2010年10
月October 2010
Chinese Journal of Chromatography
Vo l. 28No. 10
945~949
DO I:10. 3724/SP. J. 1123. 2010. 00945
研究论文
固相萃取 高效液相色谱法测定蜂蜜中的有机酸
朱晓玲1, 2, 叶 飞1, 2, 杨 洁1, 2, 肖 潇4, 文 红2, 3*, 刘 睿1, 2*
(1. 华中农业大学食品科技学院, 湖北武汉430070; 2. 武汉市蜂产品质量控制工程技术研究中心,
湖北武汉430070; 3. 湖北省产品质量监督检验研究院, 湖北武汉430061;
4. 湖南农业大学食品科技学院, 湖南长沙410128)
摘要:建立了固相萃取 高效液相色谱(SPE H PL C) 同时测定蜂蜜中5种有机酸(L 苹果酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、D 苹果酸) 含量的方法。蜂蜜经制样后过Bond Elut es SA X 固相萃取(SPE) 小柱净化, 用C 18 M S 反相色谱柱(250mm 4 6mm, 5 m) 进行分离, 流动相为2%偏磷酸溶液, 流速为0 7mL/min, 检测波长为210nm 。在此条件下5种有机酸在相应的线性范围内其线性相关系数均大于0 9967; 方法的回收率为86 0%~103 9%, 相对标准偏差为5 7%~9 8%(n =6) , 检出限为0 06~9 4mg/kg 。所建立的方法可用于蜂蜜样品中有机酸的测定。关键词:固相萃取; 反相高效液相色谱法; 有机酸; 蜂蜜
中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2010) 10 0945 05
Determination of organic acids in honey by solid phase
extraction high performance liquid chromatography
ZH U X iaoling 1, 2, YE F ei 1, 2, YA N G J ie 1, 2, X I A O X iao 4, WEN H ong 2, 3*, L I U Rui 1, 2*
(1. College of Food Science and T echnology , H uaz hong A gricultur al Univer sity , Wuhan 430070, China; 2. W uhan Resear ch Center on Quality Contr ol Engineering of Bee Pr oducts , Wuhan 430070, China; 3. H ubei Provincial Sup erv ision and I nsp ection Resear ch Institute f or Pr oduct Quality , W uhan 430061, China;
4. College of Food Science and T echnology , H unan A gr icultur al Univer sity , Changsha410128, China)
Abstract :A metho d for the simultaneous determination of 5org anic acids (L m alic acid, maleic acid, succinic acid, citr ic acid, D malic acid) in honey w as developed by solid phase extraction and hig h perform ance liquid chromatog raphy (SPE H PLC). T he sample was purified by a Bo nd E lutes SAX SPE car tr idge after pr etreatm ent, then separated using a reversed phase C 18 M S co l umn. A 2%m etaphosphoric acid solutio n w as used as the m obile phase at a flow rate of 0 7mL/min. The detection w as perfo rmed by a diode array detector at 210nm. Under these condi tions, the linear r anges of the method for L malic acid w as 5 0-500mg/L, for m aleic acid w as 0 1-500m g/L, and for succinic acid, citr ic acid, D malic acid w ere 18 0-500mg /L. T he co rre lation coefficients of 5org anic acids w ere mo re than 0 9967. The aver ag e recov eries of 5o rganic acids w ere 86 0%-103 9%w ith the relative standard dev iations of 5 7%-9 8%(n =6). The detection limits rang ed fr om 0 06to 9 4mg /kg. T he m ethod can be used fo r deter mining o rganic acids in honey sam ples.
Key words :so lid phase ex traction (SPE) ; reversed phase high perform ance liquid chrom atog ra phy (RP H PLC) ; org anic acids; ho ney 蜂蜜是一种传统的天然保健食品, 营养十分丰富。随着世界各国人们生活水平的提高, 对蜂蜜的需求量不断增加。我国是世界养蜂大国, 蜂蜜出口
量居世界前列, 然而近年来我国的蜂蜜在国际市场上出现遭遇退货及质量达不到进口国标准的现象, 究其原因主要在于我国蜂蜜的农药残留、兽药残
[1]
*通讯联系人:文 红, 硕士, 高级工程师, 研究方向为食品质量分析. E mail:w en_red@sina. com.
刘 睿, 博士, 副教授, 研究方向为蜂产品加工及蜂产品质量控制. E m ail:liu rui@mail. hzau. edu. cn.
基金项目:武汉市科技局工程技术研究中心项目(No. [1**********]7) 和华中农业大学新兴学科研究生教育发展基金(No.
200922) . :
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色谱
样品:湖北产荆条蜜。
第28卷
留以及掺假问题严重[2]。2002年, 我国颁布的国家标准(GB/T 18796) 有效破解了欧美及日本等国对我国蜂产品设置的农药残留、兽药残留技术壁垒, 但对于蜂产品掺假问题当前的国家标准仍不能满足快速、准确的检测需要。因此对我国来说, 有必要建立一种快速准确的蜂产品质量检测方法来甄别掺假蜂蜜。近年来国外对蜂蜜的成分研究表明, 蜂蜜中存在着微量的生物活性物质, 不同的单花蜂蜜, 其特征成分存在很大的差异。因此可结合指纹图谱技术, 建立国内不同蜜源蜂蜜的微量活性成分指纹图谱, 以此进行蜂蜜真实属性的鉴别, 从而达到控制蜂蜜质量的目的。
蜂蜜中已知的微量活性成分包括黄酮类化合物、酚酸类化合物、有机酸、脱落酸、芳香物质等[3]。有机酸作为蜂蜜中活性成分之一, 占蜂蜜总量的0 5%,不仅构成蜂蜜的风味成分, 而且可使蜂蜜保持较低的pH (蜂蜜pH 范围通常为3 4~6 1) , 从而抑制微生物的生长繁殖[4, 5]。目前国外已有通过建立蜂蜜中有机酸指纹图谱来进行蜂蜜真实属性判别的报道。No zal 等建立了针对西班牙地区的8种蜂蜜及1种蜜露蜜中的草酸、葡萄糖酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、甲酸、富马酸、琥珀酸的离子色谱(IC) 检测方法。国内对于有机酸的研究大多以酱油、色酒、植物根系、山楂和发酵液
等为研究对象, 所采用的分析方法主要有酶法[14]、薄层色谱法(T LC) [15]、气相色谱法(GC) [16, 17]、高效液相色谱法(H PLC) 、IC 法等。关于蜂蜜产品中有机酸的种类和含量的报道较少。本文建立了固相萃取 反相高效液相色谱(SPE RP H PLC) 测定蜂蜜中有机酸的方法, 该方法操作简单, 其灵敏度、准确性和重现性高, 可同时测定蜂蜜中5种有机酸, 为蜂蜜有机酸指纹图谱的建立提供相关依据。
[8-12]
[18-20]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12, 13]
[6]
[7][3]
1. 2 色谱条件
色谱柱:Waters C 18 M S (250mm 4 6m m, 5 m ) ; 流动相:2%偏磷酸的水溶液; 流速:0 7m L/min; 进样量:20 L; 检测波长:210nm 。1. 3 实验方法
1. 3. 1 标准溶液的制备
D 分别准确称取0 50g 葡萄糖酸、甲酸、 苹果L 苹果酸、酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸9
种有机酸标准品于10mL 容量瓶中, 用去离子水混
匀并超声辅助溶解, 待有机酸标准品全部溶解后再用去离子水定容至刻度, 得到质量浓度为50g /L 的标准储备液。各取适量的单一标准储备液混合, 用水稀释至100m L 容量瓶中配成混合标准溶液, 其中葡萄糖酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酸质量浓度为5
L 苹果酸、g /L, D 苹果酸、柠檬酸为2g /L, 马来酸
为0 05g/L, 于4! 下储存。1. 3. 2 样品前处理方法
称取荆条蜜样品(若样品有结晶析出现象, 则首先需在60! 水浴中加热溶解混匀) 7 5g 于100mL 容量瓶中, 加入适量去离子水(约50mL) 溶解, 参照文献[4]的方法用0 1mo l/L N aOH 调其pH 至10 0, 磁力搅拌15min, 再用0 1m ol/L H 2SO 4调pH 至7 0, 用去离子水定容至刻度并混匀。
将Bo nd Elutes SAX SPE 小柱依次用10mL 甲醇活化, 10m L 去离子水平衡, 备用。取上述蜂蜜溶液10mL 经0. 45 m 水相滤膜过滤后以自然流速过柱, 待样品全部吸附后用10mL 去离子水淋洗, 采用抽真空泵负压控制流速至约3m L/min, 再用4mL 1m ol/L H Cl 以0 5m L/min 流速洗脱, 收集洗脱液并用水定容于5mL 的容量瓶中, 经0. 45 m 水相滤膜过滤后供H PLC 分析。
1 实验部分
1. 1 主要仪器与试剂
Pr ostar 230高效液相色谱仪(美国Varian 公司) 配Prostar 330二极管阵列检测器; Bond Elutes SAX SPE 小柱(美国Varian 公司) ; 12管SPE 装置(美国Supelco 公司) ; Milli Q 去离子水发生器(美国Millipore 公司) ; 0. 45 m 水相滤膜(德国M em brana 公司) 。
D 苹果酸、L 苹果酸、 葡萄糖酸、甲酸、乙酸、马
来酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸均购自美国Sig ma 公
2 结果与讨论
2. 1 目标物质的选择
参考文献[5, 7, 21, 22]中所报道的各国蜂蜜中的有机酸组成情况, 选取了9种有机酸(葡萄糖酸、
D 苹果酸、L 苹果酸、甲酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、柠
檬酸、丙酸) 为研究对象。但在蜂蜜样品分析中葡萄
糖酸出峰时间在4m in 左右, 与蜂蜜中杂质出峰时间重叠, 无法进行定性和定量分析, 甲酸、乙酸、丙酸在不同加标水平下回收率较低且不稳定, 对于造成此现象的原因还有待进一步研究。本文所建立的方
L 苹果法可以对蜂蜜中的5种有机酸(D 苹果酸、
司; 甲醇为色谱纯试剂; 盐酸、氢氧化钠及偏磷酸为
第10期
朱晓玲, 等:固相萃取 高效液相色谱法测定蜂蜜中的有机酸
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为构建蜂蜜中有机酸指纹图谱积累数据。以下主要讨论对5种有机酸的分离鉴定条件的优化。2. 2 样品前处理中的pH 值调节
Su rez Luque 等[4]在实验中发现, 蜂蜜中有机酸内酯在进行H PLC 分析时会造成基线干扰。他们用0 1m ol/L NaOH 将样品液的pH 调至10 0, 磁力搅拌15m in, 将有机酸内酯水解转化为游离的有机酸, 再用0 1m ol/L H 2SO 4调pH 至7 0, 可有效消除干扰。本文按照该方法, 得到满意结果。2. 3 SPE 条件的优化2. 3. 1 SPE 柱的选择
H PLC 方法很难直接用于检测蜂蜜中的有机酸, 原因之一在于有机酸在蜂蜜中的含量非常低, 且存在大量的干扰组分, 因此必须将样品经SPE 处理以达到净化富集的目的。有机酸在水溶液中可离解成羧酸根阴离子和氢离子, 因此可选用阴离子交换SPE 柱对蜂蜜中的有机酸进行净化富集。本文比较了Waters Oasis MAX 、Cleanert SAX 以及Bond Elutes SAX 3种SPE 柱对蜂蜜中有机酸萃取效果的影响。分别收集直接过萃取柱以及淋洗和洗脱后的溶液进H PLC 分析, 结果表明Water s Oasis MAX 和Cleanert SAX SPE 柱对有机酸的保留性不强, 部分有机酸随上样流出液和淋洗液流出, 以致回收率较低, 而Bond Elutes SAX SPE 柱能较好地保留有机酸, 因此选择Bond Elutes SA X SPE 柱进行蜂蜜中有机酸的提取净化。
2. 3. 2 SPE 过程中pH 的影响
首先以混合有机酸标准溶液代替蜂蜜样品进行SPE 处理以初步确立SPE 条件。Bond Elutes SAX 柱是以硅胶为基质的强阴离子交换SPE 柱, 其主要官能团是三甲基胺丙基, 主要作用力是阴离子交换, 第二作用力是非极性、极性、阳离子交换; SAX 是最强的阴离子交换剂。由于其官能团是季胺, 使得三甲基胺丙基总是带正电; 同时官能团上的碳原子被胺遮蔽, SAX 的非离子作用力十分小[23], 因此为使有机酸在SAX 柱上得到较好的保留, 必须调节分析体系(样品溶液、活化液、淋洗液) pH 值使目标化合物与SPE 吸附剂带相反电荷, 即呈阴离子状态。根据弱酸性化合物在水中的解离平衡方程以及H en der son H asselbach 方程, 要使弱酸性化合物99%离子化, 则样品基质pH 值应高于化合物p K a 至少两个pH 单位
[23]
为7、8、9、10时, 所选的5种有机酸回收率均较理想, 均大于76 7%。
表1 不同pH 时5种有机酸的回收率(n =6)
T able 1 Recoveries of 5organic acids under
different pH (n =6) Compound
L M alic acid
%pH 10100. 2100. 998. 782. 376. 7
pH 795. 996. 792. 887. 586. 6
pH 880. 789. 685. 292. 086. 9
pH 977. 1103. 694. 488. 190. 0
M aleic acid Succinic acid Citric acid
D M alic acid
将上述初步建立的方法用于蜂蜜样品, 以加标回收率为评价依据对SPE 条件进行优化。实验发现, 当分析体系pH 为8~10时, 对洗脱液进行H PLC 分析会出现色谱峰响应值降低或不出峰的现象; 当pH 为7 0时, 5种有机酸出峰情况较好, 回收率理想。这可能是因为蜂蜜中含有较多的葡萄糖、果糖等干扰成分, pH 为8~10时, 糖结构中的羟基在较强碱性环境下发生部分电离, 与目标组分一同被Bond E lutes SAX SPE 小柱保留, 继而干扰了对目标物质的洗脱。故选择分析体系pH 为7 0。
2. 3. 3 洗脱剂用量的选择
SPE 柱上的有机酸常采用H Cl 进行洗脱。实验发现, 当采用1mol/L H Cl 为洗脱剂且洗脱剂用量大于3m L 时, 目标有机酸即可被完全洗脱。本研究选择洗脱剂用量为4m L 。2. 4 色谱条件的优化
在RP H PLC 分离过程中, 有机酸分子直接在两相中分配, 各种有机酸因分配系数不同而被分离。为使有机酸尽可能以分子形式存在, 一般使用酸性流动相来抑制有机酸的解离[24]。Nozal 等[7]比较了不同浓度的磷酸二氢铵、硫酸、磷酸和偏磷酸对有机酸分离效果的影响, 发现以偏磷酸作为流动相添加剂时分离效果最佳; Su r ez Luque 等[4]在流动相中添加偏磷酸, 对5种有机酸(苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸) 进行了分离测定, 也取得了较好的结果。
本实验在参考上述文献的基础上以2%偏磷酸水溶液为流动相, 并根据高海燕等[25]的研究结果(流动相中添加少量的甲醇能够有效地改变峰形和分离度) , 考察了不同的甲醇含量(0%、1%、2%、3%) 对该色谱方法分离效果的影响。结果表明, 加入甲醇后琥珀酸和柠檬酸不能完全分离, 故仍选取2%偏磷酸为流动相。另外还考察了流速分别为0 5、。由于几种目标物p K a 值范围分布
较广, 为使目标物尽可能以阴离子形式存在, 比较了
分析体系pH 分别为7、8、9、10时萃取柱对有机酸1
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色谱第28卷
响, 发现流速为0 8、1 0mL/m in 时琥珀酸和柠檬酸仍不能完全分离; 当流速为0 5、0 6m L/min 时, 5种有机酸全部出峰, 但分析时间过长; 流速为0 7mL/min 时, 25m in 内色谱分析完成, 且各目标物质能得到完全分离。所以选择流速为0 7mL/m in 。图1为9种有机酸标准品在此条件下的色谱图。2. 5 线性关系、检出限及线性范围 将9种有机酸的混合标准溶液分别稀释5倍、10倍、25倍、50倍, 配成一系列标准溶液, 采用上述色谱条件进样20 L 分析, 以标样质量浓度为横轴(x , mg /L) , 相应的峰面积为纵轴(y ) , 绘制标准曲线, 得到线性回归方程; 同时进行样品添加试验, 以信噪比(S /N ) 为3确定各有机酸在蜂蜜样品中的检出限, 结果见表2
。
图1 9种有机酸混合标准溶液的HPLC 谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of the mixed s tandard
solution of 9organic acids
Peaks:1. gluconic acid; 2. form ic acid; 3. L malic acid; 4. acetic acid; 5. m aleic acid; 6. s uccin ic acid; 7. citric acid; 8. D malic acid; 9. pr opion ic acid.
表2 5种有机酸的线性范围、回归方程、相关系数与检出限(S /N =3)
Table 2 Linear ranges, regression equ ations , correlation coefficients and detection limits (S /N =3) of 5organic acids
Com pound
L M alic acid
Linear range/(m g/L)
5. 0-5000. 1-50018. 0-50018. 0-50018. 0-500
Regres sion equation * y =1 107x -4. 26 105 y =6 y =1
108x -107x -5. 77 2. 59
104105
y =3 106x +1. 54 105 y =9 106x +9. 91 102
Correlation coefficient
0. 99670. 99990. 99900. 99710. 9998
Detection limit/(mg/kg)
3. 00. 069. 47. 66. 8
M aleic acid S uccinic acid Citric acid
D M alic acid
*y :peak area; x :mass concentration, mg/L.
2. 6 稳定性
将混合标准溶液分别放置0、6、12、24、36h 后进样。在36h 内5种有机酸的峰面积无明显变化, 相对标准偏差(RSD) 分别为1 1%、1 2%、0 3%、1 2%、1 5%,表明供试品溶液稳定性良好。2. 7 精密度和回收率
准确称取荆条蜜样品7 5g, 分别添加高、中、低
表3 5种有机酸的回收率及精密度(RSD) (n =6)
Table 3 Recoveries and precisions (RSD) of
5organic acids (n =6) Compound
L M alic acid
3个水平的混合有机酸标准溶液, 按1 3 2节所述方法平行处理并按1 2节所述色谱条件检测, 每一加标水平平行测定6次, 计算平均回收率。5种目标有机酸的加标回收率和精密度结果见表3。蜂蜜样品加标色谱图见图2。结果表明, 在不同的加标水平下, 5种目标有机酸的回收率稳定, 精密度良好,
满足蜂蜜样品中有机酸的分析要求。
Added/(m g/kg)
0. 20. 40. 6
Recovery/%
88. 292. 396. 090. 794. 0103. 991. 986. 096. 587. 892. 994. 194. 3101. 6103. 7
RSD/%9. 87. 05. 78. 79. 57. 49. 47. 96. 08. 17. 67. 39. 07. 58. 7
图2 加标蜂蜜样品的色谱图
Fig. 2 Chromatogram of honey sample added with
mixed standard s olution of 5organic acids
Peaks :1. L malic acid; 2. maleic acid; 3. su ccinic acid; 4. citric acid; 5. D m alic acid.
M aleic acid 0. 0050. 010. 016
Succinic acid 0. 511. 6
Citric acid 0. 20. 40. 6
D M alic acid 0. 20. 40. 6
2. 8 样品分析
第10期
朱晓玲, 等:固相萃取 高效液相色谱法测定蜂蜜中的有机酸
∀949∀
测定, 结果见表4, 其中一个样品的色谱图见图3。
表4 3个荆条蜜样品中5种有机酸的含量测定结果(n =3) T able 4 Determination results of 5organic acids in three
Chaste Tree hon ey samp les (n =3) g/g S am ple 123
L M alic
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acid 8. 76. 69. 7
M aleic acid 1. 22. 61. 4
S uccinic acid 160. 9167. 3149. 4
Citric acid 124. 1100. 695. 3
D M alic
acid 20. 728. 015.
6
图3 荆条蜜样品的色谱图
Fig. 3 Chromatogram of Chaste Tree honey sample Peaks:1. L malic acid; 2. maleic acid; 3. succinic acid; 4. citric acid; 5. D malic acid.
3 结语
对富集净化蜂蜜样品的SPE 条件进行优化, 并结合H PLC 进行分离测定, 建立了蜂蜜产品中5种有机酸的测定方法。该法简单、快速、操作方便、准确度和精密度高, 可用于蜂蜜样品中有机酸的检测。研究结果为建立蜂蜜有机酸指纹图谱提供研究方法, 并进一步为控制蜂蜜中掺假行为提供依据。参考文献:
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湖北武汉430070; 3. 湖北省产品质量监督检验研究院, 湖北武汉430061;
4. 湖南农业大学食品科技学院, 湖南长沙410128)
摘要:建立了固相萃取 高效液相色谱(SPE H PL C) 同时测定蜂蜜中5种有机酸(L 苹果酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、D 苹果酸) 含量的方法。蜂蜜经制样后过Bond Elut es SA X 固相萃取(SPE) 小柱净化, 用C 18 M S 反相色谱柱(250mm 4 6mm, 5 m) 进行分离, 流动相为2%偏磷酸溶液, 流速为0 7mL/min, 检测波长为210nm 。在此条件下5种有机酸在相应的线性范围内其线性相关系数均大于0 9967; 方法的回收率为86 0%~103 9%, 相对标准偏差为5 7%~9 8%(n =6) , 检出限为0 06~9 4mg/kg 。所建立的方法可用于蜂蜜样品中有机酸的测定。关键词:固相萃取; 反相高效液相色谱法; 有机酸; 蜂蜜
中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2010) 10 0945 05
Determination of organic acids in honey by solid phase
extraction high performance liquid chromatography
ZH U X iaoling 1, 2, YE F ei 1, 2, YA N G J ie 1, 2, X I A O X iao 4, WEN H ong 2, 3*, L I U Rui 1, 2*
(1. College of Food Science and T echnology , H uaz hong A gricultur al Univer sity , Wuhan 430070, China; 2. W uhan Resear ch Center on Quality Contr ol Engineering of Bee Pr oducts , Wuhan 430070, China; 3. H ubei Provincial Sup erv ision and I nsp ection Resear ch Institute f or Pr oduct Quality , W uhan 430061, China;
4. College of Food Science and T echnology , H unan A gr icultur al Univer sity , Changsha410128, China)
Abstract :A metho d for the simultaneous determination of 5org anic acids (L m alic acid, maleic acid, succinic acid, citr ic acid, D malic acid) in honey w as developed by solid phase extraction and hig h perform ance liquid chromatog raphy (SPE H PLC). T he sample was purified by a Bo nd E lutes SAX SPE car tr idge after pr etreatm ent, then separated using a reversed phase C 18 M S co l umn. A 2%m etaphosphoric acid solutio n w as used as the m obile phase at a flow rate of 0 7mL/min. The detection w as perfo rmed by a diode array detector at 210nm. Under these condi tions, the linear r anges of the method for L malic acid w as 5 0-500mg/L, for m aleic acid w as 0 1-500m g/L, and for succinic acid, citr ic acid, D malic acid w ere 18 0-500mg /L. T he co rre lation coefficients of 5org anic acids w ere mo re than 0 9967. The aver ag e recov eries of 5o rganic acids w ere 86 0%-103 9%w ith the relative standard dev iations of 5 7%-9 8%(n =6). The detection limits rang ed fr om 0 06to 9 4mg /kg. T he m ethod can be used fo r deter mining o rganic acids in honey sam ples.
Key words :so lid phase ex traction (SPE) ; reversed phase high perform ance liquid chrom atog ra phy (RP H PLC) ; org anic acids; ho ney 蜂蜜是一种传统的天然保健食品, 营养十分丰富。随着世界各国人们生活水平的提高, 对蜂蜜的需求量不断增加。我国是世界养蜂大国, 蜂蜜出口
量居世界前列, 然而近年来我国的蜂蜜在国际市场上出现遭遇退货及质量达不到进口国标准的现象, 究其原因主要在于我国蜂蜜的农药残留、兽药残
[1]
*通讯联系人:文 红, 硕士, 高级工程师, 研究方向为食品质量分析. E mail:w en_red@sina. com.
刘 睿, 博士, 副教授, 研究方向为蜂产品加工及蜂产品质量控制. E m ail:liu rui@mail. hzau. edu. cn.
基金项目:武汉市科技局工程技术研究中心项目(No. [1**********]7) 和华中农业大学新兴学科研究生教育发展基金(No.
200922) . :
∀946∀
色谱
样品:湖北产荆条蜜。
第28卷
留以及掺假问题严重[2]。2002年, 我国颁布的国家标准(GB/T 18796) 有效破解了欧美及日本等国对我国蜂产品设置的农药残留、兽药残留技术壁垒, 但对于蜂产品掺假问题当前的国家标准仍不能满足快速、准确的检测需要。因此对我国来说, 有必要建立一种快速准确的蜂产品质量检测方法来甄别掺假蜂蜜。近年来国外对蜂蜜的成分研究表明, 蜂蜜中存在着微量的生物活性物质, 不同的单花蜂蜜, 其特征成分存在很大的差异。因此可结合指纹图谱技术, 建立国内不同蜜源蜂蜜的微量活性成分指纹图谱, 以此进行蜂蜜真实属性的鉴别, 从而达到控制蜂蜜质量的目的。
蜂蜜中已知的微量活性成分包括黄酮类化合物、酚酸类化合物、有机酸、脱落酸、芳香物质等[3]。有机酸作为蜂蜜中活性成分之一, 占蜂蜜总量的0 5%,不仅构成蜂蜜的风味成分, 而且可使蜂蜜保持较低的pH (蜂蜜pH 范围通常为3 4~6 1) , 从而抑制微生物的生长繁殖[4, 5]。目前国外已有通过建立蜂蜜中有机酸指纹图谱来进行蜂蜜真实属性判别的报道。No zal 等建立了针对西班牙地区的8种蜂蜜及1种蜜露蜜中的草酸、葡萄糖酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、甲酸、富马酸、琥珀酸的离子色谱(IC) 检测方法。国内对于有机酸的研究大多以酱油、色酒、植物根系、山楂和发酵液
等为研究对象, 所采用的分析方法主要有酶法[14]、薄层色谱法(T LC) [15]、气相色谱法(GC) [16, 17]、高效液相色谱法(H PLC) 、IC 法等。关于蜂蜜产品中有机酸的种类和含量的报道较少。本文建立了固相萃取 反相高效液相色谱(SPE RP H PLC) 测定蜂蜜中有机酸的方法, 该方法操作简单, 其灵敏度、准确性和重现性高, 可同时测定蜂蜜中5种有机酸, 为蜂蜜有机酸指纹图谱的建立提供相关依据。
[8-12]
[18-20]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12, 13]
[6]
[7][3]
1. 2 色谱条件
色谱柱:Waters C 18 M S (250mm 4 6m m, 5 m ) ; 流动相:2%偏磷酸的水溶液; 流速:0 7m L/min; 进样量:20 L; 检测波长:210nm 。1. 3 实验方法
1. 3. 1 标准溶液的制备
D 分别准确称取0 50g 葡萄糖酸、甲酸、 苹果L 苹果酸、酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸9
种有机酸标准品于10mL 容量瓶中, 用去离子水混
匀并超声辅助溶解, 待有机酸标准品全部溶解后再用去离子水定容至刻度, 得到质量浓度为50g /L 的标准储备液。各取适量的单一标准储备液混合, 用水稀释至100m L 容量瓶中配成混合标准溶液, 其中葡萄糖酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酸质量浓度为5
L 苹果酸、g /L, D 苹果酸、柠檬酸为2g /L, 马来酸
为0 05g/L, 于4! 下储存。1. 3. 2 样品前处理方法
称取荆条蜜样品(若样品有结晶析出现象, 则首先需在60! 水浴中加热溶解混匀) 7 5g 于100mL 容量瓶中, 加入适量去离子水(约50mL) 溶解, 参照文献[4]的方法用0 1mo l/L N aOH 调其pH 至10 0, 磁力搅拌15min, 再用0 1m ol/L H 2SO 4调pH 至7 0, 用去离子水定容至刻度并混匀。
将Bo nd Elutes SAX SPE 小柱依次用10mL 甲醇活化, 10m L 去离子水平衡, 备用。取上述蜂蜜溶液10mL 经0. 45 m 水相滤膜过滤后以自然流速过柱, 待样品全部吸附后用10mL 去离子水淋洗, 采用抽真空泵负压控制流速至约3m L/min, 再用4mL 1m ol/L H Cl 以0 5m L/min 流速洗脱, 收集洗脱液并用水定容于5mL 的容量瓶中, 经0. 45 m 水相滤膜过滤后供H PLC 分析。
1 实验部分
1. 1 主要仪器与试剂
Pr ostar 230高效液相色谱仪(美国Varian 公司) 配Prostar 330二极管阵列检测器; Bond Elutes SAX SPE 小柱(美国Varian 公司) ; 12管SPE 装置(美国Supelco 公司) ; Milli Q 去离子水发生器(美国Millipore 公司) ; 0. 45 m 水相滤膜(德国M em brana 公司) 。
D 苹果酸、L 苹果酸、 葡萄糖酸、甲酸、乙酸、马
来酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸均购自美国Sig ma 公
2 结果与讨论
2. 1 目标物质的选择
参考文献[5, 7, 21, 22]中所报道的各国蜂蜜中的有机酸组成情况, 选取了9种有机酸(葡萄糖酸、
D 苹果酸、L 苹果酸、甲酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、柠
檬酸、丙酸) 为研究对象。但在蜂蜜样品分析中葡萄
糖酸出峰时间在4m in 左右, 与蜂蜜中杂质出峰时间重叠, 无法进行定性和定量分析, 甲酸、乙酸、丙酸在不同加标水平下回收率较低且不稳定, 对于造成此现象的原因还有待进一步研究。本文所建立的方
L 苹果法可以对蜂蜜中的5种有机酸(D 苹果酸、
司; 甲醇为色谱纯试剂; 盐酸、氢氧化钠及偏磷酸为
第10期
朱晓玲, 等:固相萃取 高效液相色谱法测定蜂蜜中的有机酸
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为构建蜂蜜中有机酸指纹图谱积累数据。以下主要讨论对5种有机酸的分离鉴定条件的优化。2. 2 样品前处理中的pH 值调节
Su rez Luque 等[4]在实验中发现, 蜂蜜中有机酸内酯在进行H PLC 分析时会造成基线干扰。他们用0 1m ol/L NaOH 将样品液的pH 调至10 0, 磁力搅拌15m in, 将有机酸内酯水解转化为游离的有机酸, 再用0 1m ol/L H 2SO 4调pH 至7 0, 可有效消除干扰。本文按照该方法, 得到满意结果。2. 3 SPE 条件的优化2. 3. 1 SPE 柱的选择
H PLC 方法很难直接用于检测蜂蜜中的有机酸, 原因之一在于有机酸在蜂蜜中的含量非常低, 且存在大量的干扰组分, 因此必须将样品经SPE 处理以达到净化富集的目的。有机酸在水溶液中可离解成羧酸根阴离子和氢离子, 因此可选用阴离子交换SPE 柱对蜂蜜中的有机酸进行净化富集。本文比较了Waters Oasis MAX 、Cleanert SAX 以及Bond Elutes SAX 3种SPE 柱对蜂蜜中有机酸萃取效果的影响。分别收集直接过萃取柱以及淋洗和洗脱后的溶液进H PLC 分析, 结果表明Water s Oasis MAX 和Cleanert SAX SPE 柱对有机酸的保留性不强, 部分有机酸随上样流出液和淋洗液流出, 以致回收率较低, 而Bond Elutes SAX SPE 柱能较好地保留有机酸, 因此选择Bond Elutes SA X SPE 柱进行蜂蜜中有机酸的提取净化。
2. 3. 2 SPE 过程中pH 的影响
首先以混合有机酸标准溶液代替蜂蜜样品进行SPE 处理以初步确立SPE 条件。Bond Elutes SAX 柱是以硅胶为基质的强阴离子交换SPE 柱, 其主要官能团是三甲基胺丙基, 主要作用力是阴离子交换, 第二作用力是非极性、极性、阳离子交换; SAX 是最强的阴离子交换剂。由于其官能团是季胺, 使得三甲基胺丙基总是带正电; 同时官能团上的碳原子被胺遮蔽, SAX 的非离子作用力十分小[23], 因此为使有机酸在SAX 柱上得到较好的保留, 必须调节分析体系(样品溶液、活化液、淋洗液) pH 值使目标化合物与SPE 吸附剂带相反电荷, 即呈阴离子状态。根据弱酸性化合物在水中的解离平衡方程以及H en der son H asselbach 方程, 要使弱酸性化合物99%离子化, 则样品基质pH 值应高于化合物p K a 至少两个pH 单位
[23]
为7、8、9、10时, 所选的5种有机酸回收率均较理想, 均大于76 7%。
表1 不同pH 时5种有机酸的回收率(n =6)
T able 1 Recoveries of 5organic acids under
different pH (n =6) Compound
L M alic acid
%pH 10100. 2100. 998. 782. 376. 7
pH 795. 996. 792. 887. 586. 6
pH 880. 789. 685. 292. 086. 9
pH 977. 1103. 694. 488. 190. 0
M aleic acid Succinic acid Citric acid
D M alic acid
将上述初步建立的方法用于蜂蜜样品, 以加标回收率为评价依据对SPE 条件进行优化。实验发现, 当分析体系pH 为8~10时, 对洗脱液进行H PLC 分析会出现色谱峰响应值降低或不出峰的现象; 当pH 为7 0时, 5种有机酸出峰情况较好, 回收率理想。这可能是因为蜂蜜中含有较多的葡萄糖、果糖等干扰成分, pH 为8~10时, 糖结构中的羟基在较强碱性环境下发生部分电离, 与目标组分一同被Bond E lutes SAX SPE 小柱保留, 继而干扰了对目标物质的洗脱。故选择分析体系pH 为7 0。
2. 3. 3 洗脱剂用量的选择
SPE 柱上的有机酸常采用H Cl 进行洗脱。实验发现, 当采用1mol/L H Cl 为洗脱剂且洗脱剂用量大于3m L 时, 目标有机酸即可被完全洗脱。本研究选择洗脱剂用量为4m L 。2. 4 色谱条件的优化
在RP H PLC 分离过程中, 有机酸分子直接在两相中分配, 各种有机酸因分配系数不同而被分离。为使有机酸尽可能以分子形式存在, 一般使用酸性流动相来抑制有机酸的解离[24]。Nozal 等[7]比较了不同浓度的磷酸二氢铵、硫酸、磷酸和偏磷酸对有机酸分离效果的影响, 发现以偏磷酸作为流动相添加剂时分离效果最佳; Su r ez Luque 等[4]在流动相中添加偏磷酸, 对5种有机酸(苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸) 进行了分离测定, 也取得了较好的结果。
本实验在参考上述文献的基础上以2%偏磷酸水溶液为流动相, 并根据高海燕等[25]的研究结果(流动相中添加少量的甲醇能够有效地改变峰形和分离度) , 考察了不同的甲醇含量(0%、1%、2%、3%) 对该色谱方法分离效果的影响。结果表明, 加入甲醇后琥珀酸和柠檬酸不能完全分离, 故仍选取2%偏磷酸为流动相。另外还考察了流速分别为0 5、。由于几种目标物p K a 值范围分布
较广, 为使目标物尽可能以阴离子形式存在, 比较了
分析体系pH 分别为7、8、9、10时萃取柱对有机酸1
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色谱第28卷
响, 发现流速为0 8、1 0mL/m in 时琥珀酸和柠檬酸仍不能完全分离; 当流速为0 5、0 6m L/min 时, 5种有机酸全部出峰, 但分析时间过长; 流速为0 7mL/min 时, 25m in 内色谱分析完成, 且各目标物质能得到完全分离。所以选择流速为0 7mL/m in 。图1为9种有机酸标准品在此条件下的色谱图。2. 5 线性关系、检出限及线性范围 将9种有机酸的混合标准溶液分别稀释5倍、10倍、25倍、50倍, 配成一系列标准溶液, 采用上述色谱条件进样20 L 分析, 以标样质量浓度为横轴(x , mg /L) , 相应的峰面积为纵轴(y ) , 绘制标准曲线, 得到线性回归方程; 同时进行样品添加试验, 以信噪比(S /N ) 为3确定各有机酸在蜂蜜样品中的检出限, 结果见表2
。
图1 9种有机酸混合标准溶液的HPLC 谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of the mixed s tandard
solution of 9organic acids
Peaks:1. gluconic acid; 2. form ic acid; 3. L malic acid; 4. acetic acid; 5. m aleic acid; 6. s uccin ic acid; 7. citric acid; 8. D malic acid; 9. pr opion ic acid.
表2 5种有机酸的线性范围、回归方程、相关系数与检出限(S /N =3)
Table 2 Linear ranges, regression equ ations , correlation coefficients and detection limits (S /N =3) of 5organic acids
Com pound
L M alic acid
Linear range/(m g/L)
5. 0-5000. 1-50018. 0-50018. 0-50018. 0-500
Regres sion equation * y =1 107x -4. 26 105 y =6 y =1
108x -107x -5. 77 2. 59
104105
y =3 106x +1. 54 105 y =9 106x +9. 91 102
Correlation coefficient
0. 99670. 99990. 99900. 99710. 9998
Detection limit/(mg/kg)
3. 00. 069. 47. 66. 8
M aleic acid S uccinic acid Citric acid
D M alic acid
*y :peak area; x :mass concentration, mg/L.
2. 6 稳定性
将混合标准溶液分别放置0、6、12、24、36h 后进样。在36h 内5种有机酸的峰面积无明显变化, 相对标准偏差(RSD) 分别为1 1%、1 2%、0 3%、1 2%、1 5%,表明供试品溶液稳定性良好。2. 7 精密度和回收率
准确称取荆条蜜样品7 5g, 分别添加高、中、低
表3 5种有机酸的回收率及精密度(RSD) (n =6)
Table 3 Recoveries and precisions (RSD) of
5organic acids (n =6) Compound
L M alic acid
3个水平的混合有机酸标准溶液, 按1 3 2节所述方法平行处理并按1 2节所述色谱条件检测, 每一加标水平平行测定6次, 计算平均回收率。5种目标有机酸的加标回收率和精密度结果见表3。蜂蜜样品加标色谱图见图2。结果表明, 在不同的加标水平下, 5种目标有机酸的回收率稳定, 精密度良好,
满足蜂蜜样品中有机酸的分析要求。
Added/(m g/kg)
0. 20. 40. 6
Recovery/%
88. 292. 396. 090. 794. 0103. 991. 986. 096. 587. 892. 994. 194. 3101. 6103. 7
RSD/%9. 87. 05. 78. 79. 57. 49. 47. 96. 08. 17. 67. 39. 07. 58. 7
图2 加标蜂蜜样品的色谱图
Fig. 2 Chromatogram of honey sample added with
mixed standard s olution of 5organic acids
Peaks :1. L malic acid; 2. maleic acid; 3. su ccinic acid; 4. citric acid; 5. D m alic acid.
M aleic acid 0. 0050. 010. 016
Succinic acid 0. 511. 6
Citric acid 0. 20. 40. 6
D M alic acid 0. 20. 40. 6
2. 8 样品分析
第10期
朱晓玲, 等:固相萃取 高效液相色谱法测定蜂蜜中的有机酸
∀949∀
测定, 结果见表4, 其中一个样品的色谱图见图3。
表4 3个荆条蜜样品中5种有机酸的含量测定结果(n =3) T able 4 Determination results of 5organic acids in three
Chaste Tree hon ey samp les (n =3) g/g S am ple 123
L M alic
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acid 8. 76. 69. 7
M aleic acid 1. 22. 61. 4
S uccinic acid 160. 9167. 3149. 4
Citric acid 124. 1100. 695. 3
D M alic
acid 20. 728. 015.
6
图3 荆条蜜样品的色谱图
Fig. 3 Chromatogram of Chaste Tree honey sample Peaks:1. L malic acid; 2. maleic acid; 3. succinic acid; 4. citric acid; 5. D malic acid.
3 结语
对富集净化蜂蜜样品的SPE 条件进行优化, 并结合H PLC 进行分离测定, 建立了蜂蜜产品中5种有机酸的测定方法。该法简单、快速、操作方便、准确度和精密度高, 可用于蜂蜜样品中有机酸的检测。研究结果为建立蜂蜜有机酸指纹图谱提供研究方法, 并进一步为控制蜂蜜中掺假行为提供依据。参考文献:
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