中国热带医学2007年第7卷第5期 CHINA TROPICA L ME DICINE V ol 17N o 15M ay 2007
693
[论 著]
通用引物PCR 法在人乳头瘤病毒基因检测中的应用Ξ
郭洁1, 朱中元2, 王海波2, 王莉3
摘要:目的 建立通用引物PCR 法检测人乳头瘤病毒(HPV ) 基因, 探讨其在临床辅助诊断中的应用价值。 方法 收集400份标本, 其中男性119份, 女性281份。标本均使用通用引物对MY 11/09扩增HPV L1基因片段。同时扩增β球蛋白(β-globin ) 基因作为内对照。 结果 400份标本中,72份标本HPV L1基因阳性, 阳性率为2015%。20～岁组男女HPV 的检出率最高。患有性病(淋病、尖锐湿疣) 、不孕症、宫颈炎、, HPV L1基因的检出率分别为7510%、2510%、2114%、1911%。男性性病(、) 、不育症患者的HPV L1基因检出率分别为6617%、1617%、1316%、51。通用引物PCR 关键词:HPV; 中图分类号:R373 :1009-9727(2007) 5-693-02
Application of general primer PCR for detection of HPV L 1gene. G UO Jie , ZH U Zhong -yuan , W ANG Hai -bo ,et al. (1. Institute of T ropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of T ropical Agricultural Sciences , Haikou 571101, Hainan , P. R. China ; 2. Department of Laboratory Medicine of A ffiliated X inhua H ospital of Hainan Medical C ollege , Haikou 570311, ) Hainan , P. R. China ; 3. Nanjing P otomac Biotechnology C o Ltd , Nanjing 211800, Jiangsu P. R. China
Abstract :Objective T o establish the method for detection of L1gene of human papillamvirus (HPV ) with MY 11/09PCR and explore its application in clinical diagnosis. Methods T otally 400cases including 119male and 281female cases were collected. HPV L1and β-globin genes of all the samples were amplified simultaneously. R esults There 72samples out of 400were positive for HPV L1gene with a positive rate of 20. 5%.The highest positive rate for HPV L1gene was in the age group of 20years old. The positive rates of HPV L1gene in female patients with sexually transmitted diseases (g onorrhea , condyloma acuminata ) in fertility , cervitis , non -g onorrhea vaginitis were 75. 0%, 25. 0%, 21. 4%and 19. 1%.The positive rates of HPV L1gene in males with male sexually transmitted diseases (g onorrhea , condiloma acuminata ) colpitis , urethritis , prostatitis , in fertility , cervical and cuta 2neous warts were 66. 7%, 16. 7%, 13. 6%and 5. 7%. Conclusion HPV in fection is ass ociated with s ome genital diseases. G eneral primer MY 11/09PCR is sensitive and specific for detection of HPV L1gene.
K ey w ords :HPV ; G eneral Primer ; PCR
自1977年Zur Hausen 提出人乳头瘤病毒(Human papillo 2
mavirus ,HPV ) 可能是宫颈癌的致病因素以来, 越来越多的学者
通过血清学实验检测。目前临床上使用的PCR 法是敏感性高, 特异性好的一种方法。我们应用通用引物PCR 法对HPV
L1基因作了检测。结果报告如下。1 材料和方法111 材料
11111 标本来源 收集海南省农垦总局医院及海口市人民医
利用分子生物学的手段, 对HPV 基因结构, 致病机理等进行了一系列深入的研究。目前经过克隆鉴定的HPV 型别已经超过了100个[1]。HPV 是一种严格嗜上皮细胞的病毒,HPV 的感染与宫颈上皮内瘤变(CI N ) 有关。CI N 可分为3个等级:CI N Ⅰ、
CI N Ⅱ和CI N Ⅲ, 其中后两个等级的CI N 预示着宫颈癌的前期
院门诊病人的标本, 其中男性标本包括:前列腺液、精液、尿道分泌物。女性标本包括:白带、宫颈分泌物。其中, 收集海南省农垦总局医院的标本255份, 海口市人民医院标本145份, 共计400份标本, 其中女性标本281份, 男性标本119份。
11112 试剂 T aK aRa Ex T aq ,DNA maker2000购自宝生物(大
病变。现已证实HPV16/18型感染是宫颈癌的主要致病因素[2]。而其他HPV 型别也是许多生殖道疾病或生殖道癌症的致病原因之一。根据HPV 致癌的危险性把HPV 分为高危型和低危型。前者包括HPV16、18、31、45、33、35、39、51、52、56、58、
66、68、70型, 它们可以导致多种癌症。后者包括HPV6、11、42、43、44型, 它们可以导致非肿瘤性疾病如皮肤疣, 复发性呼吸道
连) 有限公司, HPV DNA 提取液购自上海复星公司。
11113 仪器 基因扩增仪T C -96/T/H 购自杭州大和公司。11114 引物合成 扩增HPV L1基因片段的通用引物对:
多发性乳头瘤病等。由于HPV 不能在体外复制, 而且也不能
Ξ基金项目:海南省自然科学基金资助项目(编号:30467)
作者单位:中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101; 21海南医学院附属新华医院检验科, 海南海口 ;31南京大渊生
物工程有限责任公司, 江苏南京 2100001
作者简介:郭洁(1981～) , 女, 硕士, 主要从事生物化学与病原微生物学研究. 通讯作者:朱中元, 电子信箱:zhu-zhongyuan @tom 1com
MY 09:5’-CG T CC M ARRGG AW ACTG AT C -3’MY 11:5’-G C MC AGGG WC AT AAY AATGG-3’M =A +C R =A +G W =A +T Y=C +T
214 HPV 基因性别间检出情况比较 男性检测119例, 阳性13例(1019%) , 女性检测281例阳性数59例(2110%) 。男性与
2
女性感染HPV 差异具有显著性(χ=5175, P
扩增β-globin 基因的引物对:
Hbb -f :5’-CCC AG AGG TT CTTTG AG T -3’
H BB -B :5’-biotin -T AC CCT G AT TTG G T C AAT -3’
男性更易感染HPV 。
215 男女性不同疾病患者HPV 基因的检出率比较, 男女性生
殖器常见疾病中均可检测出HPV 。见表2、3。
表2 男性HPV 基因疾病间检测差异临床诊断淋病、尖锐湿疣合计
检测例数
3242270119
引物均有大连宝生物公司合成并纯化。
112 方法
11211 HPV DNA 的提取 标本管中加入1ml
无菌生理盐水,
阳性数(%)
2(6617) 4(1617) 3(1316) 4(517) 13(1019)
充分摇匀, 吸取液体转至115ml 离心管中13000rpm 离心10min , μ弃上清液。沉淀直接加50l DNA 提取液充分混匀, 沸水浴μ15min 。13000rpm 离心5min , 取上清液2l 做PCR 反应。μ11212 PCR 扩增 反应体系为25l , 包括l ,10μμ冲液215l ,25mm ol/L l 11l , μμMY 091l , β-globin -f ) l , -globin 下游引物
(H BB -B ) 1μμμl , T aq 酶0125l , 去离子水12125l 。反应条件:94℃3min ;94℃45s , 55℃45s , 72℃60s ,35个循环;72℃10min 。
表3 女性HPV 基因疾病间检测差异临床诊断淋病、尖锐湿疣
不孕症宫颈炎非淋菌性阴道炎
合计
3 讨论
检测例数
[1**********]
阳性数(%)
3(7510) 2(2510) 25(2114) 29(1911) 59(2110)
μμ11213 PCR 产物电泳鉴定 取5l PCR 反应产物与1l 上样缓冲液混匀,1%琼脂糖凝胶电泳。紫外透射反射仪下观察结果, 并在G el Scan 凝胶图像成像仪上扫描。
2 结果
211 使用通用引物MY 11/09扩增HPV L1DNA , 同时扩增β-globin 基因的结果, 见图1。
目前对于HPV 的检验, 临床上使用的方法有PCR 法、杂交法和芯片法。PCR 法包括本文介绍的通用引物MY 11/09扩增法和荧光定量PCR 法, 杂交法包括第二代基因杂交捕获信号放大检测系统和PCR 反向杂交点印迹法。
本文介绍的MY 11/09是由Manos 等设计的一对通用引物对, 扩增HPV DNA 中L1开放阅读框架(L1ORF ) 中的序列, 片段长度为394～552bp (HPV166584/7035) , 一般在450bp 左右的位置上[3], 该对引物可扩增39种型别的HPV DNA 。同时本文又扩增了β-globin 基因, 因为人体细胞中都含有β-globin 基
图1 通用引物MY 11/09扩增HPV L1DNA PCR 图
M :DNA
Maker D L2000;1:典型阳性结果,450bp 条带为HPV L1基因产物,250bp 条带为β-globin 基因产物;2:弱阳性条带;3:阴性对照。
212 在400份标本中, 总共有72份标本的HPV L1基因为阳
因, 其大小为250bp (见图1) 。引入该基因, 可以确定模板的质量并验证扩增体系的可行性。由于标本的采集中是否采集到足够多的人体细胞; 病毒DNA 是否已经提取出来以及扩增的操作过程中是否出现纰漏; 均可对PCR 反应产生影响, 为了确保目的基因准确的扩增出来, 而且为了在出现问题时找准原因, 引入该基因是最敏感的。
通用引物MY 11/09扩增法相对于其他的方法的优势可总结为:
311 MY 11/09扩增法可以检测出39种型别的HPV , 而且这39
性, 总阳性率为18%。其中女性有59份标本的HPV L1基因为阳性, 阳性率为21%。男性有13份标本的HPV L1基因为阳性, 阳性率为11%。
213 不同性别和年龄组HPV L1基因检出情况比较, 见表1。
表1 不同性别和年龄组HPV L1基因检出情况比较年龄组
(岁)
20～30～
种型别中包括了HPV 的所有高危型别以及可致病的低危型别[3]。而使用荧光定量PCR 法, 所检测的型别一般为HPV16/
18两种型别[7]。使用杂交法目前也只能检测出23种型别的HPV [8]。所以该引物对可检出的HPV 型别最多。是对于HPV
检测例数49
5218119
男性
阳性数() 7(1413)
5(916) 1(516) 13(1019)
检测例数133
9949281
女性
阳性数() 31(2313)
19(1912) 9(1814) 59(2110)
流行病筛选的一种高效的方法。
312 MY 11/09方法施行起来简单可行, 只用一对引物就可以
≥40合计
了, 而杂交法和芯片法还需要设计各种型别的特异性探针来完成, 临床上检验结果的可靠性还有赖于探针的性能。
313 MY 11/09引物对和其他引物对一起施行嵌(下转第706页)
22
注:男性χ=1119, P >015; 女性χ=0183, P >015。
[4]代敏1幽门螺杆菌的分子分型及其分子流行病学研究[J]1中国公
型状况及其与胃十二指肠疾病关系的研究未能证实H p 菌株
vacA 基因型与胃十二指肠疾病的相关性[9], 提示单基因性状
共卫生,2002,18(9) :1037～10391
[5]Huseyin Saribasak ,Barik A Salih , Y oshio Y amaoka 1Analysis of Helicobac 2
ter pylori G enotypes and C orrelation with Clinical Outcome in Turkey[J]1Journal of Clinical M icrobiology , Apr 12004,42(4) :1648～16511[6]M ahaboob Ali , Aleem A K han , Santosh K T iwari , et al 1Ass ociation be 2
tween cag -pathogenicity island in Helicobacter pylori is olates from peptic ulcer , gastric carcinoma , and non -ulcer dyspepsia subjects with histologi 2cal changes[J]1W orld J G astroenterol , N ov 12005,11(43) :6815～68221[7]Shiho Y amazaki , Akiy o Y , T om oyuki Okuda , et al 1Distinct Di 2
vacA , enes of Helicobacter pylori Ass ociated Ulcer ]of Clinical M icrobiology , 2005,431
]Farhana K auser , Aleem A 1K han , M 1Abid Hussain , et al 1The cag
Pathogenicity Island of Helicobacter pylori Is Disrupted in the M ajority of Patient Is olates from Different Human P opulations [J]1Journal of Clinical M icrobiology , N ov 12004, 42(11) :5302～53081
[9]华晔, 张尤历, 杨大明1中国镇江地区幽门螺杆菌vacA 基因型状况
分型不适合于具有高度基因变异特点的幽门螺杆菌。因此, 选取vacA 和cagA 、cagE 、cagT 多个基因进行基因分型增加了分型成功的可能性。经过PCR 扩增,72株H p 中均得到了长度约
2750bp 的vacA 基因片段, 部分菌株中缺失了cagA 、cagE 和cagT
中的一个或几个片段。
将RAPD 技术与H p 毒性基因结合起来进行全面分析,
RAPD +vacA +cag -PAI 可以实现对H p 的有效分型(P =010067) , 其中, Ⅰ型为消化性溃疡优势基因型, Ⅲ型为慢性胃
炎优势基因型, Ⅱ型为非胃炎非溃疡优势基因型, 慢性胃炎组与非胃炎非溃疡组的差异尤为明显(P =010077) , 和致病岛基因可作为H p 基因分型手段[10]。因此, H p 基因型检测可以为H p 感染的预后判断提供参考依据, 对指导临床“因型适治”具有重要意义, 并对进一步探讨H p 致病机制也有重要价值[11]。基因分型是触及生命本质的分型方法, 它比传统的分型方法有质的飞跃, 具有强大的生命力和广阔的应用前景。参考文献:
[1]王蔚虹, 胡伏莲1随机扩增的多态性DNA 分析在幽门螺杆菌研究
及其与胃十二指肠疾病关系的研究[J]1江苏大学学报(医学版) ,
2005,15(4) :312～3181
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plified polym orphic DNA fingerprinting in genotyping clinical is olates of Helicobacter pylori[J]1W orld J G astroenterol , 2003,9(9) :2021～20241[11]Santosh K T iwari , Aleem A K han , K haja S Ahmed , et al 1P olymerase
chain reaction based analysis of the cytotoxin ass ociated gene pathogenicity island of Helicobacter pylori from saliva :An approach for rapid m olecular genotyping in relation to disease status[J]1Journal of G astroenterology and Hepatology , Oct 12005,20(10) :1560～15661
中的应用1见:胡伏莲, 周殿元主编, 幽门螺杆菌感染的基础与临床(修订版) [M]1北京:中国科学技术出版社,2002,307～3081
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大学学报,2000,32(6) :564～5651
[3]许迪, 叶嗣颖, 孔利佳, 等1幽门螺杆菌临床分离株的随机扩增多
收稿日期:2006-12-22
态性DNA 指纹图分析[J]1微生物学杂志,2004,24(6) :8～101
(上接第694页) 2006,28(3) :396～3981
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papillomavirus in a predominantly male cohort of ST D clinic patients[J].In 2ternational Journal of ST D &AIDS ,2001,12(8) :516～5231
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2006,13(4) :104～1061
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mavirus by E6nested multiplex PCR[J]1
Clin M icrobiol Reviews ,2004,42(7) :3176～31841
[7]郑莹, 楼江燕, 王和1多重实时PCR 对宫颈癌及癌前病变HPV -16
套PCR 法能进一步提高检测的敏感性和特异性。根据Lucia 的研究使用MY 09/11引物对和G P5+/G P6+引物对HPV DNA 实行嵌套PCR 方案(Nested Multiplex PCR ,NMPCR ) , 会比单用
MY 09/11引物对具有更高的敏感性和特异性[6]。
本文表明HPV 的感染与性别有关, 女性更易受到HPV 的攻击。该结果与S lavinsky 等的研究结果一致[4]。20～40岁的年龄段都是感染HPV 的高发年龄层。检测的三个年龄组检出率之间无显著性差异。男性除淋病、尖锐湿疣外,HPV 阳性率最高的是前列腺炎, 同样, 在女性标本中,HPV 阳性率最高的是宫颈炎。从细胞学检验中可以得到HPV 与CI N 的关系, 而且
CI N 的等级越高, 罹患癌症的几率也越高。
参考文献:
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理科学与临床分册,2000,20(2) :158～1591
[2]廖丹梅, 黄明春1HPV 感染与子宫颈癌的研究现状[J]1广西医学,
的应用[J]1健康大视野・医学分册, 2006, 7:33～341
收稿日期:2007-03-06
中国热带医学2007年第7卷第5期 CHINA TROPICA L ME DICINE V ol 17N o 15M ay 2007
693
[论 著]
通用引物PCR 法在人乳头瘤病毒基因检测中的应用Ξ
郭洁1, 朱中元2, 王海波2, 王莉3
摘要:目的 建立通用引物PCR 法检测人乳头瘤病毒(HPV ) 基因, 探讨其在临床辅助诊断中的应用价值。 方法 收集400份标本, 其中男性119份, 女性281份。标本均使用通用引物对MY 11/09扩增HPV L1基因片段。同时扩增β球蛋白(β-globin ) 基因作为内对照。 结果 400份标本中,72份标本HPV L1基因阳性, 阳性率为2015%。20～岁组男女HPV 的检出率最高。患有性病(淋病、尖锐湿疣) 、不孕症、宫颈炎、, HPV L1基因的检出率分别为7510%、2510%、2114%、1911%。男性性病(、) 、不育症患者的HPV L1基因检出率分别为6617%、1617%、1316%、51。通用引物PCR 关键词:HPV; 中图分类号:R373 :1009-9727(2007) 5-693-02
Application of general primer PCR for detection of HPV L 1gene. G UO Jie , ZH U Zhong -yuan , W ANG Hai -bo ,et al. (1. Institute of T ropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of T ropical Agricultural Sciences , Haikou 571101, Hainan , P. R. China ; 2. Department of Laboratory Medicine of A ffiliated X inhua H ospital of Hainan Medical C ollege , Haikou 570311, ) Hainan , P. R. China ; 3. Nanjing P otomac Biotechnology C o Ltd , Nanjing 211800, Jiangsu P. R. China
Abstract :Objective T o establish the method for detection of L1gene of human papillamvirus (HPV ) with MY 11/09PCR and explore its application in clinical diagnosis. Methods T otally 400cases including 119male and 281female cases were collected. HPV L1and β-globin genes of all the samples were amplified simultaneously. R esults There 72samples out of 400were positive for HPV L1gene with a positive rate of 20. 5%.The highest positive rate for HPV L1gene was in the age group of 20years old. The positive rates of HPV L1gene in female patients with sexually transmitted diseases (g onorrhea , condyloma acuminata ) in fertility , cervitis , non -g onorrhea vaginitis were 75. 0%, 25. 0%, 21. 4%and 19. 1%.The positive rates of HPV L1gene in males with male sexually transmitted diseases (g onorrhea , condiloma acuminata ) colpitis , urethritis , prostatitis , in fertility , cervical and cuta 2neous warts were 66. 7%, 16. 7%, 13. 6%and 5. 7%. Conclusion HPV in fection is ass ociated with s ome genital diseases. G eneral primer MY 11/09PCR is sensitive and specific for detection of HPV L1gene.
K ey w ords :HPV ; G eneral Primer ; PCR
自1977年Zur Hausen 提出人乳头瘤病毒(Human papillo 2
mavirus ,HPV ) 可能是宫颈癌的致病因素以来, 越来越多的学者
通过血清学实验检测。目前临床上使用的PCR 法是敏感性高, 特异性好的一种方法。我们应用通用引物PCR 法对HPV
L1基因作了检测。结果报告如下。1 材料和方法111 材料
11111 标本来源 收集海南省农垦总局医院及海口市人民医
利用分子生物学的手段, 对HPV 基因结构, 致病机理等进行了一系列深入的研究。目前经过克隆鉴定的HPV 型别已经超过了100个[1]。HPV 是一种严格嗜上皮细胞的病毒,HPV 的感染与宫颈上皮内瘤变(CI N ) 有关。CI N 可分为3个等级:CI N Ⅰ、
CI N Ⅱ和CI N Ⅲ, 其中后两个等级的CI N 预示着宫颈癌的前期
院门诊病人的标本, 其中男性标本包括:前列腺液、精液、尿道分泌物。女性标本包括:白带、宫颈分泌物。其中, 收集海南省农垦总局医院的标本255份, 海口市人民医院标本145份, 共计400份标本, 其中女性标本281份, 男性标本119份。
11112 试剂 T aK aRa Ex T aq ,DNA maker2000购自宝生物(大
病变。现已证实HPV16/18型感染是宫颈癌的主要致病因素[2]。而其他HPV 型别也是许多生殖道疾病或生殖道癌症的致病原因之一。根据HPV 致癌的危险性把HPV 分为高危型和低危型。前者包括HPV16、18、31、45、33、35、39、51、52、56、58、
66、68、70型, 它们可以导致多种癌症。后者包括HPV6、11、42、43、44型, 它们可以导致非肿瘤性疾病如皮肤疣, 复发性呼吸道
连) 有限公司, HPV DNA 提取液购自上海复星公司。
11113 仪器 基因扩增仪T C -96/T/H 购自杭州大和公司。11114 引物合成 扩增HPV L1基因片段的通用引物对:
多发性乳头瘤病等。由于HPV 不能在体外复制, 而且也不能
Ξ基金项目:海南省自然科学基金资助项目(编号:30467)
作者单位:中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101; 21海南医学院附属新华医院检验科, 海南海口 ;31南京大渊生
物工程有限责任公司, 江苏南京 2100001
作者简介:郭洁(1981～) , 女, 硕士, 主要从事生物化学与病原微生物学研究. 通讯作者:朱中元, 电子信箱:zhu-zhongyuan @tom 1com
MY 09:5’-CG T CC M ARRGG AW ACTG AT C -3’MY 11:5’-G C MC AGGG WC AT AAY AATGG-3’M =A +C R =A +G W =A +T Y=C +T
214 HPV 基因性别间检出情况比较 男性检测119例, 阳性13例(1019%) , 女性检测281例阳性数59例(2110%) 。男性与
2
女性感染HPV 差异具有显著性(χ=5175, P
扩增β-globin 基因的引物对:
Hbb -f :5’-CCC AG AGG TT CTTTG AG T -3’
H BB -B :5’-biotin -T AC CCT G AT TTG G T C AAT -3’
男性更易感染HPV 。
215 男女性不同疾病患者HPV 基因的检出率比较, 男女性生
殖器常见疾病中均可检测出HPV 。见表2、3。
表2 男性HPV 基因疾病间检测差异临床诊断淋病、尖锐湿疣合计
检测例数
3242270119
引物均有大连宝生物公司合成并纯化。
112 方法
11211 HPV DNA 的提取 标本管中加入1ml
无菌生理盐水,
阳性数(%)
2(6617) 4(1617) 3(1316) 4(517) 13(1019)
充分摇匀, 吸取液体转至115ml 离心管中13000rpm 离心10min , μ弃上清液。沉淀直接加50l DNA 提取液充分混匀, 沸水浴μ15min 。13000rpm 离心5min , 取上清液2l 做PCR 反应。μ11212 PCR 扩增 反应体系为25l , 包括l ,10μμ冲液215l ,25mm ol/L l 11l , μμMY 091l , β-globin -f ) l , -globin 下游引物
(H BB -B ) 1μμμl , T aq 酶0125l , 去离子水12125l 。反应条件:94℃3min ;94℃45s , 55℃45s , 72℃60s ,35个循环;72℃10min 。
表3 女性HPV 基因疾病间检测差异临床诊断淋病、尖锐湿疣
不孕症宫颈炎非淋菌性阴道炎
合计
3 讨论
检测例数
[1**********]
阳性数(%)
3(7510) 2(2510) 25(2114) 29(1911) 59(2110)
μμ11213 PCR 产物电泳鉴定 取5l PCR 反应产物与1l 上样缓冲液混匀,1%琼脂糖凝胶电泳。紫外透射反射仪下观察结果, 并在G el Scan 凝胶图像成像仪上扫描。
2 结果
211 使用通用引物MY 11/09扩增HPV L1DNA , 同时扩增β-globin 基因的结果, 见图1。
目前对于HPV 的检验, 临床上使用的方法有PCR 法、杂交法和芯片法。PCR 法包括本文介绍的通用引物MY 11/09扩增法和荧光定量PCR 法, 杂交法包括第二代基因杂交捕获信号放大检测系统和PCR 反向杂交点印迹法。
本文介绍的MY 11/09是由Manos 等设计的一对通用引物对, 扩增HPV DNA 中L1开放阅读框架(L1ORF ) 中的序列, 片段长度为394～552bp (HPV166584/7035) , 一般在450bp 左右的位置上[3], 该对引物可扩增39种型别的HPV DNA 。同时本文又扩增了β-globin 基因, 因为人体细胞中都含有β-globin 基
图1 通用引物MY 11/09扩增HPV L1DNA PCR 图
M :DNA
Maker D L2000;1:典型阳性结果,450bp 条带为HPV L1基因产物,250bp 条带为β-globin 基因产物;2:弱阳性条带;3:阴性对照。
212 在400份标本中, 总共有72份标本的HPV L1基因为阳
因, 其大小为250bp (见图1) 。引入该基因, 可以确定模板的质量并验证扩增体系的可行性。由于标本的采集中是否采集到足够多的人体细胞; 病毒DNA 是否已经提取出来以及扩增的操作过程中是否出现纰漏; 均可对PCR 反应产生影响, 为了确保目的基因准确的扩增出来, 而且为了在出现问题时找准原因, 引入该基因是最敏感的。
通用引物MY 11/09扩增法相对于其他的方法的优势可总结为:
311 MY 11/09扩增法可以检测出39种型别的HPV , 而且这39
性, 总阳性率为18%。其中女性有59份标本的HPV L1基因为阳性, 阳性率为21%。男性有13份标本的HPV L1基因为阳性, 阳性率为11%。
213 不同性别和年龄组HPV L1基因检出情况比较, 见表1。
表1 不同性别和年龄组HPV L1基因检出情况比较年龄组
(岁)
20～30～
种型别中包括了HPV 的所有高危型别以及可致病的低危型别[3]。而使用荧光定量PCR 法, 所检测的型别一般为HPV16/
18两种型别[7]。使用杂交法目前也只能检测出23种型别的HPV [8]。所以该引物对可检出的HPV 型别最多。是对于HPV
检测例数49
5218119
男性
阳性数() 7(1413)
5(916) 1(516) 13(1019)
检测例数133
9949281
女性
阳性数() 31(2313)
19(1912) 9(1814) 59(2110)
流行病筛选的一种高效的方法。
312 MY 11/09方法施行起来简单可行, 只用一对引物就可以
≥40合计
了, 而杂交法和芯片法还需要设计各种型别的特异性探针来完成, 临床上检验结果的可靠性还有赖于探针的性能。
313 MY 11/09引物对和其他引物对一起施行嵌(下转第706页)
22
注:男性χ=1119, P >015; 女性χ=0183, P >015。
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[9]华晔, 张尤历, 杨大明1中国镇江地区幽门螺杆菌vacA 基因型状况
分型不适合于具有高度基因变异特点的幽门螺杆菌。因此, 选取vacA 和cagA 、cagE 、cagT 多个基因进行基因分型增加了分型成功的可能性。经过PCR 扩增,72株H p 中均得到了长度约
2750bp 的vacA 基因片段, 部分菌株中缺失了cagA 、cagE 和cagT
中的一个或几个片段。
将RAPD 技术与H p 毒性基因结合起来进行全面分析,
RAPD +vacA +cag -PAI 可以实现对H p 的有效分型(P =010067) , 其中, Ⅰ型为消化性溃疡优势基因型, Ⅲ型为慢性胃
炎优势基因型, Ⅱ型为非胃炎非溃疡优势基因型, 慢性胃炎组与非胃炎非溃疡组的差异尤为明显(P =010077) , 和致病岛基因可作为H p 基因分型手段[10]。因此, H p 基因型检测可以为H p 感染的预后判断提供参考依据, 对指导临床“因型适治”具有重要意义, 并对进一步探讨H p 致病机制也有重要价值[11]。基因分型是触及生命本质的分型方法, 它比传统的分型方法有质的飞跃, 具有强大的生命力和广阔的应用前景。参考文献:
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MY 09/11引物对具有更高的敏感性和特异性[6]。
本文表明HPV 的感染与性别有关, 女性更易受到HPV 的攻击。该结果与S lavinsky 等的研究结果一致[4]。20～40岁的年龄段都是感染HPV 的高发年龄层。检测的三个年龄组检出率之间无显著性差异。男性除淋病、尖锐湿疣外,HPV 阳性率最高的是前列腺炎, 同样, 在女性标本中,HPV 阳性率最高的是宫颈炎。从细胞学检验中可以得到HPV 与CI N 的关系, 而且
CI N 的等级越高, 罹患癌症的几率也越高。
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收稿日期:2007-03-06