uM） 灭菌去离子水 共计
1×反应体系
5 ul 0.5 ul 5 ul 4 ul 1 ul 1 ul 33.5 ul 50 ul
三、扩增引物和反应条件
四、电泳检测PCR 结果 50×TAE 缓冲液：
242 g Tris、57.1 ml冰乙酸、100 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），加去离子水至1 L。
1. 根据电泳槽大小取50×TAE 缓冲液稀释50倍配制1×TAE 缓冲液使用。
2. 根据制胶模具大小称取合适量的低熔点琼脂糖凝胶制备1%浓度的琼脂糖凝胶（即100 ml 1×TAE 缓冲液中加入1 g低熔点琼脂糖）。
3. 微波加热2～3min 至琼脂糖完全熔化。
4. 稍事冷却后加入溴化乙锭至终浓度0.5 ug/ml，混匀后倒入制胶模具中，插上制胶梳至冷却凝固。
5. 拔出制胶梳，在电泳槽内倒入合适量的1×TAE 缓冲液。 6. 取6×Loading buffer 与PCR 产物按1：5的比例（即2 ul 的6×Loading buffer与10 ul的PCR 产物比例）混匀，加入指定的琼脂糖凝胶加样孔中，并在其附近加样孔中加入5 ul 的Marker （双链核酸大小指示物，在本操作流程中用Takara DL1000即可）。
7. 关上电泳槽，接好电极，根据电泳槽阳极与阴极之间的距离设定电压（1～5V/cm），核酸应向阳极（红色插头方向）泳动。
8. 待溴酚蓝指示剂迁移至适当距离时停止电泳，关闭电源，将琼脂糖凝胶放置凝胶成像仪内紫外灯下观察产物的片段大小和扩增情况。
常见细菌感染PCR 鉴定流程
一、细菌核酸的提取
1. 取1 ml培养肉汤13000 g离心10 min弃去上清。 2. 用1 ml蒸馏水洗涤细胞沉淀后再次13000 g离心10 min弃去上清。
3. 取200 ul InstaGene Matrix（Bio-Rad ）重悬细胞颗粒。 （注）：采用平板培养时挑取单个菌落直接用200 ul InstaGene Matrix（Bio-Rad ）混匀后从
第4步开始。
4.56℃温育30 min后剧烈振荡10 s。 5.95℃温育1 min后剧烈振荡10 s。 6.13000 g离心10 min，上清即可用于PCR 。 二、PCR 反应液的配置
Takara Taq 酶（目录号：DR001A ），包装内含有10×PCR buffer （已添加镁离子）、dNTP Mixture及6×Loading Buffer。
核酸模板 Taq 酶 10×Buffer dNTP Mixture 上游引物（20 uM） 下游引物（20 uM） 灭菌去离子水 共计
1×反应体系
5 ul 0.5 ul 5 ul 4 ul 1 ul 1 ul 33.5 ul 50 ul
三、扩增引物和反应条件
四、电泳检测PCR 结果 50×TAE 缓冲液：
242 g Tris、57.1 ml冰乙酸、100 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），加去离子水至1 L。
1. 根据电泳槽大小取50×TAE 缓冲液稀释50倍配制1×TAE 缓冲液使用。
2. 根据制胶模具大小称取合适量的低熔点琼脂糖凝胶制备1%浓度的琼脂糖凝胶（即100 ml 1×TAE 缓冲液中加入1 g低熔点琼脂糖）。
3. 微波加热2～3min 至琼脂糖完全熔化。
4. 稍事冷却后加入溴化乙锭至终浓度0.5 ug/ml，混匀后倒入制胶模具中，插上制胶梳至冷却凝固。
5. 拔出制胶梳，在电泳槽内倒入合适量的1×TAE 缓冲液。 6. 取6×Loading buffer 与PCR 产物按1：5的比例（即2 ul 的6×Loading buffer与10 ul的PCR 产物比例）混匀，加入指定的琼脂糖凝胶加样孔中，并在其附近加样孔中加入5 ul 的Marker （双链核酸大小指示物，在本操作流程中用Takara DL1000即可）。
7. 关上电泳槽，接好电极，根据电泳槽阳极与阴极之间的距离设定电压（1～5V/cm），核酸应向阳极（红色插头方向）泳动。
8. 待溴酚蓝指示剂迁移至适当距离时停止电泳，关闭电源，将琼脂糖凝胶放置凝胶成像仪内紫外灯下观察产物的片段大小和扩增情况。