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《生命的化学》２０１１年３１卷１期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２０１１，３１（１）
● Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
文章编号： １０００－１３３６（２０１１）01－0152-05
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术
高 雅１ 齐锦生１ 栗彦宁２
１
河北医科大学生物化学与分子生物学教研室，石家庄 ０５００１７；河北医科大学实验动物学部分子生物学研究室，石家庄 ０５００１７
２
摘要：配对末端标签测序分析染色质相互作用（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＣｈＩＡ－ＰＥＴ）技术是一项在全基因组范围内分析远程染色质相互作用的新技术。它把染色质免疫沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈＩＰ）技术、染色质邻近式连接（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）技术、配对末端标签（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ， ＰＥＴ）技术和新一代测序（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术融为一体，在基因组三维折叠和套环状态下分析基因表达和调控。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术已用于确定人乳腺腺癌细胞内雌激素受体ａ的结合位点之间的相互作用。随着更多蛋白质因子的发现及其抗体的应用，该技术可实时捕获全基因组范围内参与复制、转录过程的蛋白质因子结合位点以及结合位点间的相互作用，这对于阐明基因调控和疾病发生机制具有重大意义。关键词：ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术；全基因组；染色质相互作用中图分类号：Ｑ３
染色质相互作用在基因组功能中的重要性一直备受关注。目前，研究染色质相互作用的技术主要有两大类：分子探针技术和分子相互作用图谱（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ）技术［１］。分子探针技术包括电子显微镜技术、原子力显微镜技术［２］和荧光原位杂交技术［３］等，它们能够提供直观的图像，为染色质相互作用的研究提供依据，但其图像的分辨率低，而且不能同时研究多个位点。分子相互作用图谱技术包括染色质构象捕获（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａ－ｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ， ３Ｃ）技术４Ｃ
［８，９］
［４，５］
Ｆｕｌｌｗｏｏｄ等［１１］２００９年１１月在《Ｎａｔｕｒｅ》上发表文章中提出了一项能够分析全基因组染色质相互作用的新技术——配对末端标签测序分析染色质相互作用（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＣｈＩＡ－ＰＥＴ）技术。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术是利用ＰＥＴ测序技术研究免疫沉淀后邻近式连接的ＤＮＡ片段，以得到染色质相互作用的技术。它灵敏，准确，对在全基因组范围内研究染色质相互作用具有重大意义，现简介如下。１． ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术的原理与方法
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术应用了ＰＥＴ测序技术的基本原理。ＰＥＴ测序技术的独特之处在于构建配对末端测序模板。从目的ＤＮＡ片段两个末端提取短标签并将它们配对构成一个ＰＥＴ，对ＰＥＴ进行高通量测序，利用标签序列定位目的ＤＮＡ片段在基因组中的位置。为了获得短标签，将目的ＤＮＡ片段两个末端分别与设计好的半连接子（ｌｉｎｋｅｒ）相连。半连接子为具有ＭｍｅＩ限制性内切酶识别位点的寡聚核苷酸序列，而ＭｍｅＩ限制性内切酶能够水解其识别位点下游１８／２０个碱基对。连接子连接后将ＤＮＡ片段两个末端配对，随后加入ＭｍｅＩ限制性内切酶，便可得到“标签－
和基于３Ｃ技术的ＣｈＩＰ－３Ｃ
［６，７］
、
、５Ｃ
［１０］
技术等，利用这些技术能够捕获染色质
点与点之间或多点之间的相互作用，但它们无法在全基因组范围内研究染色质的相互作用。总之，染色质相互作用的研究一直处于分辨率低和范围局限的状态。
收稿日期：２０１０－０９－３０
国家自然科学基金项目（８１０７０６５８）和河北省自然科学基金项目（Ｃ２００９００１０９２）资助
作者简介：高雅（１９８９－），女，本科生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｙａ１９８９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；齐锦生（１９６０－），男，博士，教授，Ｅ－ｍａｉｌ： ｑｉｊｉｎｓｈｅｎｇ７７７＠１６３．ｃｏｍ；栗彦宁（１９８１－），女，硕士，助教，通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｙａｎｎｉｎｇ１９８１＠１２６．ｃｏｍ
● 技术与方法
《生命的化学》２０１１年３１卷１期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２０１１，３１（１）
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连接子－标签（ｔａｇ－ｌｉｎｋｅｒ－ｔａｇ）”结构，即ＰＥＴ［１］（图１）。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术中，借助ＣｈＩＰ技术甲醛固定细免疫沉淀［图２（Ｂ）］，胞、超声断裂染色质［图２（Ａ）］、以获得与目的蛋白质因子结合的染色质片段。该染色质片段又被称为ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段，即ＰＥＴ测序技术中所需的目的ＤＮＡ片段。然后进行连接子连接［图２（Ｃ）］。为了在确定蛋白质因子结合位点的同时捕获结合位点间的相互作用，将同一蛋白质因子结合的ＤＮＡ片段末端先配对［图２（Ｄ）］再进行逆转交联［图２（Ｅ）］。随后进行ＭｍｅＩ限制性内切酶水解［图２（Ｆ）］和高通量测序。这样将产生两种类型的ＰＥＴ：自连接ＰＥＴ（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）和间连接ＰＥＴ（ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎＰＥＴ）。１．１ 自连接ＰＥＴ
如果一个ＰＥＴ的两个标签来自同一条染色质，基因组跨度在ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段范围（小于３ ｋｂ）内，方向相同且为相应单链连接，便被认为是一个ＣｈＩＰＤＮＡ片段中两个标签的自连接，称为自连接ＰＥＴ。自连接ＰＥＴ是确定蛋白质因子结合位点的基础。通过
构成自连接ＰＥＴ的两个标签可以确定其代表的ＣｈＩＰＤＮＡ片段，而该ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段包含蛋白质因子结合位点。利用峰检出程序（ｐｅａｋ－ｆｉｎｄｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ），把所有自连接ＰＥＴ两个标签代表的ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段映射（ｍａｐ）到参照基因组上，再将参照基因组每一区域被映射的次数转化为不同高度的峰，每一区域被映射的次数越多，峰越高。其每一高峰，都是大量的包含蛋白质因子结合位点的ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段重叠的区域，被认为是蛋白质因子结合位点。除高峰外，其它峰为弱的蛋白质因子结合位点或实验噪音（ｅｘｐｅｒｉ－ｍｅｎｔａｌ ｎｏｉｓｅ）。１．２ 间连接ＰＥＴ
如果一个ＰＥＴ不符合自连接ＰＥＴ的标准，其便为两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段间的连接，被称作间连接ＰＥＴ。间连接ＰＥＴ又分为三类：染色质内的间连接ＰＥＴ（ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）、染色质间的间连接ＰＥＴ（ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）和不同方向的间连接ＰＥＴ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）。
其中，染色质内的间连接ＰＥＴ所占比例最大，是
图１ ＰＥＴ测序技术基本原理［１］
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● Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
图２ ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术基本原理
用于确定结合位点间相互作用的重要依据。它是两个标签来自同一条染色质但是基因组跨度大于３ ｋｂ的间连接ＰＥＴ。相距较远的两个标签之所以能够构成染色质内的间连接ＰＥＴ，是因为这两个标签代表的两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段由同一个蛋白质因子结合着，即这两个ＤＮＡ片段间存在相互作用。故染色质内的间连接ＰＥＴ可以用来确定结合位点间的相互作用。由于间连接ＰＥＴ的两个标签分别来自两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段，需先依据参照基因组，分别延长两个标签远离连接子的序列，从２０ ｂｐ延长至１５００ ｂｐ（大多数ＣｈＩＰＤＮＡ片段小于１５００ ｂｐ），将其延长为相应的ＣｈＩＰＤＮＡ片段。再利用峰检出程序，将所有延长后的ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段在参照基因组不同区域的映射次数用峰的高度表示。出现高峰的区域，为蛋白质因子结合位点，其应与自连接ＰＥＴ确定的蛋白质因子结合位点一致。若一个间连接ＰＥＴ群，同时满足以下两个条件：（１）每一间连接ＰＥＴ的两个标签所代表的两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段，均包含一个高峰所对应的区域；（２）每一间连接ＰＥＴ映射的两个高峰区域是相同的，则为重叠的间连接ＰＥＴ群（图３）。重叠的间连接ＰＥＴ群可被用来确定结合位点间的相互作用。其映射的两个高峰区域，即蛋白质因子结合位点，存在相互作用。此外，染色质内的间连接ＰＥＴ的存在还可以
表明，蛋白质因子通过使染色质成环形成空间邻位结构以发挥其在复制、转录过程中的调节作用，从而推断结合位点间的相互作用是调节复制、转录的一个最基本的机制。
染色质间的间连接ＰＥＴ数量较少，表明染色质间存在弱的相互作用或为实验噪音；不同方向的间连接ＰＥＴ数量甚少，在正常情况下不应存在，被认为是实验噪音。此二者对于正确判定染色质相互作用缺乏价值。
为了评估非特异性嵌合连接对实验结果的影响，设计了具有标识作用的两种核苷酸序列半连接子：半连接子Ａ（ＣＧ）和半连接子Ｂ（ＡＴ）。连接子连接时将染色质均分成两份，一份加入半连接子Ａ，另一份加入半连接子Ｂ，除去多余的半连接子后，混匀，依次进行其后操作。由于结果中同时带有半连接子Ａ和半连接子Ｂ的ＰＥＴ是极少的，即非特异性嵌合连接是偶然的、互不重叠的，因此不会被误认为是相互作用。
综上所述，重叠的ＰＥＴ群被认为是蛋白质因子结合位点和结合位点间的相互作用，而甚少的ＰＥＴ则被认为是实验噪音。２． ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术的优、缺点
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ是全基因组范围内，无偏差的（ｕｎｂｉａｓｅｄ），
图３ 重叠的间连接ＰＥＴ群示意图
● 技术与方法
《生命的化学》２０１１年３１卷１期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２０１１，３１（１）
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从头（ｄｅ ｎｏｖｏ）分析染色质相互作用的技术。其具有以下优点：（１） ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术在全基因组范围内确定蛋白质因子结合位点的同时，能够确定结合位点间的相互作用。这也是其与仅能确定蛋白质因子结合位点，而不能确定结合位点间相互作用的ＣｈＩＰ－ＰＥＴ（ＣｈＩＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术的唯一区别。能否捕获结合位点间的相互作用，关键在于末端配对和逆转交联的顺序。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术先末端配对，再逆转交联，故能捕获由同一蛋白质因子结合的ＤＮＡ片段间的相互作用。而ＣｈＩＰ－ＰＥＴ技术先逆转交联，使原本被蛋白质因子结合的ＤＮＡ片段分散，只能产生自连接ＰＥＴ而不能产生间连接ＰＥＴ，所（２） ＣｈＩＡ－以无法捕获结合位点间的相互作用（图４）。
ＰＥＴ技术利用超声打断ＤＮＡ－蛋白质复合体，避免了利用限制性内切酶水解ＤＮＡ－蛋白质复合体引入的染色质随机连接， 因而有效减少了相互作用的噪音。（３） ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术借鉴了ＣｈＩＰ技术的优点棗利用特异性的抗体捕获与蛋白质因子结合的染色质，进而得到蛋白质因子结合位点和结合位点间的相互作用，避免了全基因组分析的复杂性。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术的发明，对于确定单一的功能性的转录因子结合位点是一个重大突破，然而要想确定蛋白质因子中每一种相互作用的蛋白质，尚需其他技术的介入。对于不依赖蛋白质因子的染色质相互作用，ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术不能检测。此外，ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术受众多因素影响，如：（１）所用抗体的质量，纯度和特异性。（２）ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术需要依赖峰检出程序将ＰＥＴ映射到参照基因组并检出高峰，不同峰检出程序定义高峰的标准等不同，故不同峰检出程序的使用会影响实验结果。３． 结语
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术已成为分析染色质相互作用的重
要方法，同时它标志着人类基因组通过折叠进行基因表达调控这一全新研究领域的开始。
随着参与ＤＮＡ复制、转录和染色质构象的蛋白质因子的发现及其抗体的使用，ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术将能确定更多染色质的相互作用。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术对于揭示细胞增殖、分化等过程基因调控机制是至关重要的。２０１０年，基于ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术原理，用于分析染色质相互作用的一整套软件已经研发并成为共享资源［１２］。通过相互作用图谱的绘制，可以更好地确定干预的特定目标，从而更好地了解和控制疾病。
参 考 文 献
［１］Ｆｕｌｌｗｏｏｄ ＭＪ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐａｉｒｅｄ－
ｅｎｄ ｔａｇｓ （ＰＥＴ） ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ２００９， １９： ５２１－５３２
［２］Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ＳＨ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｎｄ－ｌｏｏｐ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ＴＲＦ２． Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ， ２００４， ９： ２０５－２１８［３］Ｏｓｂｏｒｎｅ ＣＳ ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ ｔｏ ｓｈａｒｅｄ
ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｏｎｇｏｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００４， ３６： １０６５－１０７１
［４］Ｄｅｋｋｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２００２， ２９５： １３０６－１３１１
［５］Ｈａｇｅｇｅ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ａｓｓａｙｓ （３Ｃ－ｑＰＣＲ）． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２００７，２： １７２２－１７３３
［６］Ｈｏｒｉｋｅ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｌｏｓｓ ｏｆ ｓｉｌｅｎｔ－ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｌｏｏｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ
ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ＤＬＸ５ ｉｎ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００５， ３７：３１－４０
［７］Ｃａｉ Ｓ ｅｔ ａｌ． ＳＡＴＢ１ ｐａｃｋａｇｅｓ ｄｅｎｓｅｌｙ ｌｏｏｐｅｄ， ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ
ａｃｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｇｅｎｅｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００６， ３８： １２７８－１２８８
［８］Ｓｉｍｏｎｉｓ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖｅ
ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃａｐｔｕｒｅ－ｏｎ－ｃｈｉｐ （４Ｃ）． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００６， ３８： １３４８－１３５４［９］Ｚｈａｏ Ｚ ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ （４Ｃ）
ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｏｆ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｒａ－ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００６， ３８：
图４ ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术与ＣｈＩＰ－ＰＥＴ技术的比较
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１３４１－１３４７
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● Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
［１１］Ｆｕｌｌｗｏｏｄ ＭＪ ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａ－ｂｏｕｎｄ ｈｕｍａｎ
ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００９， ４６２： ５８－６４
［１２］Ｌｉ Ｇ ｅｔ ａｌ． ＣｈＩＡ－ＰＥＴ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ， ２０１０， １１： Ｒ２２
［１０］Ｄｏｓｔｉｅ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｐｙ
（５Ｃ）： ａ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ２００６， １６： １２９９－１３０９
The technique of ChIA-PET
GAO Ya 1, QI Jinsheng1, LI Yanning 2
1
2
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China;
Department of Molecular Biology, Hebei Key Lab of Laboratory Animal, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
Abstract Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (ChIA-PET) is a whole-genome approach for long-distance chromatin interaction analysis. It is a technique that incorporates chromatin immunoprecipitation, chromatin prox-imity ligation, paired-end tag, and next-generation sequencing to study gene expression and regulation in the genome’s three-dimensional folding and looping state. ChIA-PET has been applied to the identification of the estrogen-receptor-a-binding sitesand the interactions among the binding sites in human breast adenocarcinoma cells. With more protein factors being found andtheir antibodies being used, it will allow real-time and whole-genome identification of the DNA replication and transcription-involved protein factor-binding sites and the interactions among the binding sites, which has a great significance to reveal themechanisms of gene regulation and the pathogenesis of diseases.Key words ChIA-PET; whole-genome; chromatin interaction
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《生命的化学》２０１１年３１卷１期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２０１１，３１（１）
● Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
文章编号： １０００－１３３６（２０１１）01－0152-05
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术
高 雅１ 齐锦生１ 栗彦宁２
１
河北医科大学生物化学与分子生物学教研室，石家庄 ０５００１７；河北医科大学实验动物学部分子生物学研究室，石家庄 ０５００１７
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摘要：配对末端标签测序分析染色质相互作用（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＣｈＩＡ－ＰＥＴ）技术是一项在全基因组范围内分析远程染色质相互作用的新技术。它把染色质免疫沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈＩＰ）技术、染色质邻近式连接（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）技术、配对末端标签（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ， ＰＥＴ）技术和新一代测序（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术融为一体，在基因组三维折叠和套环状态下分析基因表达和调控。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术已用于确定人乳腺腺癌细胞内雌激素受体ａ的结合位点之间的相互作用。随着更多蛋白质因子的发现及其抗体的应用，该技术可实时捕获全基因组范围内参与复制、转录过程的蛋白质因子结合位点以及结合位点间的相互作用，这对于阐明基因调控和疾病发生机制具有重大意义。关键词：ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术；全基因组；染色质相互作用中图分类号：Ｑ３
染色质相互作用在基因组功能中的重要性一直备受关注。目前，研究染色质相互作用的技术主要有两大类：分子探针技术和分子相互作用图谱（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ）技术［１］。分子探针技术包括电子显微镜技术、原子力显微镜技术［２］和荧光原位杂交技术［３］等，它们能够提供直观的图像，为染色质相互作用的研究提供依据，但其图像的分辨率低，而且不能同时研究多个位点。分子相互作用图谱技术包括染色质构象捕获（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａ－ｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ， ３Ｃ）技术４Ｃ
［８，９］
［４，５］
Ｆｕｌｌｗｏｏｄ等［１１］２００９年１１月在《Ｎａｔｕｒｅ》上发表文章中提出了一项能够分析全基因组染色质相互作用的新技术——配对末端标签测序分析染色质相互作用（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＣｈＩＡ－ＰＥＴ）技术。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术是利用ＰＥＴ测序技术研究免疫沉淀后邻近式连接的ＤＮＡ片段，以得到染色质相互作用的技术。它灵敏，准确，对在全基因组范围内研究染色质相互作用具有重大意义，现简介如下。１． ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术的原理与方法
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术应用了ＰＥＴ测序技术的基本原理。ＰＥＴ测序技术的独特之处在于构建配对末端测序模板。从目的ＤＮＡ片段两个末端提取短标签并将它们配对构成一个ＰＥＴ，对ＰＥＴ进行高通量测序，利用标签序列定位目的ＤＮＡ片段在基因组中的位置。为了获得短标签，将目的ＤＮＡ片段两个末端分别与设计好的半连接子（ｌｉｎｋｅｒ）相连。半连接子为具有ＭｍｅＩ限制性内切酶识别位点的寡聚核苷酸序列，而ＭｍｅＩ限制性内切酶能够水解其识别位点下游１８／２０个碱基对。连接子连接后将ＤＮＡ片段两个末端配对，随后加入ＭｍｅＩ限制性内切酶，便可得到“标签－
和基于３Ｃ技术的ＣｈＩＰ－３Ｃ
［６，７］
、
、５Ｃ
［１０］
技术等，利用这些技术能够捕获染色质
点与点之间或多点之间的相互作用，但它们无法在全基因组范围内研究染色质的相互作用。总之，染色质相互作用的研究一直处于分辨率低和范围局限的状态。
收稿日期：２０１０－０９－３０
国家自然科学基金项目（８１０７０６５８）和河北省自然科学基金项目（Ｃ２００９００１０９２）资助
作者简介：高雅（１９８９－），女，本科生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｙａ１９８９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；齐锦生（１９６０－），男，博士，教授，Ｅ－ｍａｉｌ： ｑｉｊｉｎｓｈｅｎｇ７７７＠１６３．ｃｏｍ；栗彦宁（１９８１－），女，硕士，助教，通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｙａｎｎｉｎｇ１９８１＠１２６．ｃｏｍ
● 技术与方法
《生命的化学》２０１１年３１卷１期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２０１１，３１（１）
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连接子－标签（ｔａｇ－ｌｉｎｋｅｒ－ｔａｇ）”结构，即ＰＥＴ［１］（图１）。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术中，借助ＣｈＩＰ技术甲醛固定细免疫沉淀［图２（Ｂ）］，胞、超声断裂染色质［图２（Ａ）］、以获得与目的蛋白质因子结合的染色质片段。该染色质片段又被称为ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段，即ＰＥＴ测序技术中所需的目的ＤＮＡ片段。然后进行连接子连接［图２（Ｃ）］。为了在确定蛋白质因子结合位点的同时捕获结合位点间的相互作用，将同一蛋白质因子结合的ＤＮＡ片段末端先配对［图２（Ｄ）］再进行逆转交联［图２（Ｅ）］。随后进行ＭｍｅＩ限制性内切酶水解［图２（Ｆ）］和高通量测序。这样将产生两种类型的ＰＥＴ：自连接ＰＥＴ（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）和间连接ＰＥＴ（ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎＰＥＴ）。１．１ 自连接ＰＥＴ
如果一个ＰＥＴ的两个标签来自同一条染色质，基因组跨度在ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段范围（小于３ ｋｂ）内，方向相同且为相应单链连接，便被认为是一个ＣｈＩＰＤＮＡ片段中两个标签的自连接，称为自连接ＰＥＴ。自连接ＰＥＴ是确定蛋白质因子结合位点的基础。通过
构成自连接ＰＥＴ的两个标签可以确定其代表的ＣｈＩＰＤＮＡ片段，而该ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段包含蛋白质因子结合位点。利用峰检出程序（ｐｅａｋ－ｆｉｎｄｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ），把所有自连接ＰＥＴ两个标签代表的ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段映射（ｍａｐ）到参照基因组上，再将参照基因组每一区域被映射的次数转化为不同高度的峰，每一区域被映射的次数越多，峰越高。其每一高峰，都是大量的包含蛋白质因子结合位点的ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段重叠的区域，被认为是蛋白质因子结合位点。除高峰外，其它峰为弱的蛋白质因子结合位点或实验噪音（ｅｘｐｅｒｉ－ｍｅｎｔａｌ ｎｏｉｓｅ）。１．２ 间连接ＰＥＴ
如果一个ＰＥＴ不符合自连接ＰＥＴ的标准，其便为两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段间的连接，被称作间连接ＰＥＴ。间连接ＰＥＴ又分为三类：染色质内的间连接ＰＥＴ（ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）、染色质间的间连接ＰＥＴ（ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）和不同方向的间连接ＰＥＴ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＥＴ）。
其中，染色质内的间连接ＰＥＴ所占比例最大，是
图１ ＰＥＴ测序技术基本原理［１］
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● Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
图２ ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术基本原理
用于确定结合位点间相互作用的重要依据。它是两个标签来自同一条染色质但是基因组跨度大于３ ｋｂ的间连接ＰＥＴ。相距较远的两个标签之所以能够构成染色质内的间连接ＰＥＴ，是因为这两个标签代表的两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段由同一个蛋白质因子结合着，即这两个ＤＮＡ片段间存在相互作用。故染色质内的间连接ＰＥＴ可以用来确定结合位点间的相互作用。由于间连接ＰＥＴ的两个标签分别来自两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段，需先依据参照基因组，分别延长两个标签远离连接子的序列，从２０ ｂｐ延长至１５００ ｂｐ（大多数ＣｈＩＰＤＮＡ片段小于１５００ ｂｐ），将其延长为相应的ＣｈＩＰＤＮＡ片段。再利用峰检出程序，将所有延长后的ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段在参照基因组不同区域的映射次数用峰的高度表示。出现高峰的区域，为蛋白质因子结合位点，其应与自连接ＰＥＴ确定的蛋白质因子结合位点一致。若一个间连接ＰＥＴ群，同时满足以下两个条件：（１）每一间连接ＰＥＴ的两个标签所代表的两个ＣｈＩＰ ＤＮＡ片段，均包含一个高峰所对应的区域；（２）每一间连接ＰＥＴ映射的两个高峰区域是相同的，则为重叠的间连接ＰＥＴ群（图３）。重叠的间连接ＰＥＴ群可被用来确定结合位点间的相互作用。其映射的两个高峰区域，即蛋白质因子结合位点，存在相互作用。此外，染色质内的间连接ＰＥＴ的存在还可以
表明，蛋白质因子通过使染色质成环形成空间邻位结构以发挥其在复制、转录过程中的调节作用，从而推断结合位点间的相互作用是调节复制、转录的一个最基本的机制。
染色质间的间连接ＰＥＴ数量较少，表明染色质间存在弱的相互作用或为实验噪音；不同方向的间连接ＰＥＴ数量甚少，在正常情况下不应存在，被认为是实验噪音。此二者对于正确判定染色质相互作用缺乏价值。
为了评估非特异性嵌合连接对实验结果的影响，设计了具有标识作用的两种核苷酸序列半连接子：半连接子Ａ（ＣＧ）和半连接子Ｂ（ＡＴ）。连接子连接时将染色质均分成两份，一份加入半连接子Ａ，另一份加入半连接子Ｂ，除去多余的半连接子后，混匀，依次进行其后操作。由于结果中同时带有半连接子Ａ和半连接子Ｂ的ＰＥＴ是极少的，即非特异性嵌合连接是偶然的、互不重叠的，因此不会被误认为是相互作用。
综上所述，重叠的ＰＥＴ群被认为是蛋白质因子结合位点和结合位点间的相互作用，而甚少的ＰＥＴ则被认为是实验噪音。２． ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术的优、缺点
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ是全基因组范围内，无偏差的（ｕｎｂｉａｓｅｄ），
图３ 重叠的间连接ＰＥＴ群示意图
● 技术与方法
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从头（ｄｅ ｎｏｖｏ）分析染色质相互作用的技术。其具有以下优点：（１） ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术在全基因组范围内确定蛋白质因子结合位点的同时，能够确定结合位点间的相互作用。这也是其与仅能确定蛋白质因子结合位点，而不能确定结合位点间相互作用的ＣｈＩＰ－ＰＥＴ（ＣｈＩＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术的唯一区别。能否捕获结合位点间的相互作用，关键在于末端配对和逆转交联的顺序。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术先末端配对，再逆转交联，故能捕获由同一蛋白质因子结合的ＤＮＡ片段间的相互作用。而ＣｈＩＰ－ＰＥＴ技术先逆转交联，使原本被蛋白质因子结合的ＤＮＡ片段分散，只能产生自连接ＰＥＴ而不能产生间连接ＰＥＴ，所（２） ＣｈＩＡ－以无法捕获结合位点间的相互作用（图４）。
ＰＥＴ技术利用超声打断ＤＮＡ－蛋白质复合体，避免了利用限制性内切酶水解ＤＮＡ－蛋白质复合体引入的染色质随机连接， 因而有效减少了相互作用的噪音。（３） ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术借鉴了ＣｈＩＰ技术的优点棗利用特异性的抗体捕获与蛋白质因子结合的染色质，进而得到蛋白质因子结合位点和结合位点间的相互作用，避免了全基因组分析的复杂性。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术的发明，对于确定单一的功能性的转录因子结合位点是一个重大突破，然而要想确定蛋白质因子中每一种相互作用的蛋白质，尚需其他技术的介入。对于不依赖蛋白质因子的染色质相互作用，ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术不能检测。此外，ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术受众多因素影响，如：（１）所用抗体的质量，纯度和特异性。（２）ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术需要依赖峰检出程序将ＰＥＴ映射到参照基因组并检出高峰，不同峰检出程序定义高峰的标准等不同，故不同峰检出程序的使用会影响实验结果。３． 结语
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术已成为分析染色质相互作用的重
要方法，同时它标志着人类基因组通过折叠进行基因表达调控这一全新研究领域的开始。
随着参与ＤＮＡ复制、转录和染色质构象的蛋白质因子的发现及其抗体的使用，ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术将能确定更多染色质的相互作用。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术对于揭示细胞增殖、分化等过程基因调控机制是至关重要的。２０１０年，基于ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术原理，用于分析染色质相互作用的一整套软件已经研发并成为共享资源［１２］。通过相互作用图谱的绘制，可以更好地确定干预的特定目标，从而更好地了解和控制疾病。
参 考 文 献
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［２］Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ＳＨ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｎｄ－ｌｏｏｐ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ＴＲＦ２． Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ， ２００４， ９： ２０５－２１８［３］Ｏｓｂｏｒｎｅ ＣＳ ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ ｔｏ ｓｈａｒｅｄ
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ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃａｐｔｕｒｅ－ｏｎ－ｃｈｉｐ （４Ｃ）． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００６， ３８： １３４８－１３５４［９］Ｚｈａｏ Ｚ ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ （４Ｃ）
ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｏｆ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｒａ－ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００６， ３８：
图４ ＣｈＩＡ－ＰＥＴ技术与ＣｈＩＰ－ＰＥＴ技术的比较
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● Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
［１１］Ｆｕｌｌｗｏｏｄ ＭＪ ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａ－ｂｏｕｎｄ ｈｕｍａｎ
ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００９， ４６２： ５８－６４
［１２］Ｌｉ Ｇ ｅｔ ａｌ． ＣｈＩＡ－ＰＥＴ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ， ２０１０， １１： Ｒ２２
［１０］Ｄｏｓｔｉｅ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｐｙ
（５Ｃ）： ａ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ２００６， １６： １２９９－１３０９
The technique of ChIA-PET
GAO Ya 1, QI Jinsheng1, LI Yanning 2
1
2
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China;
Department of Molecular Biology, Hebei Key Lab of Laboratory Animal, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
Abstract Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (ChIA-PET) is a whole-genome approach for long-distance chromatin interaction analysis. It is a technique that incorporates chromatin immunoprecipitation, chromatin prox-imity ligation, paired-end tag, and next-generation sequencing to study gene expression and regulation in the genome’s three-dimensional folding and looping state. ChIA-PET has been applied to the identification of the estrogen-receptor-a-binding sitesand the interactions among the binding sites in human breast adenocarcinoma cells. With more protein factors being found andtheir antibodies being used, it will allow real-time and whole-genome identification of the DNA replication and transcription-involved protein factor-binding sites and the interactions among the binding sites, which has a great significance to reveal themechanisms of gene regulation and the pathogenesis of diseases.Key words ChIA-PET; whole-genome; chromatin interaction