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锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌Livin表达的影响

医学论文发表——创新医学网http://www.yixue360.com/

作者：张婷张端莲作者单位：(武汉大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系武汉 430071)

【摘要】目的：探讨锌(Zn)和维生素E(VE)对糖尿病大鼠心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),实验组动物采用腹腔注射链脲左菌素(streptozotocin， STZ)，60mg/kg一次注射，制备糖尿病大鼠模型。将40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学染色,观察各组心肌组织Livin的表达水平, 利用HPIAS2000图像分析系统测定Livin在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内Livin呈阳性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内Livin呈阴性表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内Livin呈强阳性表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内Livin呈弱阳性表达。图像分析结果显示：糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Livin的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0 05)。结论： Zn和VE联合使用可对糖尿病大鼠心肌细胞具有重要的保护作用。

【关键词】锌; 维生素E; 糖尿病; 心肌; Livin

糖尿病( diabetes mellitus ,DM) 是一类由于胰岛素绝对或相对缺乏或胰岛素生物活性降低,或者以上二者共同引起体内代谢失调及高血糖状态。临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和Ⅱ型糖尿病[1]。Ⅰ型糖尿病,或称胰岛素依赖性糖尿病( IDD) 属于自身免疫性疾病。机体对自身胰腺β细胞进行持续攻击,造成β细胞大量破坏,胰岛素分泌严重匮乏。Ⅱ型糖尿病的发病是由于机体对胰岛素产生抵抗,同时合并胰岛素分泌的相对不足[2]。近几年来,糖尿病的发病率持续增长。截止到1997年,全世界糖尿病患者为12亿4千万,其中97 %属于Ⅱ型糖尿病[3] 。随着生活方式的改变,经济的发展,以及人口结构变化,到2010 年,全球糠尿病患者将达到22 亿1 千万。在中国,糖尿病的患病人口为2 000～4 000 万,并在以年发病率75 万人的速度递增。如何有效控制糖尿病及其并发症是当前世界医学领域关切的课题。

糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。目前有关糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、Ca2+ 超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关[4]。

细胞凋亡是由多种因子介导的细胞主动死亡的过程,对机体或组织维持内环境的稳定和生物体的生长发育、生命周期、衰老死亡都有着重要的作用。在凋亡的调节因素中,凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是新发现的一类在结构上具有同源性的细胞凋亡抑制蛋白,它不仅抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的活性使细胞凋亡受阻,同时还调节着细胞分裂、细胞周期及信号传导等多个重要环节,其成员livin是新发现的凋亡抑制基因, 它可以作为一种酶抑制剂通过BIR结构域与激活的Caspases蛋白，如Caspase3、Caspase7等结合，导致Caspases蛋白的失活和降解。Caspases蛋白是介导凋亡的主要因素之一，大多数刺激物通过激活Caspases蛋白的级联反应而引起凋亡[5～7]。

Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其含量的增加势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。锌和维生素E是抗氧化剂并具有细胞保护作用。

本研究应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞的保护作用，旨在探讨两者对糖尿病大鼠心肌结构的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180～200g ,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH 4.4 的枸橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾静脉血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献〔5〕,合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补

Zn 组给予Zn 浓度为20 mg/L的含ZnSO4·7H2O 去离子水;补VE 组每天以50 mg/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4 ·7H2O 去离子水的同时以50mg/ kgVE灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室壁肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

1.2.2 主要试剂

即用型兔抗鼠Livin单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

1.2.3 免疫组织化学SP法检测Livin相关抗原

主要步骤：

① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;

② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;

③ 切片采用微波抗原修复(3档，10 min)，PBS洗4×5min;

④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;

⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min;

⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;

⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;

⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;

⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 免疫组织化学结果判断

以胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。

采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千

屏影像公司)对Livin的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

1.2.5 统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

2 结果

Livin的表达正常对照组心肌细胞胞核和胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Livin表达呈阳性, 糖尿病对照组心肌细胞核和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒, Livin表达呈阴性;糖尿病补锌组心肌细胞核和胞浆内可见一些棕黄色颗粒, Livin表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核和胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒, Livin表达呈阳性。图像分析结果显示见表。糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P

尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)，见表1。表1 糖尿病补Zn+VE组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组Livin表达的平均光密度和阳性面积率注： * 正常对照组与糖尿病对照组比较，P

3 讨论

近年来越来越多的证据证明,绝大多数的2 型糖尿病病人,无论胖瘦,都客观地存在着β细胞总数的减少。β细胞总数至少受以下4个因素来调节: ①β细胞的复制; ②β细胞的体积; ③新的β细胞生成(比如来自于胰腺导管上皮的新生β细胞) ; ④β细胞的凋亡。每个因素对于维持β细胞总数的作用,都随着生长发育的不同阶段以及不同的代谢负荷而改变,甚至在不同的种族都有所不同(这种差异在不同种的小鼠之间都有所表现)。高浓度Glucose 使促凋亡和抗凋亡基因表达失衡,继而改变线粒体的稳态、活化caspase 系统,启动不可逆转的凋亡过程[8～10]。

临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和2 型糖尿病,为一类常见病、多发病,发病率有愈来愈高的趋势。世界各国糖尿病患病率均上升,其中90%为2型糖尿病。WHO1997年报告,全世界糖尿病患者1.35亿。近20年来,中国糖尿病患病率从1980年的0.67 %上升至1997年

的3.2 % ,上升近5 倍[11]。在非传染性疾病中,糖尿病死亡率仅次于肿瘤和心血管病而居第三位。胰岛素治疗使糖尿病急性并发症死亡率下降,但慢性并发症死亡率却因此而上升。其根本原因在于对2型糖尿病的病因及发病机制的认识尚不清楚。关于糖尿病的发病原因,1型糖尿病已研究得较为深入,可能与HLA系统、基因突变等有关。关于2 型糖目前的认识是由遗传因素与环境因素共同作用,经由胰岛素抵抗、β细胞功能减退、临床糖尿病等不同发展阶段。糖尿病的发病较为复杂,了解还远远不够。糖尿病患者在无明显微血管病变时也可出现心力衰竭,表明糖尿病患者心肌细胞本身可以发生结构和功能改变,提示有心肌病的可能[12]。

凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一类重要的抗细胞凋亡因子,该家族结构的共同特点是N端含有一个或多个(目前发现最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat, BIR),C端含或不含有一个环指(ring finger)结构.目前人类IAP家族已发现有8个成员,即NAIP,XIAP(ILP1/MIHA),cIAP1(HIAP2/MIHB), cIAP2 ( HIAP1/MIHC ), survivin ( TIAP ), apollon(Bruce),ILP2(TsIAP)和livin (MLIAP/KIAP) 。Livin抗细胞凋亡作用：①抗死亡受体介导的细胞凋亡作用: Vucic等[13]将livin基因转染乳腺癌MCF7细胞,证实转染细胞对Fas,TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1),DR4 (death receptor 4)及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。 Kasof等[14]将livin基因转染HeLa细胞,

结果显示转染细胞可有效阻断由FADD(Fasassociated protein with death domain),Bax,RIP,RIP3及DR6诱导的细胞凋亡,livin抗细胞凋亡的作用甚至略强于Survivin.在Jurkat人T淋巴细胞株中,livin可明显抑制由TNFα及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡,其抗细胞凋亡作用强于Bcl2[14] 。进一步研究表明livin抗细胞凋亡的作用依赖于BIR结构的完整[16] 。②抗线粒体介导的细胞凋亡作用:星状孢子素(Staurosporine, STS)是一种蛋白激酶C(PKC)抑制剂,可诱导线粒体释放细胞色素C,后者可进一步激活细胞凋亡的下游通路。 Livinα对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用,但作用弱于Bcl2;而livinβ则无此作用,显示了livinα和livinβ的抗细胞凋亡作用存在一定差异[17]。③抗化疗药物介导的细胞凋亡作用:许多化疗药物可导致细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡。转染livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素,4TBP (4tertiarybutylphenol)诱导的细胞凋亡[18]。 Livinβ可显著抑制依托泊苷(etoposide)诱导Jurkat细胞凋亡。

Livin抗细胞凋亡调节机制：①抑制Caspase途径:Livin可与介导细胞凋亡的下游效应Caspase,即激活形式的Caspase3和Caspase7结合,并抑制其活性。Livin还可与未加工的或断裂形式的Caspase9结合,可抑制由Apaf1(apoptosisproteinactivating factor1),细胞色素C及dATP诱导的Caspase9激活作用。 Livin与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性,这有赖于其BIR

结构域的完整,BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致livin与Caspase的结合作用及livin抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失

[19] 。②激活TAK1/JNK1信号传导途径: Livin可激活MAP(mitogenactivated protein)激酶JNK1和JNK2,对JNK3无激活作用,而livin对JNK1的激活作用远远强于JNK2,并且是livin对抗TNFα和ICE介导的细胞凋亡作用的一条重要途径。 JNK蛋白家族可直接由MKK4 /MKK7激活,但livin对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径,而是通过TAB1/TAK1途径实现。 TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1 。 TAB1是TAK1的共反应子(coactivator),TAB1本身对于JNK1无激活作用,但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin可与TAB1结合,并进一步激活TAK1[20] 。此外,SMAC( second mitochondrial activator of caspases)及活性肽片段可与livin的BIR结构域特异性结合,抑制livin与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAC介导的对livin抗细胞凋亡作用的负性调节机制。

护细胞膜中的多不饱和脂肪酸[21～23]。含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可在脂质过氧化物破坏细胞膜前就把它们清除掉。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。VE 的分子结构上其酚羧基的氢原子可提供给自由基,使之还原成脂质氢过氧化物阻断生物膜上多不饱和脂肪酸的自身过氧化。并且VE 还可结合生物膜上,保护生物膜免受自由基的攻击和氧化损伤。同时VE 能增强GSH2Px 的活性,并与GSH2Px 协同地终止脂质过氧化及与磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶一起抑制微粒体膜磷脂过氧化。

本实验通过免疫组织化学方法观察到: 正常对照组Livin表达呈阳性, 糖尿病对照组Livin表达呈阴性;糖尿病补锌组Livin表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组Livin表达呈阳性。图像分析结果显示:糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0.05)。表明Zn+VE联合作用后可减少由于高血糖引起的心肌细胞的凋亡,对心肌细胞起了重要的保护作用。其确切机制还有待于进一步研究探讨。

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锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌COX2表达的影响

医学论文发表——创新医学网http://www.yixue360.com/

作者：陈敏张端莲作者单位：武汉大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系武汉 430071

【摘要】目的：研究锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌COX2表达的影响,以此探讨锌和维生素E对糖尿病心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测

血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/L ,饮水量> 40ml/d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为:糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组和糖尿病补Zn和VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学的实验,观察各组心肌组织中COX2的表达水平, 利用HPIAS2000图像分析系统测定COX2在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内COX2呈阴性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内COX2呈阳性表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内COX2呈弱阳性表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内COX2呈阴性表达。图像分析结果显示，糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间COX2的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0 05)。结论： Zn和VE联合使用可降低糖尿病大鼠心肌组织中COX2的活性,对糖尿病大鼠心肌细胞起了重要的保护作用。

【关键词】锌维生素E 糖尿病心肌

糖尿病( diabetes mellitus ,DM) 是一类由于胰岛素绝对或相对缺乏或胰岛素生物活性降低,或者以上两者共同引起之体内代谢失调及高血糖状态[1]。临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和2 型糖尿病,

世界各国糖尿病患病率均上升,其中90 %为2 型糖尿病。

糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。目前糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但目前认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、Ca2+ 超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关。糖尿病时,高血糖引起的氧化应激参与了心肌细胞的损伤。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起[2] 。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。因此对糖尿病的治疗也就成了目前人们所关注的焦点。

环氧化酶又称为前列腺素内过氧化合成酶,前列腺素H合成酶,是催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶。COX2属于诱导型,静息时不表达,但可以在细胞因子、激素、致癌物质等多种诱导因子的刺激下快速表达,参与多种病理生理过程[3]。近年来研究表明,COX2不仅与病理生理过程有关,与肿瘤的发生发展也有密切的联系。COX2的高表达与糖尿病并发症的发生密切相关。

Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属

配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高[4]。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用[5]。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。锌和维生素E是抗氧化剂并具有细胞保护作用。本研究应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞内COX2的表达,旨在探讨两者对糖尿病大鼠氧化应激时心肌结构的影响及对心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180～200g,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组

按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的

STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组和糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献[5],合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补Zn 组给予Zn 浓度为20 mg/L的含ZnSO4·7H2O 去离子水;补VE 组每天以50 mg/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4 ·7H2O 去离子水的同时以50mg/ kgVE灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称2次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

1.2.2 免疫组织化学SP法检测COX2相关抗原

主要步骤：

① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;

② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活

性，PBS洗4×5min;

③ COX2采用微波抗原修复(3档，10 min)，PBS洗4×5min;

④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;

⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min;

⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;

⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;

⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;

⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 免疫组织化学结果判断

COX2以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞

核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。

采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对COX2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

1.2.4 统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 COX2的表达

正常对照组心肌细胞胞核内可见少量的棕黄色颗粒, COX2 表达呈阴性, 糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒, COX2表达呈阳性;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞

核内可见一些棕黄色颗粒, COX2表达呈弱阳性;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核内可见少量的棕黄色颗粒, COX2表达呈阴性。图像分析结果显示：正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组、糖尿病补Zn+VE组平均光密度分别为0.0926±0.0214、0.2684±0.0527、0.1680±0.0254、0.1771±0.0280、0.0973±0.0524。正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组、糖尿病补Zn+VE组COX2的阳性面积率分别为0.0935±0.0162、0.2579±0.0397、0.1731±0.025、0.1643±0.019、0.1007±0.0208。糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间COX2的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0 05)。见表1。表1 糖尿病补Zn+VE组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组COX2表达的平均

光密度和阳性面积率(略)注：* 正常对照组与糖尿病对照组比较， P0.05 。

3 讨论

糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的。近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第三位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起

[6] 。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。较一致的看法认为与遗传、环境、病毒感染、肥胖、种族、营养物质代谢和内分泌失调等因素有关。引起生物体自由基生成增多的原因与诱发糖尿病的因素存在着交叉性。当自由基在体内的产生增加时,由于其特殊的细胞毒性作用,可对机体产生一系列的损害作用,其中对胰岛β细胞的损伤是引发糖尿病的一个重要因素[7]。

糖尿病性心肌病变是糖尿病常见的慢性并发症,随着病程的延长出现心肌细胞受损和心功能异常,临床主要表现为充血性心力衰竭、心绞痛、心律失常等。其病理改变主要是心功能的降低、心肌细胞肥大、心肌纤维化和细胞凋亡及微血管病变等[8]。

Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用,其作用机理,可能是竞争性结

合膜蛋白上的巯基,有效地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 作为第一线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,通过在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸。含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可在脂质过氧化物破坏细胞膜前就把它们清除掉。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。VE 的分子结构上其酚羧基的氢原子可提供给自由基,使之还原成脂质氢过氧化物阻断生物膜上多不饱和脂肪酸的自身过氧化。并且VE 还可结合生物膜上,保护生物膜免受自由基的攻击和氧化损伤。同时VE 能增强GSH2Px 的活性,并与GSH2Px 协同地终止脂质过氧化及与磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶一起抑制微粒体膜磷脂过氧化。

环氧化酶又称为前列腺素内过氧化合成酶,前列腺素H合成酶,是催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶。哺乳动物的环氧化酶至少有两种形式:COX1和COX2,它们都是完整的膜结合蛋白。但在细胞内部的定位不同:COX1位于内质网,而COX2位于核膜和内质网(主要为核膜)[9]。功能上也存在差异,COX1属于结构型基因,在多种正常组织和细胞中表达,维持细胞的正常生理功能;COX2属于诱导型,静息时不表达,但可以在细胞因子,激素,致癌物质等多种诱导因子的刺激下快速表达,参与多种病理生理过程[10]。近年来研究表明,COX2不仅与病理生理过程有关,与肿瘤的发生发展也有

密切的联系。COX2的高表达与糖尿病并发症的发生密切相关。Komers等[11]研究认为,肾皮质COX2蛋白的高表达与肾血流动力学改变密切相关,介导了糖尿病肾病的高滤过状态。Zuo等[12]的研究发现,COX2选择性抑制剂莫可比对糖尿病肾病具有保护作用。但COX2在糖尿病心肌细胞中的表达研究不多。

本实验通过免疫组织化学的方法观察到: 正常对照组心肌细胞内COX2呈低表达, 糖尿病对照组心肌细胞内COX2呈高表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内COX2呈低表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内COX2呈低表达。实验结果提示:心肌细胞作为非炎症相关细胞,在高血糖刺激下,也可出现COX2表达活性的增强。而体糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内COX2呈低表达,提示Zn+VE联合使用可使糖尿病导致的心肌细胞内COX2的活性降低,从而起到对糖尿病性心肌病变的保护作用。

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锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Smac表达的作用

医学论文发表——创新医学网http://www.yixue360.com/

作者：张婷作者单位：(武汉科技大学附属天佑医院干部一区武汉430070 )

【摘要】目的：探讨锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Smac表达的作用及对糖尿病大鼠心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),实验组动物采用腹腔注射链脲左菌素(streptozotocin， STZ)，60mg/kg一次注射，制备糖尿病大鼠模型。将40只实验组大鼠按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学染色,观察各组心肌组织Smac的表达水平, 利用HPIAS2000图像分析系统测定Smac在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内Smac呈阴性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内Smac呈阳性表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内Smac呈弱阳性表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内Smac呈阴性表达。图像分析结果显示：糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Smac的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0 05)。结论： Zn和VE联合使用可减低糖尿病导致大鼠心肌细胞凋亡的作用。

【关键词】锌; 维生素E; 糖尿病; 心肌; Smac; 统计分析

糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的。近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第3位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病[1]。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚[2～3]。

Smac是王晓东等2000年在线粒体中发现的一种蛋白,可释放到胞浆中促进凋亡的发生细胞凋亡和增殖的平衡是生物个体正常生长发育的基础,细胞增殖过度和(或)细胞凋亡受阻是肿瘤形成过程中的重要机制。Smac是近期发现的一种促凋亡蛋白,在凋亡信号刺激下与细胞色素C(cytc)一同从线粒体中释放,可通过结合并活化apaf1以及结合并解除凋亡抑制蛋白(IAPs)对caspase3、7、9的抑制作用而发挥作用[4～6]。

Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其含量的增加势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作

用的途径之一,是基于控制过氧化作用。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用[7]。锌和维生素E是抗氧化剂并具有细胞保护作用。

本研究应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞凋亡的保护作用，旨在探讨两者对糖尿病大鼠心肌的保护作用。

1 材料与方法

1 材料

昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180～200g ,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

1.2 方法

后,采尾静脉血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献[5],合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补Zn 组给予Zn 浓度为20 mg/L的含ZnSO4·7H2O 去离子水;补VE 组每天以50 mg/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4 ·7H2O 去离子水的同时以50mg/ kgVE灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室壁肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

1.2.2 主要试剂

① 即用型兔抗鼠Smac单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);② 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③ DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

1.2.3 免疫组织化学SP法检测Smac相关抗原

主要步骤：① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%

过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;③ 切片采用微波抗原修复(3档，10 min)，PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min;⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 免疫组织化学结果判断

以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。

采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Smac的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

1.2.5 统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

2 结果

正常对照组心肌细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Smac表达呈阴性, 糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见较多的棕黄色颗粒, Smac表达呈阳性;糖尿病补锌组心肌细胞核和胞浆内可见一些棕黄色颗粒, Smac表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒, Smac表达呈阴性。图像分析结果显示见表1。糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Smac的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0 05)，见表1。表1 糖尿病补Zn+VE组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组Smac表达的平均光密度和阳性面积率注： ☆ 正常对照组与糖尿病对照组比较，P

3 讨论

糖尿病是由于胰岛素分泌或作用的障碍，导致以高血糖为共同特征的内分泌代谢性疾病。急性并发症如：酮症酸中毒、高渗性酸中毒、高渗性昏迷;慢性并发症如：糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、皮肤病变;神经病变如：周围神经病变、植物神经病变等;还有急性、慢性、局部和全身的感染如：皮肤坏疽、肺结核、胆囊炎、胆结石、肾孟肾炎、外阴感染。糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。据流行病学调查估计目前全球糖尿病患者总数已逾一亿，其中90%左右为2型糖尿病，其发病机理为胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌缺陷或胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖产生增加。2型糖尿病的治疗以口服降糖药为主。糖尿病是一种严重威胁人们健康的慢性疾病[8～10]。

细胞凋亡(Apop tosis)又称程序性细胞死亡( Programmed cell death) ,是生理性细胞死亡过程,对机体的发生、发展,以及自身稳定起着关键性作用。Smac是一种新发现的线粒体蛋白,在细胞凋亡过程中起着重要作用;当细胞发生凋亡时,其与细胞色素C一起被释放进入细胞浆[11]; Smac 通过解除凋亡抑制蛋白对Caspase3、Caspase7、Caspase9的抑制作用而诱导细胞凋亡。Smac能引发保护性的细胞反应而不致细胞死亡。体外培养研究结果表明, Smac可引起人类主动脉平滑肌细胞和内皮细胞的活化,增生。对MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)路径的分析揭示, ERK1、JNK1 ( JunN末端激酶)和MAPK等激酶都被Smac活化。内皮细胞膜上的Smac也能够活化JAK1

(Janus激酶)以及信号转导因子和转录激活因子STAT3, 4,进而启动一些相关基因的表达。现有证据证明:补体系统的活化在动脉粥样硬化的慢性炎症进展中,起着重要作用[12]。利用新西兰白兔离体心脏研究表明:非杀伤性补体激活,能够显著减少因局部缺血造成的梗死面积;但结果提示,这种情况下补体是通过C5a的形成而起作用的。进一步研究提示,由免疫球蛋白介导的补体缓慢活化而产生的Smac对充血性心肌病的发展,可能起着一定程度的促进作用。经过对28 位充血性心肌病患者心肌组织活检的分析证实:心肌细胞上有C5b29 复合物的沉积,并且与免疫球蛋白的沉积、心肌细胞TNF2α的表达,有明显的相关性[13～15]。

Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用,其作用机理,可能是竞争性结合膜蛋白上的巯基,有效地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 作为第一线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,通过在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸[16～18]。含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可在脂质过氧化物破坏细胞膜前就把它们清除掉。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。VE 的分子结构上其酚羧基的氢原子可提供给自由基,使之还原成脂质氢过氧化物阻断生物膜上多不饱和脂肪酸的自身过

氧化。并且VE 还可结合生物膜上,保护生物膜免受自由基的攻击和氧化损伤。同时VE 能增强GSH2Px 的活性,并与GSH2Px 协同地终止脂质过氧化及与磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶一起抑制微粒体膜磷脂过氧化[19，20]。

本实验通过免疫组织化学方法观察到: 正常对照组Livin表达呈阴性, 糖尿病对照组Livin表达呈阳性;糖尿病补锌组Livin表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组Livin表达呈阴性。图像分析结果显示:糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0.05)。Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用,其作用机理,可能是竞争性结合膜蛋白上的巯基,有效地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 作为第一线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,通过在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸[21～23]。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。表明Zn+VE联合作用后可减少由于高血糖引起的心肌细胞的凋亡,对心肌细胞起了重要的保护作用。其确切机制还有待于进

一步研究探讨。

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