实验四 人类染色体的识别与核型分析
一、 实验目的
1. 学习染色体核型的分析方法； 2. 了解人类染色体的特征。
二、实验原理
1．染色体组型(核型)是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征的总称。包括：染色体的总数，染色体组的数目，组内染色体基数，每条染色体的形态、长度、着丝粒的位置，随体或次缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。组型分析能进行染色体分组外，还能对染色体的各种特征做出定量和定性的描述，是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别染色体结构变异、染色体数目变异，同时也是研究物种的起源、遗传与进化，细胞遗传学，现代分类学的重要手段。
2．人类的单倍体染色体组(n=23)上约有30000-40000个结构基因。平均每条染色体上有上千个基因。各染色体上的基因都有严格的排列顺序，各基因间的毗邻关系也是较为恒定的。人类的 24种染色体形成了24个基因连锁群，所以，染色体上发生任何数目异常、甚至是微小的结构变异，都必将导致许多获某些基因的增加或减少，从而产生临床效应。染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征，称为染色体综合征，其症状表现为多发畸形、智力低下和生长发育异常，此外还可看到一些特征性皮肤纹理改变。染色体畸变还将导致胎儿死产或流产。染色体病已成为临床上较常见的危害较为严重的病种之一，染色体病的检查、诊断已经成为临床实验室检查的重要内容。
1960年，在美国Denver市召开了第一届国际遗传学会议，讨论并确定正常人核型(karyotype)的基本特点即Denver体制，并成为识别人类各种染色体病的基础。按照Denver体制，将待测细胞的染色体进行分析和确定是否正常，以及异常特点即为核型分析。人类染色体分组及形态特征见表1。 表1 人类染色体分组及形态特征（非显带标本）
A组：1-3号，可以区分。1号，最大，M，长臂近侧有一次缢痕；2号，较大，SM；3号，较大，比1号染色体段1/3-1/4）。
B组：4-5号，体积较大，SM，短臂相对较短，两者不容易区分。
C组：6-12，X。中等大小，SM，较难区分。6、7、8、11和X染色体的着丝粒略近中央，短臂相对较长，9、10、12染色体的着丝粒偏离中央。9号染色体长臂有较大次缢痕。
X染色体介于7-8之间，但在非显带标本中难以区分。
D组：13-14号，中等大小，ST，均具有随体，但不一定显现或同时显现，随体的大小存在个体的差异。在非显带标本中难以区分13-15号染色体。
E组：16-18。染色体小。16，M，长臂近着丝粒处有一次缢痕，其存在使16号染色体的大小存在较大差异；17，SM，短臂较长；18，SM，是SM中最短的一对染色体，短臂较短。在质量较好的标本中，一般可以区分16-18染色体。 F组：19-20，次小的M。在非显带标本中难以区分。
G组：21-22，Y，最小的ST。21、22染色体的长度略有差别，但为适应临床上已将Down综合征沿用为21三体（而显带证明与此综合征相关的是较小的那条染色体）综合征的叫法，巴黎会议（1971）建议，把这最小的一对改称为第21号（而稍大的一对称为22号），而把这较小的这对第21号染色体排在稍大的22号前面。
Y染色体的特征，无随体，染色体一般比21、22长；两条姊妹染色单体长臂常平行并拢，而21、22则相互叉开；长臂端部常呈现绒毛状，形态不清晰；与其他染色体相比，着色往往较深；着丝粒不明显。
根据Denver体制规定，正常核型的描述方式为：46，XX；46，XY。
3．人们用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。
本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带）。G带是目前被广泛应用的一种带型。染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。
三、材料与试剂
人类染色体非显带、显带标本。直尺，剪刀等。
四、实验步骤
1．分析的主要依据
着丝粒指数(%)——短臂占整条染色体的百分比：
pp+q
⨯100%
臂比——长臂与短臂的比值(q/p)。反映着丝粒位置的指标。SAT(随体)
1.0-1.7(M); 1.7-3.0(SM); 3.0-7.0(St); 7.0-(Ot);
相对长度（%）——某条染色体的相对长度为该染色体长度占染色体总长度的百分比。
人类某条染色体的相对长度(%) =该条染色体长度/∑22条染色体长度+X染色体长 2．分析的主要步骤
① 测量、计算，。 ② 配对
③ 剪贴 ④ 排列——原则：从大到小；短臂向上；着丝粒在一条线上；性染色体单排 ⑤ 画出模式图——(相对比例)原则同上。 3．图像分析方法
20世纪60年代起，人们开始将图像处理技术应用于核型分析中来。目前已实现计算机
自动检测染色体分散良好的中期细胞，并自动完成核型分析。但这样的软件往往价格高昂，一般的单位是不具有的。Abode Photoshop 是一款流行的功能强大的图像处理软件 ，它比专门的核型分析软件容易获得。用这款软件，可以很容易的完成染色体的排列、测量等工作。程序远较传统方法简单。同时，他还具备传统方法所不具备的诸多功能，诸如去除原照片中的斑点、划痕，调整亮度、对比，对交叉重叠的染色体臂进行修整等，使分析结果比较完美。基本方法如下：
（1） 图片获得
将图片输入电脑中。有两种获得图片的方法：一是选择染色体分散良好的有丝分裂中期的细胞，用数码相机进行拍摄（100万像素即可），然后输入电脑；一是按传统方法拍摄，再用300dpi或更高的分辨率将照片扫描进计算机。
（2） 图片处理
用剪裁工具（Crop tool）将不需要的部分裁去，调整图像的位置，视情况调整亮度、对比度；去除斑点、划痕等，然后储存图像，名之为“原始图”。在进一步分析前，用橡皮工具（Eraser tool）等将照片中除染色体以外的其他区域擦除干净。然后将图像另存为“核型图”，利用这张背景干净的“核型图”进行核型分析。
（3） 图片分析
根据目测，对染色体进行大致归拢。首先将一组染色体中非常明显（如最长、最短，具有随体等）、较易分辨的同源染色体进行配对，归类。其余的染色体可以根据自己的判断，暂且将它们配对。按从长到短的顺序或其他规则，将这些配对的染色体排列起来。然后，测量各条染色体的总长及各臂长度。根据测量结果，再对第一步中“误配”的染色体进行调整。 将染色体大致归类的过程仅需要反复使用套索（Lasso）与自由变形（Free transform）两个工具即可。用套索工具从图中圈选同源染色体，从Edit菜单中选择Free transform，此时被圈选的染色体外出现一个矩形的框，用鼠标按住矩形框的一个角可自由地旋转被圈选中的染色体，使短臂朝上，长臂朝下。而将鼠标伸入矩形框中并按住，则可将选中的染色体拖向任何位置。移动到目的地后，按回车键又可回到套索工具中来。自由变形的快捷键是Ctrl+T，使用此快捷键可省力不少。重复上述过程，将所有同源染色体配成对。在配对过程中，可借助放大工具（zoom tool），看清染色体的细节。 染色体间如存在交叉重叠，我们可以同时处理几个染色体重叠较少的细胞，先用套索工具小心地将叠在上面的染色体圈选、移走，再从另一张照片找到相应的细节，用橡皮图章工具（clone stamp tool）仔细地“克隆”到因“分离”而造成的“断臂”处。注意，克隆前要将两个染色体的尺寸调整成一样大。这样“修补”后的染色体比“嵌合体”式的染色体特征更典型。
视需要在画布中拉一条或几条参考线，选用套索与自由变形两种工具，按核型分析中染色体排列的规则，圈选并拖动配好对的染色体排列，将着丝点排在参考线上。
测量每条染色体的总长与臂长，调整“误配”的染色体。在菜单中选Edit→preference→Guide、Grid&Slice，将其中的Grid line every设为1cm，Subdivision则可视精度需要设为10或其他值，在菜单中选View→Ruler、View→Show→Grid显示标尺与网格，将图像放大到300%左右，根据网格线标示准确测量每条染色体的长度及相应的臂长，并做记录。由此读出的尺寸即是被扫描的原始照片中的染色体的尺寸，虽然显示在屏幕上的染色体要比原始照片中的大。如果一条染色体臂是弯曲的，可按前文叙述的方法圈选并旋转染色体，分段测量。这种测量方法既简便又准确。
算出每条染色体的总长、臂长、臂比等参数。这些参数最为接近的两条染色体为同源染色体。根据这些结果，对目测有误的配对结果进行调整。
调整“核型图”画布的大小，将“原始图”移进“核型图”中来，按需要调整大小和位置。用文字工具（type tool）在图的下方对核型图做些说明。合并所有的图层。另存成“核型分析”。最后，用光泽照片纸或高分辨率纸将结果打印出来或插入到其他文档中即可。
五、结果分析
1.根据所给定的染色体图片（非显带和显带标本）进行测量，结果填写表2
六、参考文献
1．刘祖洞，江绍慧编，遗传学实验(第二版)， 高等教育出版社，北京， 2004.
2．李凤霞，遗传学实验指导及图谱，吉林人民出版社，长春，2006.
3．王金发，戚康标，何炎明，遗传学实验教程，高等教育出版社，北京， 2008. 4．杨大翔，遗传学实验，科学出版社，北京，2004.
图2 人类G-显带染色体
附 人类染色体非显带标本。
图1 人类非显带染色体（上为男性，下为女性）
实验四 人类染色体的识别与核型分析
一、 实验目的
1. 学习染色体核型的分析方法； 2. 了解人类染色体的特征。
二、实验原理
1．染色体组型(核型)是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征的总称。包括：染色体的总数，染色体组的数目，组内染色体基数，每条染色体的形态、长度、着丝粒的位置，随体或次缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。组型分析能进行染色体分组外，还能对染色体的各种特征做出定量和定性的描述，是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别染色体结构变异、染色体数目变异，同时也是研究物种的起源、遗传与进化，细胞遗传学，现代分类学的重要手段。
2．人类的单倍体染色体组(n=23)上约有30000-40000个结构基因。平均每条染色体上有上千个基因。各染色体上的基因都有严格的排列顺序，各基因间的毗邻关系也是较为恒定的。人类的 24种染色体形成了24个基因连锁群，所以，染色体上发生任何数目异常、甚至是微小的结构变异，都必将导致许多获某些基因的增加或减少，从而产生临床效应。染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征，称为染色体综合征，其症状表现为多发畸形、智力低下和生长发育异常，此外还可看到一些特征性皮肤纹理改变。染色体畸变还将导致胎儿死产或流产。染色体病已成为临床上较常见的危害较为严重的病种之一，染色体病的检查、诊断已经成为临床实验室检查的重要内容。
1960年，在美国Denver市召开了第一届国际遗传学会议，讨论并确定正常人核型(karyotype)的基本特点即Denver体制，并成为识别人类各种染色体病的基础。按照Denver体制，将待测细胞的染色体进行分析和确定是否正常，以及异常特点即为核型分析。人类染色体分组及形态特征见表1。 表1 人类染色体分组及形态特征（非显带标本）
A组：1-3号，可以区分。1号，最大，M，长臂近侧有一次缢痕；2号，较大，SM；3号，较大，比1号染色体段1/3-1/4）。
B组：4-5号，体积较大，SM，短臂相对较短，两者不容易区分。
C组：6-12，X。中等大小，SM，较难区分。6、7、8、11和X染色体的着丝粒略近中央，短臂相对较长，9、10、12染色体的着丝粒偏离中央。9号染色体长臂有较大次缢痕。
X染色体介于7-8之间，但在非显带标本中难以区分。
D组：13-14号，中等大小，ST，均具有随体，但不一定显现或同时显现，随体的大小存在个体的差异。在非显带标本中难以区分13-15号染色体。
E组：16-18。染色体小。16，M，长臂近着丝粒处有一次缢痕，其存在使16号染色体的大小存在较大差异；17，SM，短臂较长；18，SM，是SM中最短的一对染色体，短臂较短。在质量较好的标本中，一般可以区分16-18染色体。 F组：19-20，次小的M。在非显带标本中难以区分。
G组：21-22，Y，最小的ST。21、22染色体的长度略有差别，但为适应临床上已将Down综合征沿用为21三体（而显带证明与此综合征相关的是较小的那条染色体）综合征的叫法，巴黎会议（1971）建议，把这最小的一对改称为第21号（而稍大的一对称为22号），而把这较小的这对第21号染色体排在稍大的22号前面。
Y染色体的特征，无随体，染色体一般比21、22长；两条姊妹染色单体长臂常平行并拢，而21、22则相互叉开；长臂端部常呈现绒毛状，形态不清晰；与其他染色体相比，着色往往较深；着丝粒不明显。
根据Denver体制规定，正常核型的描述方式为：46，XX；46，XY。
3．人们用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。
本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带）。G带是目前被广泛应用的一种带型。染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。
三、材料与试剂
人类染色体非显带、显带标本。直尺，剪刀等。
四、实验步骤
1．分析的主要依据
着丝粒指数(%)——短臂占整条染色体的百分比：
pp+q
⨯100%
臂比——长臂与短臂的比值(q/p)。反映着丝粒位置的指标。SAT(随体)
1.0-1.7(M); 1.7-3.0(SM); 3.0-7.0(St); 7.0-(Ot);
相对长度（%）——某条染色体的相对长度为该染色体长度占染色体总长度的百分比。
人类某条染色体的相对长度(%) =该条染色体长度/∑22条染色体长度+X染色体长 2．分析的主要步骤
① 测量、计算，。 ② 配对
③ 剪贴 ④ 排列——原则：从大到小；短臂向上；着丝粒在一条线上；性染色体单排 ⑤ 画出模式图——(相对比例)原则同上。 3．图像分析方法
20世纪60年代起，人们开始将图像处理技术应用于核型分析中来。目前已实现计算机
自动检测染色体分散良好的中期细胞，并自动完成核型分析。但这样的软件往往价格高昂，一般的单位是不具有的。Abode Photoshop 是一款流行的功能强大的图像处理软件 ，它比专门的核型分析软件容易获得。用这款软件，可以很容易的完成染色体的排列、测量等工作。程序远较传统方法简单。同时，他还具备传统方法所不具备的诸多功能，诸如去除原照片中的斑点、划痕，调整亮度、对比，对交叉重叠的染色体臂进行修整等，使分析结果比较完美。基本方法如下：
（1） 图片获得
将图片输入电脑中。有两种获得图片的方法：一是选择染色体分散良好的有丝分裂中期的细胞，用数码相机进行拍摄（100万像素即可），然后输入电脑；一是按传统方法拍摄，再用300dpi或更高的分辨率将照片扫描进计算机。
（2） 图片处理
用剪裁工具（Crop tool）将不需要的部分裁去，调整图像的位置，视情况调整亮度、对比度；去除斑点、划痕等，然后储存图像，名之为“原始图”。在进一步分析前，用橡皮工具（Eraser tool）等将照片中除染色体以外的其他区域擦除干净。然后将图像另存为“核型图”，利用这张背景干净的“核型图”进行核型分析。
（3） 图片分析
根据目测，对染色体进行大致归拢。首先将一组染色体中非常明显（如最长、最短，具有随体等）、较易分辨的同源染色体进行配对，归类。其余的染色体可以根据自己的判断，暂且将它们配对。按从长到短的顺序或其他规则，将这些配对的染色体排列起来。然后，测量各条染色体的总长及各臂长度。根据测量结果，再对第一步中“误配”的染色体进行调整。 将染色体大致归类的过程仅需要反复使用套索（Lasso）与自由变形（Free transform）两个工具即可。用套索工具从图中圈选同源染色体，从Edit菜单中选择Free transform，此时被圈选的染色体外出现一个矩形的框，用鼠标按住矩形框的一个角可自由地旋转被圈选中的染色体，使短臂朝上，长臂朝下。而将鼠标伸入矩形框中并按住，则可将选中的染色体拖向任何位置。移动到目的地后，按回车键又可回到套索工具中来。自由变形的快捷键是Ctrl+T，使用此快捷键可省力不少。重复上述过程，将所有同源染色体配成对。在配对过程中，可借助放大工具（zoom tool），看清染色体的细节。 染色体间如存在交叉重叠，我们可以同时处理几个染色体重叠较少的细胞，先用套索工具小心地将叠在上面的染色体圈选、移走，再从另一张照片找到相应的细节，用橡皮图章工具（clone stamp tool）仔细地“克隆”到因“分离”而造成的“断臂”处。注意，克隆前要将两个染色体的尺寸调整成一样大。这样“修补”后的染色体比“嵌合体”式的染色体特征更典型。
视需要在画布中拉一条或几条参考线，选用套索与自由变形两种工具，按核型分析中染色体排列的规则，圈选并拖动配好对的染色体排列，将着丝点排在参考线上。
测量每条染色体的总长与臂长，调整“误配”的染色体。在菜单中选Edit→preference→Guide、Grid&Slice，将其中的Grid line every设为1cm，Subdivision则可视精度需要设为10或其他值，在菜单中选View→Ruler、View→Show→Grid显示标尺与网格，将图像放大到300%左右，根据网格线标示准确测量每条染色体的长度及相应的臂长，并做记录。由此读出的尺寸即是被扫描的原始照片中的染色体的尺寸，虽然显示在屏幕上的染色体要比原始照片中的大。如果一条染色体臂是弯曲的，可按前文叙述的方法圈选并旋转染色体，分段测量。这种测量方法既简便又准确。
算出每条染色体的总长、臂长、臂比等参数。这些参数最为接近的两条染色体为同源染色体。根据这些结果，对目测有误的配对结果进行调整。
调整“核型图”画布的大小，将“原始图”移进“核型图”中来，按需要调整大小和位置。用文字工具（type tool）在图的下方对核型图做些说明。合并所有的图层。另存成“核型分析”。最后，用光泽照片纸或高分辨率纸将结果打印出来或插入到其他文档中即可。
五、结果分析
1.根据所给定的染色体图片（非显带和显带标本）进行测量，结果填写表2
六、参考文献
1．刘祖洞，江绍慧编，遗传学实验(第二版)， 高等教育出版社，北京， 2004.
2．李凤霞，遗传学实验指导及图谱，吉林人民出版社，长春，2006.
3．王金发，戚康标，何炎明，遗传学实验教程，高等教育出版社，北京， 2008. 4．杨大翔，遗传学实验，科学出版社，北京，2004.
图2 人类G-显带染色体
附 人类染色体非显带标本。
图1 人类非显带染色体（上为男性，下为女性）