临床核酸类(DNA/RNA)检测试剂盒应用及推广
乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒（HCV ）、人类免疫缺陷综合症病毒(HIV)是对构成对人类构成严重威胁的主要病毒，乙肝是由HBV 引起的，全球约有3.5亿HBV 携带者，占总人口5%，其中亚洲和非洲所占比例较重。我国是病毒性肝炎的高发区，平均年发病率为120-140/10万。中国有1.2亿乙肝携带者，占全球的1/3，其中约1/4将发展为慢性肝病，部分患者可发展为肝硬化，甚至演变为肝癌。
丙型肝炎是由HCV 引起的，HCV 慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，据WHO 统计，全球HCV 感染率约为3%，估计全球有1.7亿人感染HCV ，是HBV 携带者人数的50%，HIV 感染者的5倍。HCV 携带者在我国较HBV （乙肝）携带者为少，在健康人群中抗HCV 阳性率为0.7%-3.1%。
艾滋病是由HIV 引起的, 截止2004年底，全球约有3940万人感染HIV/艾滋病，其中95%生活在发展中国家，到2010年前，世界126个中、低收入国家还将有4500万人感染艾滋病病毒，其中40%在亚洲和太平洋地区。2003年底，我国有48%的县报告了HIV/AIDS，现存HIV/AIDS约84万，全人群感染率为0.07%。由于HIV 、HCV 、HBV 有相似的传播途径，因此，共感染情况比较常见。
相关的临床或实验室诊断方法：目前，临床实验室诊断方法主要是酶联免疫检测（EIA ）。随着第三代乃至第四代EIA 试剂的出现，显著增加了筛查和检测的灵敏度，在很大程度上减少了血源传播病毒性疾病发生的概率。例如在美国，HCV 的感染率已从80年代的每年大约180000例，减少到现在的每年大约30000例。新感染的减少主要是由于在1990年引入了丙型肝炎病毒输血EIA 筛查以及此后几年EIA 试剂的更新换代。目前在美国，存在被当前的血清学检测方法所遗漏的HCV 阳性供体比例大约为1:103000，相应的比例在德国为1:200000，在英国为1:250000 。在发展中国家，被当前的血清学检测方法所遗漏的HIV 阳性供体比例约为1-2百万分之一，HBV 阳性供体的感染风险则最高，达十万分之一。我国也于九十年代初在全国血站中开始对献血员进行HCV 、HBV 、HIV 酶联免疫法检验，有力地控制了输血相关病毒的感染。EIA 方法具有简便、快速、成本低、适于大量样品同时检测的优点，但究其方法学而言，检测的是间接的免疫指标而非病毒本身，如HCV 抗体、HIV 抗体的筛查，检测的是机体在病毒入侵后产生的抗体，在时间上具有滞后性，即所谓的窗口期漏检，所以血清学诊断方法存在其固有的缺限。窗口期长短随机体免疫机能不同存在个体差异，有少数感染者感染后机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测线以下，甚至不产生抗体。一般认为，HCV 的窗口期约为66-82天，HBV 和HIV 的窗口期分别是大约
59天和22天。由于核酸检测(nucleic acid testing，NAT) 技术是迄今为止检测病毒的最灵敏的方法, 直接检测病毒核酸，能够检出标本中极微量的病毒核酸，在病毒感染后数天内即可检出病毒核酸，大大缩短了窗口期, 降低血源性病毒的传播危险。根据研究报道：NAT 可将HBV 、HCV 、HIV 感染的平均窗口期分别缩短25－30天(缩短窗口期42%－50%)、57－59天(72%－89%)和10－11天(50%)，并可检出上述其他原因而漏检的血液。
（一）荧光定量PCR 对HBV DNA检出的临床意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性
HBV DNA是直接反映HBV 复制状态及传染性的最佳指标。
2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价
随着现代医学的检测技术的发展，采用基因扩增技术（PCR ）检测对HBV-DNA 进行乙肝病毒DNA 定性和定量，结合二对半检测结果，对于机体乙肝病毒感染状态尤变异株发生和病人预后的评估更为科学。
3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量
直接检测血清中的HBV DNA是监控HBV 传染和观察抗病毒药物疗效的最可靠的方法。根据《2000年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的主要就是降低血清HBV DNA，诱导HBeAg 血清转换，使ALT 正常化，改善肝脏组织学病变，改善疾病症状、体征，提高生活质量，降低肝硬化和肝癌的发生率。同时血清的HBV DNA滴度的动态变化还可在临床上对用药的剂量、用药时间以及是否需要联合用药等提供参考。
4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断
HBsAg 在血清中的检出通常在乙肝病毒感染机体后的2-4月出现，平均为56天左右。而HBV DNA 的检出可以将该所谓“窗口期”提前6-15天，对于早期诊断和提高输血安全有着重要的意义。
5. 预测病情、判断预后
HBV DNA的定量检出对于病情的预测和预后的判断有着参考意义。通常HBV DNA持续阳性超过6个月的会转为慢性肝炎。抗-HBe 阳性患者血清HBV DNA 持续阳性常提示肝损严重。50%以上抗-HBe 阳性慢活肝病人，经平均4.5年发展为肝硬化，常与HBV DNA持续阳性有关。
6. 器官移植中的作用
肝脏器官移植是目前肝硬化晚期治疗的唯一方法，但有约86%以上既往HBsAg 携带者术后HBsAg 重新出现。检测HBV DNA可用于观察免疫受损患者的HBV 感染状况。肝移植后乙
肝主要是复发，再感染为次要因素。特别是移植前HBV 复制水平高者，复发和再感染的机率是要更高的。定量检测HBV DNA为肝移植术后的跟踪观测具有较好的临床价值。
7. 对阻断母婴传播的监测
联合应用高价免疫球蛋白和乙肝疫苗有效地阻断母婴传播，但仍有5-10%婴儿对疫苗呈低反应，荧光PCR 可对此进行监测，分析阻断失败的原因。
（二）荧光PCR 检测HCV RNA的临床意义
血清中的HCV RNA 是病毒复制和肝炎进程的确切标志。所以，检测血清HCV –RNA 已成为诊断HCV 病毒血症的“金标准”。HCV 感染者血清病毒滴度通常很低，常规分子杂交技术难以检出HCV-RNA 。近年发展的逆转录PCR （RT-PCR ），PCR 技术将HCV-RNA 检测的特异性和灵敏度大大提高，而荧光PCR 的出现又将此检测技术推向了另一台阶。
通过荧光PCR 的方法直接检测HCV-RNA ，大大提高HCV 感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”缩短平均56-60天，对“窗口期”感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一。另检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。以干扰素治疗为例，治疗前血清HCV RNA 水平低者通常应答好于血清HCV RNA 水平高者；基因1型的病人通常比基因2型(尤其是2a) 的应答差。治疗过程中，HCV RNA 的动态监测同时还可为临床上的用药剂量、时间等提供依据。
（三）荧光PCR 技术在HIV 检测中的应用
1．追踪HIV 的自然感染史
荧光PCR 可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒RNA ，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV 的传播性；同时还可用来监测长潜伏期的HIV 携带者，及时为人群的监控和安全提供信息。
2. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量
血液中胞外HIV RVA的量与抗HIV 药物治疗的进程及疗效有着十分直接的关系，目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒药物，HIV RNA 滴度的定量测定和动态变化可在临床上对用药的剂量、用药时间以及联合用药等提供指导参考。
3. HIV感染的早期诊断
由于在感染HIV 后到出现免疫反应之前有一段“窗口期”，可长达6周至6个月，而且无抗体产生期可能更长些。在此期间受感染者往往检测不到抗体，因此，血清阴性的人也可能已感染HIV 。PCR 法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提前10-15
天。对血清学试验结果不能确定者，也可通过PCR 作进一步分析和确诊。
4. 预测病情、判断预后
美国疾病控制中心（CDC ）发现HIV 感染及艾滋病的临床症状分类与血液中的细胞外HIV RNA 的数量呈线性关系，使HIV RNA的定量测定受到了异乎寻常的重视，同时病人在感染初期血清或血浆HIV RNA的数量与病程发展甚至存活年限有着某些联系。荧光定量PCR 的应用可为病情的预测和预后的判断提供一定依据。
5．新生儿HIV 感染的诊断
HIV 感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在，用抗体检测法通常为阳性。但实际上只有20%～60%的婴儿可在母亲的子宫里、在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV 。新生儿血清阳性者并不能说明是HIV 感染。因为母体HIV 抗体可持续大约15个月之久，在一般情况下，婴儿并不表现出HIV 感染的任何症状。病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法；HIV 特异IgM 抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的，在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV 抗原也十分困难。对这些婴儿用可靠的PCR 方法进行HIV 感染的早期诊断是十分重要的。另外, 婴幼儿被HIV 感染后病情发展较快，早期诊断对及时采取治疗措施，延缓阻止病情发展极为重要。因此荧光PCR 技术对被HIV 感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的。
6．输血安全性
荧光PCR 技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV ，对于缩短“窗口期”的贡献可使输血和血制品使用的安全性得到提高。
荧光PCR 技术检测对于那些疑有HIV 感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV 阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者也是非常有意义的。
上海诺伦生物医药技术有限公司针对上述三种病毒推出的试剂盒如下:
1. 乙肝病毒（HBV ）核酸扩增（PCR ）荧光定量检测试剂盒
2. 丙型肝炎病毒（HCV ）核酸扩增（PCR ）荧光定量检测试剂盒
3. 人免疫缺陷病毒（HIV ）核酸扩增（PCR ）荧光定量检测试剂盒
临床核酸类(DNA/RNA)检测试剂盒应用及推广
乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒（HCV ）、人类免疫缺陷综合症病毒(HIV)是对构成对人类构成严重威胁的主要病毒，乙肝是由HBV 引起的，全球约有3.5亿HBV 携带者，占总人口5%，其中亚洲和非洲所占比例较重。我国是病毒性肝炎的高发区，平均年发病率为120-140/10万。中国有1.2亿乙肝携带者，占全球的1/3，其中约1/4将发展为慢性肝病，部分患者可发展为肝硬化，甚至演变为肝癌。
丙型肝炎是由HCV 引起的，HCV 慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，据WHO 统计，全球HCV 感染率约为3%，估计全球有1.7亿人感染HCV ，是HBV 携带者人数的50%，HIV 感染者的5倍。HCV 携带者在我国较HBV （乙肝）携带者为少，在健康人群中抗HCV 阳性率为0.7%-3.1%。
艾滋病是由HIV 引起的, 截止2004年底，全球约有3940万人感染HIV/艾滋病，其中95%生活在发展中国家，到2010年前，世界126个中、低收入国家还将有4500万人感染艾滋病病毒，其中40%在亚洲和太平洋地区。2003年底，我国有48%的县报告了HIV/AIDS，现存HIV/AIDS约84万，全人群感染率为0.07%。由于HIV 、HCV 、HBV 有相似的传播途径，因此，共感染情况比较常见。
相关的临床或实验室诊断方法：目前，临床实验室诊断方法主要是酶联免疫检测（EIA ）。随着第三代乃至第四代EIA 试剂的出现，显著增加了筛查和检测的灵敏度，在很大程度上减少了血源传播病毒性疾病发生的概率。例如在美国，HCV 的感染率已从80年代的每年大约180000例，减少到现在的每年大约30000例。新感染的减少主要是由于在1990年引入了丙型肝炎病毒输血EIA 筛查以及此后几年EIA 试剂的更新换代。目前在美国，存在被当前的血清学检测方法所遗漏的HCV 阳性供体比例大约为1:103000，相应的比例在德国为1:200000，在英国为1:250000 。在发展中国家，被当前的血清学检测方法所遗漏的HIV 阳性供体比例约为1-2百万分之一，HBV 阳性供体的感染风险则最高，达十万分之一。我国也于九十年代初在全国血站中开始对献血员进行HCV 、HBV 、HIV 酶联免疫法检验，有力地控制了输血相关病毒的感染。EIA 方法具有简便、快速、成本低、适于大量样品同时检测的优点，但究其方法学而言，检测的是间接的免疫指标而非病毒本身，如HCV 抗体、HIV 抗体的筛查，检测的是机体在病毒入侵后产生的抗体，在时间上具有滞后性，即所谓的窗口期漏检，所以血清学诊断方法存在其固有的缺限。窗口期长短随机体免疫机能不同存在个体差异，有少数感染者感染后机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测线以下，甚至不产生抗体。一般认为，HCV 的窗口期约为66-82天，HBV 和HIV 的窗口期分别是大约
59天和22天。由于核酸检测(nucleic acid testing，NAT) 技术是迄今为止检测病毒的最灵敏的方法, 直接检测病毒核酸，能够检出标本中极微量的病毒核酸，在病毒感染后数天内即可检出病毒核酸，大大缩短了窗口期, 降低血源性病毒的传播危险。根据研究报道：NAT 可将HBV 、HCV 、HIV 感染的平均窗口期分别缩短25－30天(缩短窗口期42%－50%)、57－59天(72%－89%)和10－11天(50%)，并可检出上述其他原因而漏检的血液。
（一）荧光定量PCR 对HBV DNA检出的临床意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性
HBV DNA是直接反映HBV 复制状态及传染性的最佳指标。
2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价
随着现代医学的检测技术的发展，采用基因扩增技术（PCR ）检测对HBV-DNA 进行乙肝病毒DNA 定性和定量，结合二对半检测结果，对于机体乙肝病毒感染状态尤变异株发生和病人预后的评估更为科学。
3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量
直接检测血清中的HBV DNA是监控HBV 传染和观察抗病毒药物疗效的最可靠的方法。根据《2000年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的主要就是降低血清HBV DNA，诱导HBeAg 血清转换，使ALT 正常化，改善肝脏组织学病变，改善疾病症状、体征，提高生活质量，降低肝硬化和肝癌的发生率。同时血清的HBV DNA滴度的动态变化还可在临床上对用药的剂量、用药时间以及是否需要联合用药等提供参考。
4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断
HBsAg 在血清中的检出通常在乙肝病毒感染机体后的2-4月出现，平均为56天左右。而HBV DNA 的检出可以将该所谓“窗口期”提前6-15天，对于早期诊断和提高输血安全有着重要的意义。
5. 预测病情、判断预后
HBV DNA的定量检出对于病情的预测和预后的判断有着参考意义。通常HBV DNA持续阳性超过6个月的会转为慢性肝炎。抗-HBe 阳性患者血清HBV DNA 持续阳性常提示肝损严重。50%以上抗-HBe 阳性慢活肝病人，经平均4.5年发展为肝硬化，常与HBV DNA持续阳性有关。
6. 器官移植中的作用
肝脏器官移植是目前肝硬化晚期治疗的唯一方法，但有约86%以上既往HBsAg 携带者术后HBsAg 重新出现。检测HBV DNA可用于观察免疫受损患者的HBV 感染状况。肝移植后乙
肝主要是复发，再感染为次要因素。特别是移植前HBV 复制水平高者，复发和再感染的机率是要更高的。定量检测HBV DNA为肝移植术后的跟踪观测具有较好的临床价值。
7. 对阻断母婴传播的监测
联合应用高价免疫球蛋白和乙肝疫苗有效地阻断母婴传播，但仍有5-10%婴儿对疫苗呈低反应，荧光PCR 可对此进行监测，分析阻断失败的原因。
（二）荧光PCR 检测HCV RNA的临床意义
血清中的HCV RNA 是病毒复制和肝炎进程的确切标志。所以，检测血清HCV –RNA 已成为诊断HCV 病毒血症的“金标准”。HCV 感染者血清病毒滴度通常很低，常规分子杂交技术难以检出HCV-RNA 。近年发展的逆转录PCR （RT-PCR ），PCR 技术将HCV-RNA 检测的特异性和灵敏度大大提高，而荧光PCR 的出现又将此检测技术推向了另一台阶。
通过荧光PCR 的方法直接检测HCV-RNA ，大大提高HCV 感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”缩短平均56-60天，对“窗口期”感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一。另检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。以干扰素治疗为例，治疗前血清HCV RNA 水平低者通常应答好于血清HCV RNA 水平高者；基因1型的病人通常比基因2型(尤其是2a) 的应答差。治疗过程中，HCV RNA 的动态监测同时还可为临床上的用药剂量、时间等提供依据。
（三）荧光PCR 技术在HIV 检测中的应用
1．追踪HIV 的自然感染史
荧光PCR 可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒RNA ，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV 的传播性；同时还可用来监测长潜伏期的HIV 携带者，及时为人群的监控和安全提供信息。
2. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量
血液中胞外HIV RVA的量与抗HIV 药物治疗的进程及疗效有着十分直接的关系，目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒药物，HIV RNA 滴度的定量测定和动态变化可在临床上对用药的剂量、用药时间以及联合用药等提供指导参考。
3. HIV感染的早期诊断
由于在感染HIV 后到出现免疫反应之前有一段“窗口期”，可长达6周至6个月，而且无抗体产生期可能更长些。在此期间受感染者往往检测不到抗体，因此，血清阴性的人也可能已感染HIV 。PCR 法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提前10-15
天。对血清学试验结果不能确定者，也可通过PCR 作进一步分析和确诊。
4. 预测病情、判断预后
美国疾病控制中心（CDC ）发现HIV 感染及艾滋病的临床症状分类与血液中的细胞外HIV RNA 的数量呈线性关系，使HIV RNA的定量测定受到了异乎寻常的重视，同时病人在感染初期血清或血浆HIV RNA的数量与病程发展甚至存活年限有着某些联系。荧光定量PCR 的应用可为病情的预测和预后的判断提供一定依据。
5．新生儿HIV 感染的诊断
HIV 感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在，用抗体检测法通常为阳性。但实际上只有20%～60%的婴儿可在母亲的子宫里、在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV 。新生儿血清阳性者并不能说明是HIV 感染。因为母体HIV 抗体可持续大约15个月之久，在一般情况下，婴儿并不表现出HIV 感染的任何症状。病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法；HIV 特异IgM 抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的，在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV 抗原也十分困难。对这些婴儿用可靠的PCR 方法进行HIV 感染的早期诊断是十分重要的。另外, 婴幼儿被HIV 感染后病情发展较快，早期诊断对及时采取治疗措施，延缓阻止病情发展极为重要。因此荧光PCR 技术对被HIV 感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的。
6．输血安全性
荧光PCR 技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV ，对于缩短“窗口期”的贡献可使输血和血制品使用的安全性得到提高。
荧光PCR 技术检测对于那些疑有HIV 感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV 阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者也是非常有意义的。
上海诺伦生物医药技术有限公司针对上述三种病毒推出的试剂盒如下:
1. 乙肝病毒（HBV ）核酸扩增（PCR ）荧光定量检测试剂盒
2. 丙型肝炎病毒（HCV ）核酸扩增（PCR ）荧光定量检测试剂盒
3. 人免疫缺陷病毒（HIV ）核酸扩增（PCR ）荧光定量检测试剂盒