安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉ
Ａ加．Ｓｃｉ．２００９，３７（３４）：１６７６０—１６７６２
责任编辑熊章琴责任校对张士敏
酒精耐受型酿酒酵母菌的诱变筛选
易弋１，黎娅１，ｇ－ＪＬ平１，李凯２
（１．广西工学院，广西柳州５４５００６；２．四川省中医药高等专科学校，四川绵阳６２１０００）
摘要［目的］筛选酒精耐受型酿酒酵母茵最佳菌株。［方法］利用紫外线对酿酒酵母ＪＬ２００８进行诱变处理，并结合氯化三苯四氮唑（ｙｒｃ）进行筛选，对５株对酒精具有较强耐受性的突变株ＳＣｌ一ＳＣ５的酒精耐受性进行比较，选择出２株酒精耐受性较强的突变株（ＳＣｌ和ｓＣ５）进行酒精发酵，测定其生长速率和发酵性能。［结果］２株菌的酒精耐受能力远远高于出发茵株，均能在酒精体积分数为９％的培养基上生长；在含糖１５％的培养基中，ＳＣｌ的酒精发酵终浓度和发酵效率与原始菌株大致相同；在含糖３０％的培养基中，ＳＣｌ旮眚酒精发酵终浓度和发酵效率分别是１６．５４％和８５．２％，均高于原始菌株。［结论］突变株ＳＣｌ在含酒精培养基中的生长和在浓醪条件下的发
酵效果优于Ｊ【２００８，是一株极具潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。关键词酒精耐受性；酿酒酵母；诱变；筛选中图分类号Ｓ１８２
文献标识码Ａ
文章编号１
０５１７—６６１１（２００９）３４—１６７６０—０３
ＭｕｔａｔｉｏｎＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｔｒａｉｎｓｗｉｔｈＡｌｃｏｈｏｌＴｏｌｅｒａｎｃｅⅥＹｉｅｔａｌ（ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｌｉｕｚｈｏｕ．Ｇｕａｎｇｘｉ５４５００６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｆＯｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔｒａｔｅ
ｓｔｒａｉｎｓ
ｐｕｒｐｏｓｅｗａｓｔｏ
ｓｃｒｅｅｎｏｕｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｓｔｒａｉｎｏｕｔ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＬ２００８Ｗａｓｍｕｔａｔｅｄｂｙｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｗｏｔｉｏｎ．ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｗｉｔｈｔｈｅ
ｒａｙｓ
ａｎｄｓｃｒｅｅｎｅｄｗｉｔｈ
ｍ．Ｆｉｖｅ
ｆｒｏｍＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｍｕｔａｎｔ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｗｉｔｈａｌｃｏｈｏｌ
ｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈ
ｓｔｒｏｎｇ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＩＭｅｔｈｏｄｓ．
ａｌｃｏｈｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ（ＳＣｌ一ＳＣ５）ｗｅｒｅ
ｍｕｔａｎｔ
ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ
ａｌｃｏｈｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ（ＳＣｌａｎｄ
ｗｅｒｅ
ｏｎ
ＳＣ５）ｗｅｒｅ
ｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｅ５ｓｔｒａｉｎｓｆｏｒａｌｃｏｈｏｌｆｅｒｍｅｎｔａ—
ｔｗｏ
ａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆＳＣｌａｎｄＳＣ５ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．１Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅａｌｃｏｈｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅ
ｗｅｒｅ
ｓｔｒａｉｎｓｗａｓ
ｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎ．ａｎｄｔｈｅｙｂｏｔｈｃｏｕｌｄ
ｇｒｏｗ
ｔｈｅｍｅｄｉａｗｉ山９％ｅｔｈａｎｏｌｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｏｎｔｈｅｍｅｄｉａｗｉｔｈ１５％ｓｌｕ．
ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｓａｍｅａｓｔｈａｔｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎ．Ｏｎｔｈｅｍｅｄｉａ
ｗｅｒｅ
ｃｏｓｅ．ｔｈｅｆｉｎａｌｃｏｎｃｎ．ｏｆａｌｃｏｈｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＳＣｌｗｉｔｈ３０％ｇｌｕｃｏｓｅ．ｔ｝ｌｅｆｉｎａｌｃｏｎｃｎ．ｏｆａｌｃｏｈｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄ
ｗｅｒｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｅｔｔｅｒｔｈａｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＳＣｌ
ｏｎ
１６．５４％ａｎｄ８５．２％ｒｅｓｐ．ａｎｄｂｏｔｌｌｏｆｔｈｅｍ
ｏｎ
ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆ
Ａ１ｃｏｈｏｌ
ｏｒｉｇｌｎａＩｓｔｒａｉｎ．『Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ１ＳＣｌ
ａ
ｗａｓ
Ｊ汜００８
ｔｈｅｉｔｓ
ｇｒｏｗｔｈ
ｔｈｅｍｅｄｉａｗｉｔｈｅｔｈａｎｏｌａｎｄｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｍａｓｈ．ＳＯｉｔＷａｓＫｅｙｗｏｒｄｓ
ｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｔｒａｉｎｔｈａｔＷａｓａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｈｅａｖｙｍａｓｈ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
在酒精发酵过程中，酵母自身产生的酒精达到一定浓度时，会对酵母产生毒性，影响其生长、细胞发育以及酒精发酵
１０００
ｍｌ，调ｐＨ值为４．５，１１５℃灭菌２０ｍｉｎ。固体培养基在
液体培养基的基础上添加１．５％的琼脂。发酵培养基：葡萄
的能力…，进一步提高酒精浓度，发酵便会停止。各国的研究者从生物化学、分子生物学等角度进行了大量的研究，但
仍然未能清楚地了解酵母菌对酒精产生响应的分子机
糖１５０．０ｇ或３００．０ｇ，酵母膏５．０ｇ，蛋白胨５．０
ｇ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．６ｇ，ＣａＣｌ２０．６
ｇ，ＮＨ４Ｃ１１．０
０００
ｇ，加水溶解至１
ｍｌ，调
节ｐＨ值为４．５，１１５ｏＣ灭菌２０ｍｉｎ。ＴＹＣ（２，３，５一氯化三苯基
制旧‘３。。大量研究显示酵母菌酒精耐受机制是一个非常复杂的应答过程，有超过２００个的基因参与到了该应答当中【４１。在针对酵母菌酒精耐受性的研究中，虽然有部分结论还没有得到一致的意见，但绝大部分科学家都承认酒精通过对细胞膜产生作用，使细胞膜的透性、流动性、构造发生变
化，引起细胞膜的功能受到比较大的损伤。酵母细胞对此作出应答，使其细胞膜成分发生变化，以便能在有酒精存在的环境下生长∞１。
四氮唑）上层培养基∞１：葡萄糖０．５ｇ，琼脂１．５ｇ，加水至１００
ｒｎｌ，１１５℃灭菌２０ｍｉｎ，待冷却至５５℃左右时，加入
Ｔｒｃ５０ｍｇ。
１．２试验方法
１．２．１酒精耐受性酵母菌的诱变筛选。
１．２．１．１驯化。将原始菌在酒精体积分数为１％的液体培养基中培养３代后，转入酒精体积分数为２％的培养基中再培养３代，最后转入酒精体积分数为３％的培养基中培养３
目前，国内酒精厂的发酵醪酒精终体积分数一般在１０％
左右，与国外发酵醪酒精体积分数１３％以上还有很大的差距。随着高浓醪发酵等新技术的应用，发酵醪的酒精终体积
代，获得诱变的出发菌株。
１．２．１．２紫外线诱变剂量的确定。将稀释一定倍数的酵母菌涂布于含固体培养基的平板，在紫外灯（１０ｗ）下照射不
同时间后，３０屯暗培养４８ｈ，同时取一份样品不经紫外线照
分数将会大幅度提高，同时酒精工业生产对强化酵母酒精耐
受能力的要求也日趋明显。１材料与方法１．１试验材料
１．１．１菌种。酒精发酵高产Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
射。培养后通过菌落计数计算不同照射时间下的致死率，选择致死率７５％一８０％的照射时间作为诱变时间。
１．２．１．３突变株的筛选。①将稀释后的酵母菌涂布于酒精
ＪＬ２００８，
体积分数为４％的固体培养基上，根据“１．２．１．２”的试验结果进行紫外线诱变处理后，于３０℃下暗培养。待长出菌落后，倒入一层ＴＹＣ上层培养基，暗处继续培养２～３ｈ。结束后挑
由实验室从某酒精厂发酵醪液中分离并保藏。
１．１．２培养基。酵母培养基：葡萄糖５０．０ｇ，酵母膏８．５
ＮＨ４Ｃ１
１．０ｇ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．６ｇ，ＣａＣｌ２０．６
ｇ，
ｇ，加水溶解至
选５株长势好、红色较深的菌落备用。Ｔ他可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，由此可判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低ｏ“。②将①中挑选的５株菌培养后，分别涂布于酒精体积分数为６％的固体培养基上，同样进行ＴＴＣ筛选，选出５株长势好、发酵能力强的酵母菌。③将②中挑选的５株菌培养后，分别
基金项目
广西教育厅科研项目（２００７０７ＭＳ０６９）；广西工学院博士基金项目（院科博０８１８００１）。
作者简介另弋（１９７９一），男，四川都江堰人。博士，副教授，从事微生
物发酵与分子生物学方面的研究。
收稿日期２００９－０７－２８
３７卷３４期易弋等酒精耐受型酿酒酵母茵的诱变筛选
１６７６１
涂布于酒精体积分数为８％的固体培养基上，经Ｔｒｃ法筛选出５株酵母菌，编号为ＳＣｌ～ＳＣ５。
１．２．２突变株酒精耐受性比较。将筛选出的突变株与原始
２结果与分析
２．１不同紫外线照射时间下的致死率
由图１可知，随着
ｓ
紫外线照射时间的增加，酵母菌的死亡率也逐渐升高。１５
菌株分别置于酒精体积分数为３％、５％、７％、９％的培养基中培养，通过其生长情况来比较各菌株对酒精的耐受性。
１．２．３突变株的酒精发酵试验。通过“１．２．２”的比较结果，选择出２株酒精耐受性最强的突变株进行酒精发酵。发酵于３３℃进行，转速１００ｒ／ｍｉｎ，接种量１０％，每４ｈ测定１次ｃｏ：失重，失重小于０．１ｇ认为发酵结束。发酵结束后测定
以内紫外线的致死率基本为０；在３０～３５Ｓ，致死率从３９．４％突然上升至７１．２％，有了极大幅度的提高；５０Ｓ时，致死率达到了９５．６％。试验选取致死率在７５％～８０％的紫外照射时间，即４０Ｓ作为诱变处理的时间。
２．２突变株酒精耐受性比较按“１．２．１．３”所述方法，经紫外线诱变，并通过在含酒精的固体培养基上进行ＴＴｃ筛选，最终得到了５株对酒精具有较强耐受性的突变株ＳＣｌ～
酒精度和残糖，根据ＣＯ：失重计算发酵效率。
１ｇ
ＳＣ５。将这５株菌与原始菌株在酒精体积分数为３％、５％、７％、９％的培养基中分别培养，通过绘制其生长曲线比较几
株菌的酒精耐受能力。由图２可知，突变株的酒精耐受性远远高于原始菌株ＪＬ２００８。当培养基中酒精体积分数仅为３％
３
时，原始菌株的生长即被抑制到了突变株的５０％；在酒精体积分数为５％的培养基中，原始菌株几乎不能生长，而突变株
针
谣躐
的生长与在酒精体积分数为３％的培养基中相差不大，只有ＳＣ４受到了轻微的抑制；当培养基中酒精体积分数提高到７％时，突变株的生长均受到了一定的影响，其中ＳＣ３与ＳＣ４受到的影响较明显；当酒精体积分数提高到９％时，突变株的
生长受到了较严重的抑制，其中ＳＣｌ和ＳＣ５较另外３株菌表现出了更强的酒精耐受性。
己
Ｚ
Ｌ
Ｆｉｇ．１
１．
Ｌ
三
１．
管
ｎ
ａ
ｎ
ｎ
时间ＴｉｍｅⅣｈ
１．６
Ｌ
时间ＴｉｍｅⅣｈ
Ｏ
ｔ．２
ｎ８ｎ６
。
蕾ｏ．８
ｏ．４
：分
ｎ４
ｎ２
Ｏ
２
Ｏ
４６８１０１２１４２４６８１０１２１４
时间ＴｉｍｅⅣｈ
图２不同酒精浓度下酵母西的生长曲线
Ｆｉｇ．２
Ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ
时间ＴｉｍｅⅣｈ
ｃｕＨｅ
ｏｆｙｅａｓｔｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ’ｅｔｈａｎ０１
日本清酒酵母是一种酒精耐受能力很强的酵母菌【８１，该菌的生长被体积分数为１２％的酒精完全抑制，发酵能力达到
３００
发酵。在酵母菌酒精发酵过程中，每产生１分子的乙醇，就能
产生１分子的ＣＯ：，因此可以通过Ｃ０：的失熏程度来判断发酵速度的快慢。由图３可知，在发酵起始阶段，原始菌株产酒精的速度要明显快于突变株。３２ｈ后，ＳＣｌ的发酵速度逐渐加快，到发酵结束时ＳＣｌ和ＪＬ２００８的发酵酒精终体积分数以及发酵效率都相差不大（表１），不过ＳＣｌ的发酵时间要比ＪＬ２００８长了约４ｈ。而ＳＣ５的发酵能力要明显低予原始
ｇ／Ｌ酒精。在酒精体积分数为９％的培养基中，ＳＣｌ和
ＳＣ５的生长被抑制了约５０％，由此可见，这２株菌有着较强的酒精耐受性，因此选择ＳＣｌ和ＳＣ５进行下一步的酒精发酵试验。
２．３酒精发酵在５００ｍｌ三角瓶中加入２００ｍｌ含糖１５％的发酵培养基中，分别接入ＪＬ２００８、ＳＣｌ和ＳＣ５进行酒精
菌株，其发酵酒精终体积分数只相当于ｊｉ２００８的８５％。
１６７６２安徽农业科学
２００９正
曲１
专１
旦１
¨
量ｌ
鐾
ｇ
悯《
ｇ
时间ＴｉｍｅⅣｈ图３
ＣＯ：失重
Ｆｉｇ．３
Ｔｈｅｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓｏｆ
Ｃ０２
表１
１５％葡萄糖培养基中的发酵结果
ＴａｂＩｅｌ
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎ
ｔｈｅ
ｃｕＩｔｕｍｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ
！！丝型坚婴璧
菌株间∥ｈ
菌Ｓｔｒ株ａｉｎ
黼ｓ／Ｌ
ｌａｕｄｉｓｅＲｎ％ｏｒ嬲ｍｅｎｔａｔｉｉｔ∥ａｔｎｅｍｒ霉ｅＦ发瑟ｌｏｈｏ黝ｃ
分数∥％
“”“＋““
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
Ａｌｃｏｈｏ
ｖｏｌｕｍｅ…
ｓｕｇａｒ
ｔｉｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ
ｅｔｉｌｃｌ。ｎ。ｙ
考虑到突变株的酒精耐受能力要远远高于原始菌株，因此突变株在高酒精体积分数下的酒精发酵能力可能强于原始菌株，而图３中ＳＣｌ在３２ｈ后发酵速度的提高也说明了这点。对ＪＬ２００８、ＳＣｌ和ＳＣ５进行了浓醪（即使用含葡萄糖３０％的培养基）发酵，用以比较突变株与原始菌株的酒精发酵能力。
由表２可知，随着初始糖浓度的增加，发酵后的酒精终
体积分数有所提高。但发酵液中的残糖含量较高，ＳＣ５中残
糖含量高达４２．７ｇ／Ｌ，最低的ＳＣｌ也有２３．２ｇ／Ｌ，与之直接相关的则是３株菌的发酵效率都降低了５％～１５％。发酵时间也由先前的４８ｈ延长至６４ｈ。虽然３株菌在浓醪发酵中的发酵效果均不太理想，但可以看出ＳＣｌ的发酵效率要比原始菌株高出近１０．０％，发酵时间也缩短了４ｈ，这说明ＳＣｌ在
高体积分数酒精下的发酵能力确实高于ＪＬ２００８。
表２
３０％葡萄糖培养基中的发酵结果
Ｔａｂｌｅ２
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔ
ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｉｎ
ｔｈｅ
ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ
≯｜；｜
＂为舵锯甜甜Ｈ№坦＆｝舛侈％黔舛３讨论
酵母菌酒精耐受机制是一个非常复杂的应答过程。细胞膜中不饱和脂肪酸的含量及其链的长短…、细胞膜ＡＴＰ
酶的活性。１…、热休克蛋白的感应¨“、细胞内海藻糖的积累¨“、麦角固醇的合成【１３Ｊ等都被报道与酵母细胞的酒精耐
受性相关。而酵母菌发酵产酒精的能力则与葡萄糖代谢过程中的代谢酶如已糖激酶、磷酸果糖激酶等的活力相关，这二者之间没有必然的相关性。认为ＳＣ５在诱变过程中，紫外线不但诱发细胞产生了某种抵抗酒精的能力，同时也对葡萄糖代谢过程中的某些酶产生了影响，使得酶活降低，因此使ＳＣ５有着远远高于Ｊ１２００８的酒精耐受能力，而发酵能力却不
如ＪＬ２００８。
在评价酵母菌酒精耐受性中，主要有生长速率、存活率、
发酵性能３个指标¨“。通过生长速率和发酵性能这２个指标测定了ＪＬ２００８、ＳＣｌ和ＳＣ５的酒精耐受性。结果显示突变株ＳＣｌ在含酒精培养基中的生长要远远强于原始菌株ＪＬ２００８，在浓醪条件下的发酵效果也优于ＪＬ２００８，是一株非
常有潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。但是其较低的发
酵效率与较长的发酵时间都是不利于生产的，因此针对ＳＣｌ
还需进行更深入的选育工作，以期能得到更适于工业化应用的酵母菌株。参考文献
［１】ＰＩＮＡ
Ｃ，ＣＯＵＴＯ
ＪＡ，ＨＯＧＧＴ．Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇｅｔｈａｎｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｏｆ
Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙ－
ｃｅｓ
ａｎｄｎｏｎ－Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓｙｅａｓｔｓ
ｂｙｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈ－
ｎｏｌ
Ｌｅｔｔ，２００４．２６（１９）：１５２ｌ一１５２７．
『２１
ＰＩＰＥＲＰ
Ｗ．Ｔｈｅｈｅａｔｓｈｏｃｋａｎｄ
ｅｔｈａｎｏｌ
ｓｔｒｅｓｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆ
ｙｅａｓｔｅｘｈｉｂｉｔ
ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙａｎｄｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ
ｏｖｅｒｌａｐｌＪ１．ＦＥＭＳＭｉｅｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，１９９５，
１３４（２）：１２１—１２７．
『３１ＡＬＥＸＡＮＤＲＥ
Ｈ。ＡＮＳＡＮＡＹ＋ＧＡＬＥＯＴＥ
Ｖ，ＢＬＯＮＤＩＮ
Ｂ，ｅｔ
ａ１．Ｇ１０ｂａｌ
ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｈｏｒｔ．ｔｅｒｍｅｔｈａｎｏｌｓｔｒｅｓｓｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ—
ａｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２００１，４９８（１）：９８—１０３．
『４］ＫＵＢＯＴＡＳ，ＴＡＫＥＯＩ，ＫＵＭＥＫ，ｅｔａ１．肼ｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｏｎｅｅｌｌｇｒｏｗｔｈｏｆ
ｂｕｄｄｉｎｇ
ｙｅａｓｔ：ｇｅｎｅｓｔｈａｔ
ａｒｅ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｆｏｒ
ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ
ｉｎ
ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ
ｅｌｈａｎｏｌ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＷ．ＡＮＤＥＲＳＯＮＢｉｏｃｈｅｍ，２００４，６８（４）：９６８—９７２．
『５］ＢＡＩＷＡ，ＭＯＯ．ＹＯＵＮＧＭ．Ｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈ—
ｎｏｌｏｇｉｅｓｆｒｏｍｓｕｇａｒａｎｄｓｔａｒｃｈｆｅｅｄｓｔｏｃｋｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ，２００８，６（１）：
８９一１０５．
［６］毛志群，张伟，檀建新，等．高产酒精酵母的筛选及鉴定［Ｊ］．食品与发
酵工业，２．００３，２９（３）：５０—５３．
［７］王梅，张彭湃，帅桂兰，等．ＴＴＣ在黄酒酵母选育中的应用［Ｊ］．酿酒，
２００ｌ，２８（５）：６２—６４．
［８］王滨，张国政，路福平，等．酵母酒精耐｜生机制的研究进展［Ｊ］．天津轻
工业学院学报，２００１（１）：１８—２３．『９］ＭＩＳＨＲＡＰ．ＰＲＡＳＡＤＲ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎ
ｅｔｈａｎｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄ
ｆａｔｔｙ
ａｃｙｌ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｏｆＳａ２ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌＪ１．ＡｐｐｌＭｉｅｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎ—
ｏｌ，１９８９．３０：２９４—２９８．
【１０ＣＡＲＴＷＲＩＧＨＴ
ＣＰ，ＶＥＡＺＥＹＦ
Ｊ，ＲＯＳＥ
ＡＨ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆ
ｅｔｈａｎｏｌ
ｏｎａｅｔｉｖ—
ｉｔｖｏｆｔｈｅ
ｐｌａｓｍａ—ｍｅｍｂｒａｎｅ
ＡＴＰａｓｅｉｎ
ａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆｇｌｙｃｉｎｅｂｙ
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌＪ１．Ｊ
Ｇｅｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８７，１３３：８５７—８６５．［１１］ｓＡＮｃＨＥｚＹ，ＴＡｕｕＥＮＪ，ＢＯＲＫＯＶＩＣＨＫＡ，ｅｔａ１．Ｈｓｐｌ０４ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ
ｆｏｒｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｍａｎｙｆｏｒｍｓｏｆｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，１９９２，１１（６）：２３５７—
２３６４．
『１２１
ＭＡＮｓｕＲＥ
ＪＪＣ，ＰＡＮＥＫ
Ａ
Ｄ，ＣＲＯＷＥ
Ｌ
Ｍ，ｅｔ
ａ１．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅｉｎｈｉｂｉｔｓ
ｅｔｈａｎｏｌｅｆｆｅｃｔｓｏｎ
ｉｎｔａｃｔ
ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓａｎｄ
ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ
Ａｅｔａ．１９９４，１１９１（２）：３０９—３１６．
［１３］ＩＮＯＵＥＴ，ＩＥＦｌＪＪＩＨ，ＦＵＪＩＩ
Ｔ，ｅｔ
ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆａｇｅｎｅ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆ
ａｎ
ｅｔｈａｎ０１．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｏｆ
ｓａｋｅ
ｙｅａｓｔ
『Ｊ１．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０００，６４（２）：２２９—２３６．『１４１ＯＬＩＶＥＲＳＧ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ
ｅｔｈａｎｏｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｉｎ
ｙｅａｓｔｓ
Ｊ】．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．１９８４。１２：４２５—４２７．
安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉ
Ａ加．Ｓｃｉ．２００９，３７（３４）：１６７６０—１６７６２
责任编辑熊章琴责任校对张士敏
酒精耐受型酿酒酵母菌的诱变筛选
易弋１，黎娅１，ｇ－ＪＬ平１，李凯２
（１．广西工学院，广西柳州５４５００６；２．四川省中医药高等专科学校，四川绵阳６２１０００）
摘要［目的］筛选酒精耐受型酿酒酵母茵最佳菌株。［方法］利用紫外线对酿酒酵母ＪＬ２００８进行诱变处理，并结合氯化三苯四氮唑（ｙｒｃ）进行筛选，对５株对酒精具有较强耐受性的突变株ＳＣｌ一ＳＣ５的酒精耐受性进行比较，选择出２株酒精耐受性较强的突变株（ＳＣｌ和ｓＣ５）进行酒精发酵，测定其生长速率和发酵性能。［结果］２株菌的酒精耐受能力远远高于出发茵株，均能在酒精体积分数为９％的培养基上生长；在含糖１５％的培养基中，ＳＣｌ的酒精发酵终浓度和发酵效率与原始菌株大致相同；在含糖３０％的培养基中，ＳＣｌ旮眚酒精发酵终浓度和发酵效率分别是１６．５４％和８５．２％，均高于原始菌株。［结论］突变株ＳＣｌ在含酒精培养基中的生长和在浓醪条件下的发
酵效果优于Ｊ【２００８，是一株极具潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。关键词酒精耐受性；酿酒酵母；诱变；筛选中图分类号Ｓ１８２
文献标识码Ａ
文章编号１
０５１７—６６１１（２００９）３４—１６７６０—０３
ＭｕｔａｔｉｏｎＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｔｒａｉｎｓｗｉｔｈＡｌｃｏｈｏｌＴｏｌｅｒａｎｃｅⅥＹｉｅｔａｌ（ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｌｉｕｚｈｏｕ．Ｇｕａｎｇｘｉ５４５００６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｆＯｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔｒａｔｅ
ｓｔｒａｉｎｓ
ｐｕｒｐｏｓｅｗａｓｔｏ
ｓｃｒｅｅｎｏｕｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｓｔｒａｉｎｏｕｔ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＬ２００８Ｗａｓｍｕｔａｔｅｄｂｙｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｗｏｔｉｏｎ．ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｗｉｔｈｔｈｅ
ｒａｙｓ
ａｎｄｓｃｒｅｅｎｅｄｗｉｔｈ
ｍ．Ｆｉｖｅ
ｆｒｏｍＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｍｕｔａｎｔ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｗｉｔｈａｌｃｏｈｏｌ
ｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈ
ｓｔｒｏｎｇ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＩＭｅｔｈｏｄｓ．
ａｌｃｏｈｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ（ＳＣｌ一ＳＣ５）ｗｅｒｅ
ｍｕｔａｎｔ
ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ
ａｌｃｏｈｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ（ＳＣｌａｎｄ
ｗｅｒｅ
ｏｎ
ＳＣ５）ｗｅｒｅ
ｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｅ５ｓｔｒａｉｎｓｆｏｒａｌｃｏｈｏｌｆｅｒｍｅｎｔａ—
ｔｗｏ
ａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆＳＣｌａｎｄＳＣ５ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．１Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅａｌｃｏｈｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅ
ｗｅｒｅ
ｓｔｒａｉｎｓｗａｓ
ｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎ．ａｎｄｔｈｅｙｂｏｔｈｃｏｕｌｄ
ｇｒｏｗ
ｔｈｅｍｅｄｉａｗｉ山９％ｅｔｈａｎｏｌｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｏｎｔｈｅｍｅｄｉａｗｉｔｈ１５％ｓｌｕ．
ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｓａｍｅａｓｔｈａｔｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎ．Ｏｎｔｈｅｍｅｄｉａ
ｗｅｒｅ
ｃｏｓｅ．ｔｈｅｆｉｎａｌｃｏｎｃｎ．ｏｆａｌｃｏｈｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＳＣｌｗｉｔｈ３０％ｇｌｕｃｏｓｅ．ｔ｝ｌｅｆｉｎａｌｃｏｎｃｎ．ｏｆａｌｃｏｈｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄ
ｗｅｒｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｅｔｔｅｒｔｈａｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＳＣｌ
ｏｎ
１６．５４％ａｎｄ８５．２％ｒｅｓｐ．ａｎｄｂｏｔｌｌｏｆｔｈｅｍ
ｏｎ
ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆ
Ａ１ｃｏｈｏｌ
ｏｒｉｇｌｎａＩｓｔｒａｉｎ．『Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ１ＳＣｌ
ａ
ｗａｓ
Ｊ汜００８
ｔｈｅｉｔｓ
ｇｒｏｗｔｈ
ｔｈｅｍｅｄｉａｗｉｔｈｅｔｈａｎｏｌａｎｄｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｍａｓｈ．ＳＯｉｔＷａｓＫｅｙｗｏｒｄｓ
ｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｔｒａｉｎｔｈａｔＷａｓａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｈｅａｖｙｍａｓｈ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
在酒精发酵过程中，酵母自身产生的酒精达到一定浓度时，会对酵母产生毒性，影响其生长、细胞发育以及酒精发酵
１０００
ｍｌ，调ｐＨ值为４．５，１１５℃灭菌２０ｍｉｎ。固体培养基在
液体培养基的基础上添加１．５％的琼脂。发酵培养基：葡萄
的能力…，进一步提高酒精浓度，发酵便会停止。各国的研究者从生物化学、分子生物学等角度进行了大量的研究，但
仍然未能清楚地了解酵母菌对酒精产生响应的分子机
糖１５０．０ｇ或３００．０ｇ，酵母膏５．０ｇ，蛋白胨５．０
ｇ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．６ｇ，ＣａＣｌ２０．６
ｇ，ＮＨ４Ｃ１１．０
０００
ｇ，加水溶解至１
ｍｌ，调
节ｐＨ值为４．５，１１５ｏＣ灭菌２０ｍｉｎ。ＴＹＣ（２，３，５一氯化三苯基
制旧‘３。。大量研究显示酵母菌酒精耐受机制是一个非常复杂的应答过程，有超过２００个的基因参与到了该应答当中【４１。在针对酵母菌酒精耐受性的研究中，虽然有部分结论还没有得到一致的意见，但绝大部分科学家都承认酒精通过对细胞膜产生作用，使细胞膜的透性、流动性、构造发生变
化，引起细胞膜的功能受到比较大的损伤。酵母细胞对此作出应答，使其细胞膜成分发生变化，以便能在有酒精存在的环境下生长∞１。
四氮唑）上层培养基∞１：葡萄糖０．５ｇ，琼脂１．５ｇ，加水至１００
ｒｎｌ，１１５℃灭菌２０ｍｉｎ，待冷却至５５℃左右时，加入
Ｔｒｃ５０ｍｇ。
１．２试验方法
１．２．１酒精耐受性酵母菌的诱变筛选。
１．２．１．１驯化。将原始菌在酒精体积分数为１％的液体培养基中培养３代后，转入酒精体积分数为２％的培养基中再培养３代，最后转入酒精体积分数为３％的培养基中培养３
目前，国内酒精厂的发酵醪酒精终体积分数一般在１０％
左右，与国外发酵醪酒精体积分数１３％以上还有很大的差距。随着高浓醪发酵等新技术的应用，发酵醪的酒精终体积
代，获得诱变的出发菌株。
１．２．１．２紫外线诱变剂量的确定。将稀释一定倍数的酵母菌涂布于含固体培养基的平板，在紫外灯（１０ｗ）下照射不
同时间后，３０屯暗培养４８ｈ，同时取一份样品不经紫外线照
分数将会大幅度提高，同时酒精工业生产对强化酵母酒精耐
受能力的要求也日趋明显。１材料与方法１．１试验材料
１．１．１菌种。酒精发酵高产Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
射。培养后通过菌落计数计算不同照射时间下的致死率，选择致死率７５％一８０％的照射时间作为诱变时间。
１．２．１．３突变株的筛选。①将稀释后的酵母菌涂布于酒精
ＪＬ２００８，
体积分数为４％的固体培养基上，根据“１．２．１．２”的试验结果进行紫外线诱变处理后，于３０℃下暗培养。待长出菌落后，倒入一层ＴＹＣ上层培养基，暗处继续培养２～３ｈ。结束后挑
由实验室从某酒精厂发酵醪液中分离并保藏。
１．１．２培养基。酵母培养基：葡萄糖５０．０ｇ，酵母膏８．５
ＮＨ４Ｃ１
１．０ｇ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．６ｇ，ＣａＣｌ２０．６
ｇ，
ｇ，加水溶解至
选５株长势好、红色较深的菌落备用。Ｔ他可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，由此可判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低ｏ“。②将①中挑选的５株菌培养后，分别涂布于酒精体积分数为６％的固体培养基上，同样进行ＴＴＣ筛选，选出５株长势好、发酵能力强的酵母菌。③将②中挑选的５株菌培养后，分别
基金项目
广西教育厅科研项目（２００７０７ＭＳ０６９）；广西工学院博士基金项目（院科博０８１８００１）。
作者简介另弋（１９７９一），男，四川都江堰人。博士，副教授，从事微生
物发酵与分子生物学方面的研究。
收稿日期２００９－０７－２８
３７卷３４期易弋等酒精耐受型酿酒酵母茵的诱变筛选
１６７６１
涂布于酒精体积分数为８％的固体培养基上，经Ｔｒｃ法筛选出５株酵母菌，编号为ＳＣｌ～ＳＣ５。
１．２．２突变株酒精耐受性比较。将筛选出的突变株与原始
２结果与分析
２．１不同紫外线照射时间下的致死率
由图１可知，随着
ｓ
紫外线照射时间的增加，酵母菌的死亡率也逐渐升高。１５
菌株分别置于酒精体积分数为３％、５％、７％、９％的培养基中培养，通过其生长情况来比较各菌株对酒精的耐受性。
１．２．３突变株的酒精发酵试验。通过“１．２．２”的比较结果，选择出２株酒精耐受性最强的突变株进行酒精发酵。发酵于３３℃进行，转速１００ｒ／ｍｉｎ，接种量１０％，每４ｈ测定１次ｃｏ：失重，失重小于０．１ｇ认为发酵结束。发酵结束后测定
以内紫外线的致死率基本为０；在３０～３５Ｓ，致死率从３９．４％突然上升至７１．２％，有了极大幅度的提高；５０Ｓ时，致死率达到了９５．６％。试验选取致死率在７５％～８０％的紫外照射时间，即４０Ｓ作为诱变处理的时间。
２．２突变株酒精耐受性比较按“１．２．１．３”所述方法，经紫外线诱变，并通过在含酒精的固体培养基上进行ＴＴｃ筛选，最终得到了５株对酒精具有较强耐受性的突变株ＳＣｌ～
酒精度和残糖，根据ＣＯ：失重计算发酵效率。
１ｇ
ＳＣ５。将这５株菌与原始菌株在酒精体积分数为３％、５％、７％、９％的培养基中分别培养，通过绘制其生长曲线比较几
株菌的酒精耐受能力。由图２可知，突变株的酒精耐受性远远高于原始菌株ＪＬ２００８。当培养基中酒精体积分数仅为３％
３
时，原始菌株的生长即被抑制到了突变株的５０％；在酒精体积分数为５％的培养基中，原始菌株几乎不能生长，而突变株
针
谣躐
的生长与在酒精体积分数为３％的培养基中相差不大，只有ＳＣ４受到了轻微的抑制；当培养基中酒精体积分数提高到７％时，突变株的生长均受到了一定的影响，其中ＳＣ３与ＳＣ４受到的影响较明显；当酒精体积分数提高到９％时，突变株的
生长受到了较严重的抑制，其中ＳＣｌ和ＳＣ５较另外３株菌表现出了更强的酒精耐受性。
己
Ｚ
Ｌ
Ｆｉｇ．１
１．
Ｌ
三
１．
管
ｎ
ａ
ｎ
ｎ
时间ＴｉｍｅⅣｈ
１．６
Ｌ
时间ＴｉｍｅⅣｈ
Ｏ
ｔ．２
ｎ８ｎ６
。
蕾ｏ．８
ｏ．４
：分
ｎ４
ｎ２
Ｏ
２
Ｏ
４６８１０１２１４２４６８１０１２１４
时间ＴｉｍｅⅣｈ
图２不同酒精浓度下酵母西的生长曲线
Ｆｉｇ．２
Ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ
时间ＴｉｍｅⅣｈ
ｃｕＨｅ
ｏｆｙｅａｓｔｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ’ｅｔｈａｎ０１
日本清酒酵母是一种酒精耐受能力很强的酵母菌【８１，该菌的生长被体积分数为１２％的酒精完全抑制，发酵能力达到
３００
发酵。在酵母菌酒精发酵过程中，每产生１分子的乙醇，就能
产生１分子的ＣＯ：，因此可以通过Ｃ０：的失熏程度来判断发酵速度的快慢。由图３可知，在发酵起始阶段，原始菌株产酒精的速度要明显快于突变株。３２ｈ后，ＳＣｌ的发酵速度逐渐加快，到发酵结束时ＳＣｌ和ＪＬ２００８的发酵酒精终体积分数以及发酵效率都相差不大（表１），不过ＳＣｌ的发酵时间要比ＪＬ２００８长了约４ｈ。而ＳＣ５的发酵能力要明显低予原始
ｇ／Ｌ酒精。在酒精体积分数为９％的培养基中，ＳＣｌ和
ＳＣ５的生长被抑制了约５０％，由此可见，这２株菌有着较强的酒精耐受性，因此选择ＳＣｌ和ＳＣ５进行下一步的酒精发酵试验。
２．３酒精发酵在５００ｍｌ三角瓶中加入２００ｍｌ含糖１５％的发酵培养基中，分别接入ＪＬ２００８、ＳＣｌ和ＳＣ５进行酒精
菌株，其发酵酒精终体积分数只相当于ｊｉ２００８的８５％。
１６７６２安徽农业科学
２００９正
曲１
专１
旦１
¨
量ｌ
鐾
ｇ
悯《
ｇ
时间ＴｉｍｅⅣｈ图３
ＣＯ：失重
Ｆｉｇ．３
Ｔｈｅｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓｏｆ
Ｃ０２
表１
１５％葡萄糖培养基中的发酵结果
ＴａｂＩｅｌ
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎ
ｔｈｅ
ｃｕＩｔｕｍｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ
！！丝型坚婴璧
菌株间∥ｈ
菌Ｓｔｒ株ａｉｎ
黼ｓ／Ｌ
ｌａｕｄｉｓｅＲｎ％ｏｒ嬲ｍｅｎｔａｔｉｉｔ∥ａｔｎｅｍｒ霉ｅＦ发瑟ｌｏｈｏ黝ｃ
分数∥％
“”“＋““
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
Ａｌｃｏｈｏ
ｖｏｌｕｍｅ…
ｓｕｇａｒ
ｔｉｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ
ｅｔｉｌｃｌ。ｎ。ｙ
考虑到突变株的酒精耐受能力要远远高于原始菌株，因此突变株在高酒精体积分数下的酒精发酵能力可能强于原始菌株，而图３中ＳＣｌ在３２ｈ后发酵速度的提高也说明了这点。对ＪＬ２００８、ＳＣｌ和ＳＣ５进行了浓醪（即使用含葡萄糖３０％的培养基）发酵，用以比较突变株与原始菌株的酒精发酵能力。
由表２可知，随着初始糖浓度的增加，发酵后的酒精终
体积分数有所提高。但发酵液中的残糖含量较高，ＳＣ５中残
糖含量高达４２．７ｇ／Ｌ，最低的ＳＣｌ也有２３．２ｇ／Ｌ，与之直接相关的则是３株菌的发酵效率都降低了５％～１５％。发酵时间也由先前的４８ｈ延长至６４ｈ。虽然３株菌在浓醪发酵中的发酵效果均不太理想，但可以看出ＳＣｌ的发酵效率要比原始菌株高出近１０．０％，发酵时间也缩短了４ｈ，这说明ＳＣｌ在
高体积分数酒精下的发酵能力确实高于ＪＬ２００８。
表２
３０％葡萄糖培养基中的发酵结果
Ｔａｂｌｅ２
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔ
ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｉｎ
ｔｈｅ
ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ
≯｜；｜
＂为舵锯甜甜Ｈ№坦＆｝舛侈％黔舛３讨论
酵母菌酒精耐受机制是一个非常复杂的应答过程。细胞膜中不饱和脂肪酸的含量及其链的长短…、细胞膜ＡＴＰ
酶的活性。１…、热休克蛋白的感应¨“、细胞内海藻糖的积累¨“、麦角固醇的合成【１３Ｊ等都被报道与酵母细胞的酒精耐
受性相关。而酵母菌发酵产酒精的能力则与葡萄糖代谢过程中的代谢酶如已糖激酶、磷酸果糖激酶等的活力相关，这二者之间没有必然的相关性。认为ＳＣ５在诱变过程中，紫外线不但诱发细胞产生了某种抵抗酒精的能力，同时也对葡萄糖代谢过程中的某些酶产生了影响，使得酶活降低，因此使ＳＣ５有着远远高于Ｊ１２００８的酒精耐受能力，而发酵能力却不
如ＪＬ２００８。
在评价酵母菌酒精耐受性中，主要有生长速率、存活率、
发酵性能３个指标¨“。通过生长速率和发酵性能这２个指标测定了ＪＬ２００８、ＳＣｌ和ＳＣ５的酒精耐受性。结果显示突变株ＳＣｌ在含酒精培养基中的生长要远远强于原始菌株ＪＬ２００８，在浓醪条件下的发酵效果也优于ＪＬ２００８，是一株非
常有潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。但是其较低的发
酵效率与较长的发酵时间都是不利于生产的，因此针对ＳＣｌ
还需进行更深入的选育工作，以期能得到更适于工业化应用的酵母菌株。参考文献
［１】ＰＩＮＡ
Ｃ，ＣＯＵＴＯ
ＪＡ，ＨＯＧＧＴ．Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇｅｔｈａｎｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｏｆ
Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙ－
ｃｅｓ
ａｎｄｎｏｎ－Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓｙｅａｓｔｓ
ｂｙｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈ－
ｎｏｌ
Ｌｅｔｔ，２００４．２６（１９）：１５２ｌ一１５２７．
『２１
ＰＩＰＥＲＰ
Ｗ．Ｔｈｅｈｅａｔｓｈｏｃｋａｎｄ
ｅｔｈａｎｏｌ
ｓｔｒｅｓｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆ
ｙｅａｓｔｅｘｈｉｂｉｔ
ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙａｎｄｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ
ｏｖｅｒｌａｐｌＪ１．ＦＥＭＳＭｉｅｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，１９９５，
１３４（２）：１２１—１２７．
『３１ＡＬＥＸＡＮＤＲＥ
Ｈ。ＡＮＳＡＮＡＹ＋ＧＡＬＥＯＴＥ
Ｖ，ＢＬＯＮＤＩＮ
Ｂ，ｅｔ
ａ１．Ｇ１０ｂａｌ
ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｈｏｒｔ．ｔｅｒｍｅｔｈａｎｏｌｓｔｒｅｓｓｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ—
ａｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２００１，４９８（１）：９８—１０３．
『４］ＫＵＢＯＴＡＳ，ＴＡＫＥＯＩ，ＫＵＭＥＫ，ｅｔａ１．肼ｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｏｎｅｅｌｌｇｒｏｗｔｈｏｆ
ｂｕｄｄｉｎｇ
ｙｅａｓｔ：ｇｅｎｅｓｔｈａｔ
ａｒｅ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｆｏｒ
ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ
ｉｎ
ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ
ｅｌｈａｎｏｌ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＷ．ＡＮＤＥＲＳＯＮＢｉｏｃｈｅｍ，２００４，６８（４）：９６８—９７２．
『５］ＢＡＩＷＡ，ＭＯＯ．ＹＯＵＮＧＭ．Ｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈ—
ｎｏｌｏｇｉｅｓｆｒｏｍｓｕｇａｒａｎｄｓｔａｒｃｈｆｅｅｄｓｔｏｃｋｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ，２００８，６（１）：
８９一１０５．
［６］毛志群，张伟，檀建新，等．高产酒精酵母的筛选及鉴定［Ｊ］．食品与发
酵工业，２．００３，２９（３）：５０—５３．
［７］王梅，张彭湃，帅桂兰，等．ＴＴＣ在黄酒酵母选育中的应用［Ｊ］．酿酒，
２００ｌ，２８（５）：６２—６４．
［８］王滨，张国政，路福平，等．酵母酒精耐｜生机制的研究进展［Ｊ］．天津轻
工业学院学报，２００１（１）：１８—２３．『９］ＭＩＳＨＲＡＰ．ＰＲＡＳＡＤＲ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎ
ｅｔｈａｎｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄ
ｆａｔｔｙ
ａｃｙｌ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｏｆＳａ２ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌＪ１．ＡｐｐｌＭｉｅｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎ—
ｏｌ，１９８９．３０：２９４—２９８．
【１０ＣＡＲＴＷＲＩＧＨＴ
ＣＰ，ＶＥＡＺＥＹＦ
Ｊ，ＲＯＳＥ
ＡＨ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆ
ｅｔｈａｎｏｌ
ｏｎａｅｔｉｖ—
ｉｔｖｏｆｔｈｅ
ｐｌａｓｍａ—ｍｅｍｂｒａｎｅ
ＡＴＰａｓｅｉｎ
ａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆｇｌｙｃｉｎｅｂｙ
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌＪ１．Ｊ
Ｇｅｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８７，１３３：８５７—８６５．［１１］ｓＡＮｃＨＥｚＹ，ＴＡｕｕＥＮＪ，ＢＯＲＫＯＶＩＣＨＫＡ，ｅｔａ１．Ｈｓｐｌ０４ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ
ｆｏｒｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｍａｎｙｆｏｒｍｓｏｆｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，１９９２，１１（６）：２３５７—
２３６４．
『１２１
ＭＡＮｓｕＲＥ
ＪＪＣ，ＰＡＮＥＫ
Ａ
Ｄ，ＣＲＯＷＥ
Ｌ
Ｍ，ｅｔ
ａ１．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅｉｎｈｉｂｉｔｓ
ｅｔｈａｎｏｌｅｆｆｅｃｔｓｏｎ
ｉｎｔａｃｔ
ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓａｎｄ
ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ
Ａｅｔａ．１９９４，１１９１（２）：３０９—３１６．
［１３］ＩＮＯＵＥＴ，ＩＥＦｌＪＪＩＨ，ＦＵＪＩＩ
Ｔ，ｅｔ
ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆａｇｅｎｅ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆ
ａｎ
ｅｔｈａｎ０１．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｏｆ
ｓａｋｅ
ｙｅａｓｔ
『Ｊ１．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０００，６４（２）：２２９—２３６．『１４１ＯＬＩＶＥＲＳＧ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ
ｅｔｈａｎｏｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｉｎ
ｙｅａｓｔｓ
Ｊ】．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．１９８４。１２：４２５—４２７．