胰高血糖素受体拮抗剂筛选模型的建立_柳军

·1129·

中国临床药理学与治疗学

中国药理学会主办

CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501

E -m ail :ccpt96@21c n . co m 2006Oct ; 11(10) :1129-1132

◎研究原著◎

胰高血糖素受体拮抗剂筛选模型的建立

柳军, 张陆勇

中国药科大学新药筛选中心, 南京210038, 江苏

摘要　目的:研究胰高血糖素受体(GR ) 拮抗剂筛选模型的建立。方法:用离心法提取大鼠肝脏GR , 以I 标记的胰高血糖素(I -Gluca gon ) 为配体, 利用

放射性配体结合分析法, 检测配体与GR 的饱和性结合特征及14个化合物的竞争性结合能力。为进一步研究GR 拮抗剂的筛选方法, 将含有GR 目的基因Pmt 5. 1cDNA 短暂转染在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese ha mster ovary cell , CHO ) 上, 加入钙离子敏感性荧光染料(Fluo -3) , 通过检测荧光强度的改变, 筛选GR 拮抗剂。结果:竞争结合实验证明I -Glu -cagon 与GR 结合良好, 其平衡解离常数kd 值为9. 38nm ol ·L

-1

125

起共同维持血糖的正常水平, 打破胰高血糖素与胰岛素水平的平衡可导致多种疾病, 例如糖尿病和酮酸中毒。在胰高血糖素研究领域, 一个重要的研究方向是研究胰高血糖素受体(glucagon receptor , GR ) , 它是一具有7个跨膜序列的G -蛋白偶联受体, 主要在肝脏中表达。当胰高血糖素与GR 结合后, 转换信号到细胞内, 通过cAMP -PK 系统, 激活肝细胞的磷酸化酶, 加速糖原分解, 因此降低GR 的表达可以改善糖尿病人的高血糖

[1-3]

。

GR 拮抗剂可与胰高血糖素竞争受体, 从而阻断其作用。目前正在研究的一些作用较强的多肽类药物包括去组氨酸1[谷氨酸9]-胰高血糖素酰胺和去组氨酸, 去苯丙胺酸[谷氨酸9]-胰高血糖素酰胺等。但由于肽类药物的代谢不稳定性和不便于口服等因素, 促使人们寻找非肽类药物, 建立体外GR 拮抗剂筛选模型, 对于充分了解GR 的功能、阐明GR 与药物的相互作用以及影响GR 功能与表达的因素, 寻找和开发新型高效的GR 拮抗剂具有十分重要的意义。

筛选受体拮抗剂, 第一步要求化合物必须与受体结合, 本研究首先用放射性配基结合实验确定GR 结合剂, 能与受体结合的化合物有可能是GR 的激动剂, 也可能是拮抗剂。为了进一步筛选GR 的拮抗剂, 将含有GR 目的基因Pmt 5. 1cDNA 短暂转染在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell , C HO ) 上, 加入钙离子敏感性荧光染料(Fluo -3) 。Fluo -3的特性是可以与细胞内游离钙离子结合, 当用506nm 波长激发时, 其荧光强度是本身的40倍以上, 并且荧光强度与游离钙离子浓度成正比。本实验中用荧光强度的值来表征胞内钙离子相对浓度, 以实现化合物对GR 受体拮抗程度的筛选。当GR 受体被激动时, 细胞内钙离子浓度明显升高, 荧光强度也显著升高。当GR 被拮抗时, 细胞内钙离子浓度明显降低, 加入Fluo -3后, 荧光强度也明显降低。因此, 可以筛选GR

, 受体最大容量B max 为4. 33nm ol ·L

-1

;

14个化合物中有4个化合物(ZM102849、ZM102850、ZM102854和ZM102855) 与GR 结合良好。CHO 细胞表达GR 后, 对4个与GR 结合良好的化合物进行细胞水平实验, 结果表明化合物ZM102850可以引起荧光强度明显降低, 具有拮抗GR 的作用。结论:通过放射性配基结合实验方法和荧光强度检测法可以筛选GR 拮抗剂。

关键词　放射配基结合; 胰高血糖素受体; I -胰高血糖素; 拮抗剂; 中国仓鼠卵巢细胞; 转染中文分类号:R965. 1文献标识码:A

文章编号:1009-2501(2006) 10-1129-04

胰高血糖素是由29个氨基酸组成的直链多肽, 由胰岛细胞产生, 与胰岛素作用相反, 具有很强的促进糖原分解和糖异生作用。胰高血糖素与胰岛素一

125

2006-04-08收稿　2006-08-17修回

“十五”重大科技专项“863”计划资助项目(№2004AA234011) 柳军, 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向:药物筛选。Tel :025-85391057　E -mail :junl iu @cpu . edu . cn

张陆勇, 通讯作者, 男, 研究员, 博士生导师, 研究方向:药物筛选。Tel :025-83271500　E -mail :lyonzhang @s ohu . com

·1130·拮抗剂。

大小。

Chin J Clin Pharmacol Ther 2006Oct ; 11(10)

1　材料与方法

1. 1　动物　雄性SD 大鼠1只, 体重160～180g , 由中国药科大学动物中心提供[动物合格证号:SCXK (沪) 2003-2002], 用于提取GR 。

125

1. 2　试剂及仪器　碘标记胰高血糖素(I -Gluca -gon ) , 中国原子能科学研究院同位素研究所提供; Glucagon 、bacitracin 、aprotinin 、Fluo -3、Tris 、牛血清白蛋白购自Sigma 公司; sofast 转染试剂盒, 厦门太阳马生物工程有限公司; GR 拮抗剂Des -His1[Glu9]glucagon amide (GR -A ) 购自American Peptide 公司; Pmt 5. 1cDNA 由Cecilia G . Unson 博士(Rockefeller 大学) 馈赠; SAFIRE2(Tecan , Switzerland ) 多功能微孔板测读仪、高速冷冻离心机, SN -682型放射免疫γ计数器(东南大学放免中心) ; 受试化合物由中国药科大学新药筛选中心化合物库提供。1. 3　胰高血糖素受体的提取　取大鼠肝脏、称重、匀浆, 用缓冲液(含50mmol ·L Tris 、5mmol ·L

-1

MgCl 2、0. 01%bacitracin 和100KIU ·ml aprotinin pH 7. 4) 按1∶50稀释。在30000×g 、4℃下离心15min 。去掉上清, 再在相同条件下离心。去掉上清, 所得沉淀称重并用缓冲液重悬, 使终浓度为

-1

0. 5μg ·ml 。1. 4　放射性配基结合实验　放射结合实验在96孔

125

板中进行。每孔中加入I -胰高血糖素(5、25、50、100、150、200、500pmol ·L ) 和25μl 提取的GR , 空白孔中加入PBS , 总反应体积凑足100μl 。用移液器抽吸3次, 使混匀。盖上板盖, 避免干涸, 25℃,孵育2h 。加入100μl 冰冷的优化TE D 缓冲液(含

-1-1

10mmol ·L Tris -HCl 、1. 5mmol ·L EDTA 、5mmol ·L

-1

1. 6　细胞水平上进行胰高血糖素受体拮抗剂筛选的研究

1. 6. 1　细胞转染实验　CHO 细胞悬于DME M 培养液(10%小牛血清、青霉素、链霉素各100mg ·L ) 中, 长满50%～80%后, 胰蛋白酶(0. 1%) 消化细胞后, 在24孔板中, 每孔接种8×10～2×10个细胞, 18h 后, 采用梭华脂质体转染试剂, 用含有GR 目的基因Pmt 5. 1cDNA 转染C HO 细胞, 使细胞膜表面表达GR 。具体操作为:0. 6μg DNA 质粒稀释于30μl 不含血清和抗生素的DME M 中, 轻轻混匀。1～2μl 梭华脂质体转染试剂稀释于30μl D ME M 中轻轻摇匀, 再滴加到DNA 稀释液中, 一边滴加一边混匀。室温孵育15～20min 。60μl 脂质体转染试剂 DNA 复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀混合。放置37℃细胞培养箱中孵育48h 。

1. 6. 2　检测荧光强度　将转染的CHO 细胞用胰蛋白酶消化, 转入离心管内, 加入fluo -3(终浓度为

-1

5μmol ·L ) , 避光室温孵育1h , 离心去上清, 加PB S 洗3遍, 然后每管加入80μl PBS 和不同浓度胰高血糖素, 阳性对照管加入已知的GR 拮抗剂Des -His1

-4

[Glu9]glucagon a mide (GR -A ) , 使其终浓度为10mol ·L

-5

-1

; 样品管加入受试化合物, 使其终浓度为

-1

10mol ·L 。在激发波长506nm , 发射波长526nm

下, 测定荧光强度。

2　结果

2. 1　GR 与I -Glucagon 结合反应的饱和曲线　由图1、2可见,

125125

I -Glucagon 随其浓度增加与GR 结合

呈可饱和趋势。GR 的饱和性结合实验及Scatchard 分析得到GR 的饱和特征参数, 平衡解离常数Kd 值

-1-1

为9. 38nmol ·L ; 受体最大结合量B max 为4. 33nmol ·L (图1、2) 。

DTT , pH 7. 4) 中止反应, 吸出, 室温下用

200μl 的PB S 洗3次, 快速吸去并尽可能吸净孔中

液体。用γ计数器测量其放射活度。另制备非特异性结合孔和空白对照孔, 分别测定液闪计数。以Scatchard 法作图, 计算I -胰高血糖素与GR 的最大结合量(B max ) 和平衡解离常数(K d ) 。1. 5　测定各化合物与GR 的相对亲和力　96孔板

125

中, 每孔加入25μl 提取的GR 、I -胰高血糖素(终浓度为10mol ·L ) 和待测样品(终浓度为10

-1

mol ·L ) , 空白孔中加入PBS , 按上述方法检测放射活度。如果待测样品与GR 结合, 可干扰此反应, 就会引起相应cmp 值得改变, 其结合率(cpm 样品-与结合-7

-1

-5

125

图1　胰高血糖素受体(GR ) 与125I -Glucagon 结合反应的饱

±s , 6

中国临床药理学与治疗学2006Oct ; 11(10)

·1131·

结合, 但是并不能表现拮抗作用(图3) 。

图2　125I -Glucagon 对胰高血糖素受体(G R ) 的Scatchard 作图

图3　荧光值与Glucagon 浓度的量效图

2. 2　化合物与GR 的相对结合力　对14个合成化合物进行GR 竞争抑制实验, 以GR -A 为阳性对照化合物。结果表明, 在14个化合物中有4个化合物(ZM102849、ZM102850、ZM102854和ZM102855) 与GR 具有较强的结合率, 其结合率均大于60%(表1) 。

表1　14个合成化合物对胰高血糖素受体(GR ) 的结合率±s , n =6)

化合物Control

GR -A ZM102849ZM102850ZM102851ZM102852ZM102853ZM102854ZM102855ZM102856ZM102857ZM102858ZM102859ZM102860ZM102861ZM102862

结合率 %28. 4±17. 380. 2±16. 069. 0±25. 466. 2±32. 15. 6±1. 512. 3±9. 01. 2±0. 688. 8±27. 574. 6±15. 53. 7±0. 912. 6±2. 925. 5±5. 110. 5±2. 48. 2±3. 727. 5±8. 57. 4±1. 4

3　讨论

胰高血糖素受体是一种主要存在于肝脏细胞表

面的G 蛋白偶联受体, 主要通过与胰高血糖素结合, 将外部信号传至胞内引起细胞的生理变化, 促使糖原分解, 细胞释放葡萄糖增加

[4, 5]

。筛选GR 拮抗

剂首先要求受试化合物首先能与该受体结合, 其次能拮抗GR 与胰高血糖素的结合。

根据上述要求, 我们设计筛选模型的方法为:(1) 首先用放射配基结合实验确证化合物能与胰高

125

血糖素受体结合。在合适的反应体系中, I -Gluca -gon 可与GR 进行结合反应, 通过检测其cpm 值即可反应出与GR 结合的Glucagon 值, 如果筛选的样品也能与GR 结合, 干扰此反应, 就会引起相应的cpm 值变小, 其结合率(cpm 样品-cpm 空白 cpm 样品) 可间接地反映样品与GR 的结合力的大小。因此, 通过放射性配基结合实验可以初步确定与胰高血糖受体具有结合能力的化合物。(2) 对于GR 结合剂, 需要进一步考察化合物对GR 的拮抗能力。Fluo -3为一新型的高度特异性钙离子荧光指示剂, 可以灵敏反映细胞内游离钙离子浓度变化, Fluo -3进入细胞后, 与细胞内游离钙结合后, 其荧光强度是本身的40倍以上。本实验结果表明, 在CH O 细胞上表达GR 后, 当GR 拮抗剂与GR 结合后, 细胞内钙离子浓度显著降低, 荧光强度明显降低。根据此原理可以筛选GR 拮抗剂。本实验中用荧光强度的值来表征胞内钙离子相对浓度, 以实现化合物对GR 拮抗程度的筛选。

本研究用放射配基结合实验筛选GR 结合剂, 然后再在细胞水平上筛选GR 拮抗剂, 可以在第一步实验中过滤掉一些与GR 不结合的化合物, 后期再对有结合作用的化合物进行细胞水平筛选, 可以

2. 3　GR 拮抗剂的筛选　与空白对照组比较, 转染CHO 细胞加入胰高血糖素和fluo -3后, 可以引起荧光读数的显著升高, 并且升高的数值与加入胰高血糖素的浓度成正比。加入GR 拮抗剂(GR -A ) 后, 可引起荧光读数减少。对上述4个与GR 结合良好的化合物进行细胞水平实验, 发现ZM102850可以引起荧光强度减少, 其它3个化合物不能引起荧光强度

·1132·

提高筛选的GR 拮抗剂中标率, 减低实验成本, 进一步的高通量筛选正在开展中。

参考文献

1　Cypess AM , Unson C G , Wu CR , Sak mar TP . Two cytoplasmic

loops of the glucagon receptor are required to elecate cAMP or intracellular calcium [J ]. J Biol Chem , 1999; 274:19455-642　许治良, 高虹, 欧阳克清, 郑旭煦, 蔡昭皙, 胡应和. G 蛋

白偶联受体的功能测定和高通量药物筛选[J ]. 中国药理学通报, 2003; 19:1330-6

Chin J Clin Pharmacol Ther 2006Oct ; 11(10)

3　Albertin G . , Aragona F , Gottardo L , Malendowica LK , Nussdorfer

GG . Hu man pheochromocytomas , but not adrernal medulla , ex -press glucagons -receptor gene and possess an in vitro secretory response to glucagons [J ]. Peptides , 2001; 22:597-6004　Burstein ES , Spalding TA , Hill -Eubanks D , Brann MR . Struc -ture -function of muscarinic receptor coupling to G proteins [J ]. J

Biol Chem , 1995; 270:3141-6

5　Svoboda M , Portois L , M alaisse WJ . Glucose regulation of the ex -pression of the glucagons receptor gene [J ]. Mol Genet Metab ,

1999; 68:258-67

Setting up the screening model for glucagon receptor antagonists

LIU Jun , ZHANG Lu -yong

National Drug Sc reening Laboratory , Jiangsu Cente r for Drug Sc re ening , China Pharmaceutical Unive rsity , Nanjing

210038, Jiangsu , China

ABSTRAC T 　A IM :To set up the screening model for glucagon receptor (GR ) antagonist . METHODS :Rat liver glucagon receptor was prepar ed by centrifugation . The

125

binding characteristics of GR ligand (I -Glucagon ) were studied by radioligands binding in saturation binding ex -periments and followed by competition binding experim -ents with a variety of ne w synthesized compounds . In or -der to further study the method for scr eening GR antago -nists , GR cDNA was transiently transfected into CHO cells , and then fluo -3was loaded into the cells . The most important properties of fluo -3are an absorption spectrum

compatible with excitation at 506nm by ar gon -ion laser sources and very large fluorescence intensity increase in

response to Ca binding . In the studies , transfected CHO cells were loaded with both fluo -3and compounds ,

and then fluorescence intensity was measured to identify

　125

GR antagonists . RESULTS :The Kd and B max of I --1Glucagon to GR were 9. 38nmol ·L and 4. 33

-1

nmol ·L , respectively . Competition binding experiments revealed that compounds ZM102849, ZM102850, ZM102854and ZM102855displayed much higher affinity for the GR . When c ompound ZM102850was added to the transfected cells , the fluorescence intensity decreased . Therefore , compound ZM102850was identified as a glu -cagons antagonist . C ONCLUSION :Combining radioim -munoassay and measuring the fluorescence intensity meth -ods can be used to identify GR antagonists . KEY W ORDS 　radioimmunoassay ; gluca gon receptor ; 125

I -Glucagon ; anta gonist ; CHO cell ; transfection

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中国临床药理学与治疗学

中国药理学会主办

CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501

E -m ail :ccpt96@21c n . co m 2006Oct ; 11(10) :1129-1132

◎研究原著◎

胰高血糖素受体拮抗剂筛选模型的建立

柳军, 张陆勇

中国药科大学新药筛选中心, 南京210038, 江苏

摘要　目的:研究胰高血糖素受体(GR ) 拮抗剂筛选模型的建立。方法:用离心法提取大鼠肝脏GR , 以I 标记的胰高血糖素(I -Gluca gon ) 为配体, 利用

-1

125

[1-3]

。

, 受体最大容量B max 为4. 33nm ol ·L

-1

;

关键词　放射配基结合; 胰高血糖素受体; I -胰高血糖素; 拮抗剂; 中国仓鼠卵巢细胞; 转染中文分类号:R965. 1文献标识码:A

文章编号:1009-2501(2006) 10-1129-04

胰高血糖素是由29个氨基酸组成的直链多肽, 由胰岛细胞产生, 与胰岛素作用相反, 具有很强的促进糖原分解和糖异生作用。胰高血糖素与胰岛素一

125

2006-04-08收稿　2006-08-17修回

“十五”重大科技专项“863”计划资助项目(№2004AA234011) 柳军, 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向:药物筛选。Tel :025-85391057　E -mail :junl iu @cpu . edu . cn

张陆勇, 通讯作者, 男, 研究员, 博士生导师, 研究方向:药物筛选。Tel :025-83271500　E -mail :lyonzhang @s ohu . com

·1130·拮抗剂。

大小。

Chin J Clin Pharmacol Ther 2006Oct ; 11(10)

1　材料与方法

1. 1　动物　雄性SD 大鼠1只, 体重160～180g , 由中国药科大学动物中心提供[动物合格证号:SCXK (沪) 2003-2002], 用于提取GR 。

125

-1

0. 5μg ·ml 。1. 4　放射性配基结合实验　放射结合实验在96孔

125

-1-1

10mmol ·L Tris -HCl 、1. 5mmol ·L EDTA 、5mmol ·L

-1

1. 6　细胞水平上进行胰高血糖素受体拮抗剂筛选的研究

1. 6. 2　检测荧光强度　将转染的CHO 细胞用胰蛋白酶消化, 转入离心管内, 加入fluo -3(终浓度为

-1

5μmol ·L ) , 避光室温孵育1h , 离心去上清, 加PB S 洗3遍, 然后每管加入80μl PBS 和不同浓度胰高血糖素, 阳性对照管加入已知的GR 拮抗剂Des -His1

-4

[Glu9]glucagon a mide (GR -A ) , 使其终浓度为10mol ·L

-5

-1

; 样品管加入受试化合物, 使其终浓度为

-1

10mol ·L 。在激发波长506nm , 发射波长526nm

下, 测定荧光强度。

2　结果

2. 1　GR 与I -Glucagon 结合反应的饱和曲线　由图1、2可见,

125125

I -Glucagon 随其浓度增加与GR 结合

呈可饱和趋势。GR 的饱和性结合实验及Scatchard 分析得到GR 的饱和特征参数, 平衡解离常数Kd 值

-1-1

为9. 38nmol ·L ; 受体最大结合量B max 为4. 33nmol ·L (图1、2) 。

DTT , pH 7. 4) 中止反应, 吸出, 室温下用

200μl 的PB S 洗3次, 快速吸去并尽可能吸净孔中

125

中, 每孔加入25μl 提取的GR 、I -胰高血糖素(终浓度为10mol ·L ) 和待测样品(终浓度为10

-1

mol ·L ) , 空白孔中加入PBS , 按上述方法检测放射活度。如果待测样品与GR 结合, 可干扰此反应, 就会引起相应cmp 值得改变, 其结合率(cpm 样品-与结合-7

-1

-5

125

图1　胰高血糖素受体(GR ) 与125I -Glucagon 结合反应的饱

±s , 6

中国临床药理学与治疗学2006Oct ; 11(10)

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结合, 但是并不能表现拮抗作用(图3) 。

图2　125I -Glucagon 对胰高血糖素受体(G R ) 的Scatchard 作图

图3　荧光值与Glucagon 浓度的量效图

表1　14个合成化合物对胰高血糖素受体(GR ) 的结合率±s , n =6)

化合物Control

GR -A ZM102849ZM102850ZM102851ZM102852ZM102853ZM102854ZM102855ZM102856ZM102857ZM102858ZM102859ZM102860ZM102861ZM102862

结合率 %28. 4±17. 380. 2±16. 069. 0±25. 466. 2±32. 15. 6±1. 512. 3±9. 01. 2±0. 688. 8±27. 574. 6±15. 53. 7±0. 912. 6±2. 925. 5±5. 110. 5±2. 48. 2±3. 727. 5±8. 57. 4±1. 4

3　讨论

胰高血糖素受体是一种主要存在于肝脏细胞表

面的G 蛋白偶联受体, 主要通过与胰高血糖素结合, 将外部信号传至胞内引起细胞的生理变化, 促使糖原分解, 细胞释放葡萄糖增加

[4, 5]

。筛选GR 拮抗

剂首先要求受试化合物首先能与该受体结合, 其次能拮抗GR 与胰高血糖素的结合。

根据上述要求, 我们设计筛选模型的方法为:(1) 首先用放射配基结合实验确证化合物能与胰高

125

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提高筛选的GR 拮抗剂中标率, 减低实验成本, 进一步的高通量筛选正在开展中。

参考文献

1　Cypess AM , Unson C G , Wu CR , Sak mar TP . Two cytoplasmic

loops of the glucagon receptor are required to elecate cAMP or intracellular calcium [J ]. J Biol Chem , 1999; 274:19455-642　许治良, 高虹, 欧阳克清, 郑旭煦, 蔡昭皙, 胡应和. G 蛋

白偶联受体的功能测定和高通量药物筛选[J ]. 中国药理学通报, 2003; 19:1330-6

Chin J Clin Pharmacol Ther 2006Oct ; 11(10)

3　Albertin G . , Aragona F , Gottardo L , Malendowica LK , Nussdorfer

Biol Chem , 1995; 270:3141-6

5　Svoboda M , Portois L , M alaisse WJ . Glucose regulation of the ex -pression of the glucagons receptor gene [J ]. Mol Genet Metab ,

1999; 68:258-67

Setting up the screening model for glucagon receptor antagonists

LIU Jun , ZHANG Lu -yong

National Drug Sc reening Laboratory , Jiangsu Cente r for Drug Sc re ening , China Pharmaceutical Unive rsity , Nanjing

210038, Jiangsu , China

ABSTRAC T 　A IM :To set up the screening model for glucagon receptor (GR ) antagonist . METHODS :Rat liver glucagon receptor was prepar ed by centrifugation . The

125

compatible with excitation at 506nm by ar gon -ion laser sources and very large fluorescence intensity increase in

response to Ca binding . In the studies , transfected CHO cells were loaded with both fluo -3and compounds ,

and then fluorescence intensity was measured to identify

　125

GR antagonists . RESULTS :The Kd and B max of I --1Glucagon to GR were 9. 38nmol ·L and 4. 33

-1

I -Glucagon ; anta gonist ; CHO cell ; transfection

胰高血糖素受体拮抗剂筛选模型的建立_柳军

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