红茶.绿茶.乌龙茶活性成分

62 2009, Vol. 30, No. 03

食品科学※基础研究

红茶、绿茶、乌龙茶活性成分

抗氧化性研究

陈金娥,丰慧君,张海容*

(忻州师范学院生化分析技术研究所,山西 忻州 034000)

摘 要:目的与方法:通过醇提得到各种茶多酚提取液,酒石酸亚铁法测定了多酚的含量;水提得到各种茶多糖提取液,用硫酸-苯酚法测定其中多糖的含量。通过DPPH ·法、水杨酸法及邻苯三酚法测定不同茶叶中多酚、多糖含量对自由基的清除作用的影响,对比研究八种茶叶的抗氧化能力。结果:不同茶叶中多糖的含量从2.19%增大到2.89% (半发酵乌龙茶>红茶>绿茶) ,抗氧化能力:红茶>绿茶>乌龙茶(DPPH·法) ;红茶>绿茶>乌龙茶(水杨酸法) ;红茶>乌龙茶>绿茶(邻苯三酚法) ;不同茶叶中多酚的含量从1.71%增大到9.75% (绿茶>半发酵乌龙茶>红茶) ;结论:茶多糖和多酚是茶叶的主要抗氧化成分。绿茶的抗氧化作用主要来自茶多酚,红茶的抗氧化作用主要来自茶多糖。除乌龙茶多糖提取液外,两种抗氧化成分的抗氧化能力与其含量成量效关系。关键词:茶叶;多糖;多酚;自由基清除率;D P P H ·法;水杨酸法;邻苯三酚法

Effects of Active Ingredients in Black Tea, Green Tea and Oolong Tea on Antioxidant Capability

CHEN Jin-e,FENG Hui-jun,ZHANG Hai-rong*

(Laboratory of Biochemical Analysis, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, China)

Abstract :Polysaccharides were extracted from different teas with hot water and their contents were determined by sulfuricacid-phenol method, while polyphenols were extracted with alcohol and their contents were determined by ferrous tartratemethod. Then the scavenging effects of tea polysaccharide and polyphenol on free radicals were examined by DPPH·, salicylicacid and pyrogallol methods respectively, and the antioxidant capabilities of 8 kinds of tea were comparatively studied. Resultsshowed that the polysaccharides contents in different teas are from 2.19% up to 2.89% and their change order is as following:semifermented oolong tea > black tea > green tea. The polyphenol contents in different teas are from 1.71% up to 9.75% andtheir change order is as following: green tea > semifermented oolong tea > black tea. The order of antioxidant capability is blacktea > green tea > semifermented oolong tea (DPPH· and salicylic acid methods) or black tea > semifermented oolong tea >green tea (pyrogallol method). Both tea polysaccharides and polyphenols are main antioxidants in different kinds of teas. Theantioxidant capability of green tea mainly depends on polyphenols, while that of black tea mainly depends on polysaccharides.Furthermore, the antioxidant capabilities of both polysaccharides and polyphenols are proportional to their contents in varioustea extracts except aqueous polysaccharide extract of oolong tea.

Key words:tea ;polysaccharide ;polyphenol ;free radical scavenging rate;DPPH · method;salicylic acid method;pyrogallol method

中图分类号:Q946.39 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2009)03-0062-05

自1955年Harman 创立自由基衰老学说以来[1],自由基生命科学的研究日益深入,许多与年龄相关的疾病如心脏病、癌症、各种炎症、白内障、脑功能异常

及内脏器官的损伤或老化,可能与自由基导致的细胞损伤有关[2],寻找有效的能清除自由基的抗氧化剂已成为人们研究关注的热点。天然抗氧化物质无污染、副作

收稿日期:2008-02-19

基金项目:山西省自然科学基金项目(20051028);教育部归国留学人员科研启动基金项目(2005383)

作者简介:陈金娥(1957-),女,高级实验师,主要从事生物分析及天然产物的分离研究。E-mail :[email protected]*通讯作者:张海容(1957-),男,教授,主要从事天然植物有效活性成分分析研究。E-mail :[email protected]

※基础研究食品科学

2009, Vol. 30, No. 0363

用少、来源广泛,对疾病的治疗和人体健康的保护非常有益[3-7]。

茶叶在我国已有几千年的栽种和饮用历史,其中含有多种活性成分,如游离氨基酸、茶多酚、黄酮类、咖啡碱和可溶性糖等。茶多酚(tea polyphenols,TPS) 是茶叶的主要抗氧化剂。TPS 在茶叶(特别是绿茶) 中含量较高,占茶叶干重的30%左右,其中儿茶素类化合物为TP 的主要成分,约占TPS 总量的65%~80%,主要含有4种单体[8]:表儿茶素(E C ) 、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),化学结构式如图1。

R 1

OH

B

HO

O OH

A

C

OR 2

OH

(-) -表儿茶素(e p i c a t e c h i n , E C ) :R 1=R 2=H ;(+) -表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC):R 1=OH,R 2=H;(-)-表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG);R 1=H,R 2=没食子酰;(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechi-3-gallate,EGCG);R 1=OH,R 2=没食子酰。

图1 茶多酚的化学结构

Fig.1 Chemical structures of tea polyphenols

EGCG 含量最高约占儿茶素的50%左右。绿茶、半发酵的乌龙茶和红茶,由于制造工艺不同,其活性化学成分和含量也不同[9]。本实验通过DPPH ·法、水杨酸法及邻苯三酚法测定八种茶叶提取物清除氧自由基的能力,并对其进行对比研究,探索不同种类茶叶中多糖和多酚含量与自由基清除能力的关系。这对茶叶的开发和利用及其人体健康具有非常重要的意义。1材料与方法1.1

材料与试剂

各种茶叶购至本地茶店。不同种类茶叶编号如下:Ⅰ. 绿茶(福建寿宁) ;Ⅱ. 龙井绿茶(浙江狮峰) ;Ⅲ. 绿茶(河南信阳毛尖) ;Ⅳ. 绿茶(安徽黄山毛峰) ;Ⅴ. 普尔茶(熟茶,云南西双版纳) ;Ⅵ. 红茶(湖南祁门) ;Ⅶ. 红茶(福建政和) ;Ⅷ. 乌龙茶(半发酵,福建安溪) 。

葡萄糖(分析纯) 北京化学试剂公司;苯酚、95%乙醇、硫酸亚铁铵(分析纯) 天津市化学试剂三厂;浓硫酸(分析纯) 北京化工厂;水杨酸(分析纯) 天津市天新精细化工开发中心;过氧化氢(30%)(分析纯) 上海华

星化工厂;DPPH ·(化学纯) 东京化成工业株式会社;焦性没食子酸(化学纯) 贵州遵义市第二化工厂;其余试剂皆为分析纯。1.2

仪器与设备

X4-1型固体样品粉碎机 金坛市荣华仪器制造有限公司;检验标准筛(40目) 浙江省上虞市沙筛厂;D Z -1A 真空干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;AB204-N 精密电子分析天平 梅特斯-托利多仪器(上海) 有限公司;KQ-100DB 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;722型光栅可见分光光度计 上海分析仪器总厂;PHS-3tc 精密数显酸度计 上海天达仪器有限公司。1.3方法

1.3.1

超声波法提取各种茶叶多糖及多酚

八种茶叶烘干、粉碎后,过40目筛,装瓶标号待用。分别称取各种茶0.1000g 置于100ml 锥形瓶中,加入95%的乙醇40ml ,置于超声波清洗器中,温度为45℃、功率80W 、超声处理30m i n ,静置冷却至室温后过滤到100ml 容量瓶中,重复操作,合并两次滤液,加95%乙醇定容至100ml ,得到各种茶多酚提取液。

分别取上述所得的残渣,加水40ml 于100ml 锥形瓶中,置于超声波清洗器中温度为75℃、功率80W 的条件下超声处理30min ,待冷却到室温后过滤到100ml 容量瓶中,重复操作,合并两次滤液,加蒸馏水定容至100ml ,得到各种茶多糖提取液。1.3.2

硫酸-苯酚法[9]绘制葡萄糖标准曲线

吸取1ml 葡萄糖储备液10ml 至100ml 的容量瓶中,加水定容至100ml 得100μg/ml 的葡萄糖标准溶液,用移液管分别移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml 标准溶液补水至2ml ,然后加入5%的苯酚溶液1.0ml 及浓硫酸5.0ml ,摇匀,恒温沸水浴加热15min ,溶液显淡棕色,静置10m i n 后,在最大吸收波长490n m 处测吸光度,绘制标准曲线,得回归方程为:y=0.0208x-0.0806(R2=0.9927),式中:y 为吸光度;x 为溶液浓度。1.3.3

酒石酸亚铁法绘制多酚标准曲线

分别吸取1m g /m l 没食子酸0. 0、0. 25、0. 50、0. 75、1. 0、1. 25m l 于25m l 比色管中,逐个补水至4.0ml ,然后分别加入酒石酸亚铁5.0ml ,用缓冲溶液定容到25m l ,摇匀,静置1h ,在最大吸收波长为540nm 处以试剂空白作参比,测其吸光度;以吸光度作纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程:y=0.0153x-0.0258(R2=0.9968),式中:y 为吸光度;x 为溶液浓度。

64 2009, Vol. 30, No. 03

食品科学※基础研究

1.3.4

多糖、多酚含量的测定

取1ml 各种茶叶提取液,按实验方法1.3.2、1.3.3与作标准曲线同样的条件下,以提取液作参比,测其吸光度,代入标准曲线方程中,确定茶多糖、多酚的含量。多糖及多酚的产率按下式计算:

产率(%)=浓度————————————————————×(μg/ml)×稀释倍数×提取液体积(ml)

原料干重(g) ×106

100

1.3.5自由基清除率的测定方法1.3.5.1

DPPH ·法

取茶提液1ml 稀释到50ml 的容量瓶,吸取1.0 ml 补水至2ml ,然后加2ml 2×10-4mol/L的DPPH ·溶液比色管中,摇匀,30m i n 后用提取液作参比,测定吸光度(A样品) ,测定2ml 2×10-4mol/L DPPH·液与2ml 无水乙醇混合溶液的吸光度(A对照) ,根据下面的公式计算清除率:

    清除率(%)= ———————×A 对照-A 样品

100

    A对照

= ———————————————×(A对照-A 参比) -(A样品-A 样参)

A A 100

对照-参比

式中:A 参比为加入无水乙醇时的吸光度;A 对照为加入DPPH ·体系的吸光度;A 样参为加入不同提取液后的吸光度;A 样品为加入不同提取液、DPPH ·后体系的吸光度。1.3.5.2水杨酸法

在10ml 比色管中依次加入7.5×10-3mol/L的硫酸亚铁铵1、7.5mol /L的水杨酸,0.3%的H 2O 2各1ml ,最后分别加入1ml 提取液,并定容至10ml ,30min 后,用提取液作参比,测其在510n m 处的吸光度。清除率计算公式为:

     

清除率(%)= —A —对照——-—A —样品

—×100

        A 对照

= —(A——对照—-—A —参比—) —-—(A—样品—-—A 样参)

A ———×100

对照-A 参比

式中:A 参比为加入F e 2+、H 2O 2时的吸光度;A 对照

为加入Fe 2+、H 2O 2水杨酸后的羟自由基体系的吸光度;A 样参为加入 Fe2+、H 2O 2不同提取液后的吸光度值;A 样品为加入F e 2+、H 2O 2不同提取液、水杨酸后的羟自由基体系的吸光度。

吸光度越低,除·O H 的效果越好。1.3.5.3

邻苯三酚法测定茶提取液对O -2·的抑制率

分别取干净的10ml 比色管,依次加入2ml 提取液,2ml pH8.43的缓冲溶液,1ml 邻苯三酚,再加NBT2.5ml ,摇匀,20min 后,在波长560nm 处测其吸光度。2结果与分析

2.1

不同种类茶多糖含量与自由基清除率变化的关系多糖是广泛存在于自然界的高分子化合物,它是由单糖通过糖苷连接而成的,在生物体内,多糖常与蛋白质或脂类形成蛋白质或糖脂复合物,茶多糖对预防心血管系疾病以及茶多糖在增强机体免疫力功能方面有独特的药理作用和多种生理活性,显示了茶多糖在食品功能添加剂领域的重要应用价值。不同种类茶多糖含量对自由基清除率影响的实验结果见表1。

表1 茶多糖含量与自由基清除率的关系

Table 1 Contents of polysaccharides in aqueous extracts of 95%ethanol extraction residue of eight kinds of tea and their free

radical(DPPH·,·OH and O-

2·) scavenging rates

茶样茶多糖含量(%)

D P P H ·法水杨酸法邻苯三酚法清除率(%)清除率(%)清除率(%)Ⅰ2.4423.3550.8937.37Ⅱ2.3226.9755.8750.00Ⅲ2.1929.2159.1045.26Ⅳ2.5020.5852.8443.16Ⅴ2.7729.5859.8857.37Ⅵ2.4649.5765.0755.00Ⅶ2.8034.7568.5950.79Ⅷ

2.89

14.39

48.83

46.05

由表1可知,各种茶多糖的含量大小顺序为:Ⅷ>Ⅶ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅵ>Ⅱ>Ⅲ,即:半发酵乌龙茶>红茶>绿茶,多糖含量最多的是半发酵乌龙茶(Ⅷ) ,最少的是绿茶(Ⅲ) 。三种不同方法测定的自由基的清除率由大到小顺序为: D P P H ·法:Ⅵ>Ⅶ>Ⅴ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ>Ⅷ;水杨酸法:Ⅶ>Ⅵ>Ⅴ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅷ;邻苯三酚法测O -2·清除率:Ⅴ>Ⅵ>Ⅶ>Ⅱ>Ⅷ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅰ。除半发酵的乌龙茶外(Ⅷ) ,红茶Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的多糖提取液,均表现出对各类自由基有较强的清除能力。2.2

不同种类茶多酚含量与自由基清除率变化的关系大量实践研究表明:不同种类茶叶中富含T P S 物质,是主要的抗氧化剂。TPS 含量对自由基清除率影响的实验结果见表2。

由表2可知,茶多酚含量大小顺序为:Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ>Ⅷ>Ⅵ>Ⅶ>Ⅴ,即:绿茶>半发酵乌龙茶>红茶,茶叶中多酚含量对自由基的清除率大小顺序如下:DP PH ·法:Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ>Ⅷ>Ⅵ>Ⅶ>Ⅴ;水杨酸法:Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅷ>Ⅵ>Ⅵ>Ⅴ;邻苯三

※基础研究

食品科学

2009, Vol. 30, No. 0365

表 2 茶多酚含量与自由基清除率的关系

Table 2 Contents of polyphenols in 95% ethanol extracts of eight

kinds of tea and their free radical (DPPH,·OH and O-

2·) scavenging rate

茶样茶多酚D P P H ·法水杨酸法邻苯三酚法含量(%)清除率(%)清除率(%)清除率(%)Ⅰ9.7582.8269.8025.76Ⅱ10.6789.2374.5632.73Ⅲ10.7289.0272.99 26.67Ⅳ8.5379.0080.1428.48Ⅴ1.7112.5829.1617.27Ⅵ2.7531.1338.3618.48Ⅶ2.1417.1639.1414.84Ⅷ

7.58

72.17

51.27

18.18

酚法:Ⅱ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅵ>Ⅷ>Ⅴ>Ⅶ。不同种类茶叶的抗氧化能力与其多酚的含量顺序一致。3讨 论

3.1

茶叶的加工方法对茶多糖及多酚含量有很大的影响茶叶在加工过程中,各种活性成分在微生物的参与下发生了复杂的变化,这正是不同品种茶叶滋味、香气和色泽不同的原因。乌龙茶、红茶、绿茶,多糖含量变化并不十分显著,乌龙茶和红茶略高于绿茶。这可能与乌龙茶、红茶在发酵过程中,由于微生物的胞外酶——纤维素酶的作用下,使纤维素水解成寡糖及小分子可溶性糖类物质,从而使多糖的含量有所增加

[10]

绿茶中多酚的含量略高于乌龙茶,二者多酚的含量远远高于红茶,与文献[10]的报道在加工过程中绿茶中多酚的含量变化较小、红茶中多酚的含量至少降低40%以上一致。3.2

不同茶叶多糖含量与抗氧化作用的复杂性表现实验表明,无论是测定总自由基清除率的DPPH ·法、还是测定·OH 的水杨酸法及测O -

2·邻苯三酚法,

云南西双版纳普洱茶(熟饼,Ⅴ) 、湖南祁门红茶(Ⅵ) 及福建政和红茶(Ⅶ) 多糖含量较高,均表现出对不同自由基有较强的清除率,这种现象说明多糖中的半缩醛还原基团、伯仲羟基等与氧自由基有明显的化学作用。福建安溪乌龙茶(Ⅷ,半发酵) 虽多糖含量最高,但对自由基的清除率在D P P H ·法、水杨酸法最低,邻苯三酚法中较低;这种现象可能与发酵过程中有效成分的水解、异构化和生物大分子间的相互作用有关,亦与抗氧化作用机理密切相关。众所周知,在生命活动的新陈代谢过程中,·O H 、O -2·及脂自由基(R O O ·) 是三种有代表性的自由基,其中·O H 氧化能力很强,是仅次于氟的一种非选择性氧化剂。O -2·极不稳定,其πg*2p反键轨道中有一个未成对的电子,它既可以得到电子,又可以失去电子,还可与有单电子的化合物结合。中性介质中,O -2·与O 2及H 2O 2的电极电势如下:

O 2+e=O-2·,E φ=-0. 33V ;O -2·+H++e=H2O 2,E

φ

=0.87V。抗氧化作用指能够使自由基氧化减缓或停止自由基氧化的各种过程,它主要包括[11]:(1)自由基的清除和阻止增殖;(2) 酶水解脂质中酯键以除去过氧化脂肪酸;(3) 过渡金属离子的阻断;(4) 酶催化过氧化物的还原。尽管使用不同方法比较、测定体外自由基的清除率表现,但无法模拟生物体内各种生物酶和活性氧自由基的浓度大小及真实的反应机理;另一方面研究表明,茶叶中含蛋白质、氨基酸、咖啡碱、茶多酚、脂类、维生素类等有机化合物450多种,无机矿物质15种以上。仅用多糖个别成分代表所有水溶性成分研究不同种类茶叶的抗氧化作用,尚有一定的困难,因而茶类水溶性成分抗氧化性有一定复杂性。3.3

茶多酚含量与自由基的清除能力呈现良好的量效关系茶叶中多酚含量顺序与其对自由基的清除能力大小顺序一致:绿茶>半发酵乌龙茶>红茶。茶多酚是茶叶中具有很强抗氧化性的物质。国内外众多学者研究表明,均认为茶多酚具有优异的抗氧化性能,它可以有效清除氧自由基,其抗氧化作用机理是由于儿茶素EC 、EGC 、ECG 、EGCG 的B 环和C 环上的酚性羟基具有供氢的活性。在发酵过程、多酚氧化酶的作用下,儿茶素类物质发生强烈的氧化反应、氧化偶联反应,在氧化过程中生成邻醌类及联苯酚醌如茶黄素(theaflavins)、茶红素(thearubingins)等物质,反应过程如下:

R 1

OH

B

HO

O OH

A

C

OR 2

OH

OH

OR OH

OR

HO

O OH

HO

O COOH OH

COOH HO

O

O HO

O

O OR

OH

OR OH

OH

茶黄素

茶红素

因此,在形成红茶的发酵过程中,由于多酚类羟基的氧化、偶联作用,多酚羟基数量大大减少,抗氧化能力相应降低。乌龙茶中多酚的含量略低于绿茶,远

66 2009, Vol. 30, No. 03

食品科学※基础研究

远高于红茶,其抗氧化性介于绿茶和红茶二者之间,上述实验结果进一步证实了茶多酚是茶叶中主要抗氧化成分,且茶多酚含量与自由基的清除能力呈现良好的量效关系。

4结 论

综上所述,多糖和多酚是不同种类茶叶抗氧化作用

的主要有效成分;对于同一种茶叶而言,一般情况下茶叶中多酚含量高于多糖的含量(除Ⅴ、Ⅶ外) ;绿茶的抗氧化作用主要来自茶多酚,红茶的抗氧化作用主要来自茶多糖。

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陈金娥,丰慧君,张海容*

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摘 要:目的与方法:通过醇提得到各种茶多酚提取液,酒石酸亚铁法测定了多酚的含量;水提得到各种茶多糖提取液,用硫酸-苯酚法测定其中多糖的含量。通过DPPH ·法、水杨酸法及邻苯三酚法测定不同茶叶中多酚、多糖含量对自由基的清除作用的影响,对比研究八种茶叶的抗氧化能力。结果:不同茶叶中多糖的含量从2.19%增大到2.89% (半发酵乌龙茶>红茶>绿茶) ,抗氧化能力:红茶>绿茶>乌龙茶(DPPH·法) ;红茶>绿茶>乌龙茶(水杨酸法) ;红茶>乌龙茶>绿茶(邻苯三酚法) ;不同茶叶中多酚的含量从1.71%增大到9.75% (绿茶>半发酵乌龙茶>红茶) ;结论:茶多糖和多酚是茶叶的主要抗氧化成分。绿茶的抗氧化作用主要来自茶多酚,红茶的抗氧化作用主要来自茶多糖。除乌龙茶多糖提取液外,两种抗氧化成分的抗氧化能力与其含量成量效关系。关键词:茶叶;多糖;多酚;自由基清除率;D P P H ·法;水杨酸法;邻苯三酚法

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(Laboratory of Biochemical Analysis, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, China)

Abstract :Polysaccharides were extracted from different teas with hot water and their contents were determined by sulfuricacid-phenol method, while polyphenols were extracted with alcohol and their contents were determined by ferrous tartratemethod. Then the scavenging effects of tea polysaccharide and polyphenol on free radicals were examined by DPPH·, salicylicacid and pyrogallol methods respectively, and the antioxidant capabilities of 8 kinds of tea were comparatively studied. Resultsshowed that the polysaccharides contents in different teas are from 2.19% up to 2.89% and their change order is as following:semifermented oolong tea > black tea > green tea. The polyphenol contents in different teas are from 1.71% up to 9.75% andtheir change order is as following: green tea > semifermented oolong tea > black tea. The order of antioxidant capability is blacktea > green tea > semifermented oolong tea (DPPH· and salicylic acid methods) or black tea > semifermented oolong tea >green tea (pyrogallol method). Both tea polysaccharides and polyphenols are main antioxidants in different kinds of teas. Theantioxidant capability of green tea mainly depends on polyphenols, while that of black tea mainly depends on polysaccharides.Furthermore, the antioxidant capabilities of both polysaccharides and polyphenols are proportional to their contents in varioustea extracts except aqueous polysaccharide extract of oolong tea.

Key words:tea ;polysaccharide ;polyphenol ;free radical scavenging rate;DPPH · method;salicylic acid method;pyrogallol method

中图分类号:Q946.39 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2009)03-0062-05

自1955年Harman 创立自由基衰老学说以来[1],自由基生命科学的研究日益深入,许多与年龄相关的疾病如心脏病、癌症、各种炎症、白内障、脑功能异常

及内脏器官的损伤或老化,可能与自由基导致的细胞损伤有关[2],寻找有效的能清除自由基的抗氧化剂已成为人们研究关注的热点。天然抗氧化物质无污染、副作

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基金项目:山西省自然科学基金项目(20051028);教育部归国留学人员科研启动基金项目(2005383)

作者简介:陈金娥(1957-),女,高级实验师,主要从事生物分析及天然产物的分离研究。E-mail :[email protected]*通讯作者:张海容(1957-),男,教授,主要从事天然植物有效活性成分分析研究。E-mail :[email protected]

※基础研究食品科学

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用少、来源广泛,对疾病的治疗和人体健康的保护非常有益[3-7]。

茶叶在我国已有几千年的栽种和饮用历史,其中含有多种活性成分,如游离氨基酸、茶多酚、黄酮类、咖啡碱和可溶性糖等。茶多酚(tea polyphenols,TPS) 是茶叶的主要抗氧化剂。TPS 在茶叶(特别是绿茶) 中含量较高,占茶叶干重的30%左右,其中儿茶素类化合物为TP 的主要成分,约占TPS 总量的65%~80%,主要含有4种单体[8]:表儿茶素(E C ) 、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),化学结构式如图1。

R 1

OH

B

HO

O OH

A

C

OR 2

OH

(-) -表儿茶素(e p i c a t e c h i n , E C ) :R 1=R 2=H ;(+) -表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC):R 1=OH,R 2=H;(-)-表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG);R 1=H,R 2=没食子酰;(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechi-3-gallate,EGCG);R 1=OH,R 2=没食子酰。

图1 茶多酚的化学结构

Fig.1 Chemical structures of tea polyphenols

EGCG 含量最高约占儿茶素的50%左右。绿茶、半发酵的乌龙茶和红茶,由于制造工艺不同,其活性化学成分和含量也不同[9]。本实验通过DPPH ·法、水杨酸法及邻苯三酚法测定八种茶叶提取物清除氧自由基的能力,并对其进行对比研究,探索不同种类茶叶中多糖和多酚含量与自由基清除能力的关系。这对茶叶的开发和利用及其人体健康具有非常重要的意义。1材料与方法1.1

材料与试剂

各种茶叶购至本地茶店。不同种类茶叶编号如下:Ⅰ. 绿茶(福建寿宁) ;Ⅱ. 龙井绿茶(浙江狮峰) ;Ⅲ. 绿茶(河南信阳毛尖) ;Ⅳ. 绿茶(安徽黄山毛峰) ;Ⅴ. 普尔茶(熟茶,云南西双版纳) ;Ⅵ. 红茶(湖南祁门) ;Ⅶ. 红茶(福建政和) ;Ⅷ. 乌龙茶(半发酵,福建安溪) 。

葡萄糖(分析纯) 北京化学试剂公司;苯酚、95%乙醇、硫酸亚铁铵(分析纯) 天津市化学试剂三厂;浓硫酸(分析纯) 北京化工厂;水杨酸(分析纯) 天津市天新精细化工开发中心;过氧化氢(30%)(分析纯) 上海华

星化工厂;DPPH ·(化学纯) 东京化成工业株式会社;焦性没食子酸(化学纯) 贵州遵义市第二化工厂;其余试剂皆为分析纯。1.2

仪器与设备

X4-1型固体样品粉碎机 金坛市荣华仪器制造有限公司;检验标准筛(40目) 浙江省上虞市沙筛厂;D Z -1A 真空干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;AB204-N 精密电子分析天平 梅特斯-托利多仪器(上海) 有限公司;KQ-100DB 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;722型光栅可见分光光度计 上海分析仪器总厂;PHS-3tc 精密数显酸度计 上海天达仪器有限公司。1.3方法

1.3.1

超声波法提取各种茶叶多糖及多酚

八种茶叶烘干、粉碎后,过40目筛,装瓶标号待用。分别称取各种茶0.1000g 置于100ml 锥形瓶中,加入95%的乙醇40ml ,置于超声波清洗器中,温度为45℃、功率80W 、超声处理30m i n ,静置冷却至室温后过滤到100ml 容量瓶中,重复操作,合并两次滤液,加95%乙醇定容至100ml ,得到各种茶多酚提取液。

分别取上述所得的残渣,加水40ml 于100ml 锥形瓶中,置于超声波清洗器中温度为75℃、功率80W 的条件下超声处理30min ,待冷却到室温后过滤到100ml 容量瓶中,重复操作,合并两次滤液,加蒸馏水定容至100ml ,得到各种茶多糖提取液。1.3.2

硫酸-苯酚法[9]绘制葡萄糖标准曲线

吸取1ml 葡萄糖储备液10ml 至100ml 的容量瓶中,加水定容至100ml 得100μg/ml 的葡萄糖标准溶液,用移液管分别移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml 标准溶液补水至2ml ,然后加入5%的苯酚溶液1.0ml 及浓硫酸5.0ml ,摇匀,恒温沸水浴加热15min ,溶液显淡棕色,静置10m i n 后,在最大吸收波长490n m 处测吸光度,绘制标准曲线,得回归方程为:y=0.0208x-0.0806(R2=0.9927),式中:y 为吸光度;x 为溶液浓度。1.3.3

酒石酸亚铁法绘制多酚标准曲线

分别吸取1m g /m l 没食子酸0. 0、0. 25、0. 50、0. 75、1. 0、1. 25m l 于25m l 比色管中,逐个补水至4.0ml ,然后分别加入酒石酸亚铁5.0ml ,用缓冲溶液定容到25m l ,摇匀,静置1h ,在最大吸收波长为540nm 处以试剂空白作参比,测其吸光度;以吸光度作纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程:y=0.0153x-0.0258(R2=0.9968),式中:y 为吸光度;x 为溶液浓度。

64 2009, Vol. 30, No. 03

食品科学※基础研究

1.3.4

多糖、多酚含量的测定

取1ml 各种茶叶提取液,按实验方法1.3.2、1.3.3与作标准曲线同样的条件下,以提取液作参比,测其吸光度,代入标准曲线方程中,确定茶多糖、多酚的含量。多糖及多酚的产率按下式计算:

产率(%)=浓度————————————————————×(μg/ml)×稀释倍数×提取液体积(ml)

原料干重(g) ×106

100

1.3.5自由基清除率的测定方法1.3.5.1

DPPH ·法

取茶提液1ml 稀释到50ml 的容量瓶,吸取1.0 ml 补水至2ml ,然后加2ml 2×10-4mol/L的DPPH ·溶液比色管中,摇匀,30m i n 后用提取液作参比,测定吸光度(A样品) ,测定2ml 2×10-4mol/L DPPH·液与2ml 无水乙醇混合溶液的吸光度(A对照) ,根据下面的公式计算清除率:

    清除率(%)= ———————×A 对照-A 样品

100

    A对照

= ———————————————×(A对照-A 参比) -(A样品-A 样参)

A A 100

对照-参比

式中:A 参比为加入无水乙醇时的吸光度;A 对照为加入DPPH ·体系的吸光度;A 样参为加入不同提取液后的吸光度;A 样品为加入不同提取液、DPPH ·后体系的吸光度。1.3.5.2水杨酸法

在10ml 比色管中依次加入7.5×10-3mol/L的硫酸亚铁铵1、7.5mol /L的水杨酸,0.3%的H 2O 2各1ml ,最后分别加入1ml 提取液,并定容至10ml ,30min 后,用提取液作参比,测其在510n m 处的吸光度。清除率计算公式为:

     

清除率(%)= —A —对照——-—A —样品

—×100

        A 对照

= —(A——对照—-—A —参比—) —-—(A—样品—-—A 样参)

A ———×100

对照-A 参比

式中:A 参比为加入F e 2+、H 2O 2时的吸光度;A 对照

为加入Fe 2+、H 2O 2水杨酸后的羟自由基体系的吸光度;A 样参为加入 Fe2+、H 2O 2不同提取液后的吸光度值;A 样品为加入F e 2+、H 2O 2不同提取液、水杨酸后的羟自由基体系的吸光度。

吸光度越低,除·O H 的效果越好。1.3.5.3

邻苯三酚法测定茶提取液对O -2·的抑制率

分别取干净的10ml 比色管,依次加入2ml 提取液,2ml pH8.43的缓冲溶液,1ml 邻苯三酚,再加NBT2.5ml ,摇匀,20min 后,在波长560nm 处测其吸光度。2结果与分析

2.1

不同种类茶多糖含量与自由基清除率变化的关系多糖是广泛存在于自然界的高分子化合物,它是由单糖通过糖苷连接而成的,在生物体内,多糖常与蛋白质或脂类形成蛋白质或糖脂复合物,茶多糖对预防心血管系疾病以及茶多糖在增强机体免疫力功能方面有独特的药理作用和多种生理活性,显示了茶多糖在食品功能添加剂领域的重要应用价值。不同种类茶多糖含量对自由基清除率影响的实验结果见表1。

表1 茶多糖含量与自由基清除率的关系

Table 1 Contents of polysaccharides in aqueous extracts of 95%ethanol extraction residue of eight kinds of tea and their free

radical(DPPH·,·OH and O-

2·) scavenging rates

茶样茶多糖含量(%)

D P P H ·法水杨酸法邻苯三酚法清除率(%)清除率(%)清除率(%)Ⅰ2.4423.3550.8937.37Ⅱ2.3226.9755.8750.00Ⅲ2.1929.2159.1045.26Ⅳ2.5020.5852.8443.16Ⅴ2.7729.5859.8857.37Ⅵ2.4649.5765.0755.00Ⅶ2.8034.7568.5950.79Ⅷ

2.89

14.39

48.83

46.05

由表1可知,各种茶多糖的含量大小顺序为:Ⅷ>Ⅶ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅵ>Ⅱ>Ⅲ,即:半发酵乌龙茶>红茶>绿茶,多糖含量最多的是半发酵乌龙茶(Ⅷ) ,最少的是绿茶(Ⅲ) 。三种不同方法测定的自由基的清除率由大到小顺序为: D P P H ·法:Ⅵ>Ⅶ>Ⅴ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ>Ⅷ;水杨酸法:Ⅶ>Ⅵ>Ⅴ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅷ;邻苯三酚法测O -2·清除率:Ⅴ>Ⅵ>Ⅶ>Ⅱ>Ⅷ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅰ。除半发酵的乌龙茶外(Ⅷ) ,红茶Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的多糖提取液,均表现出对各类自由基有较强的清除能力。2.2

不同种类茶多酚含量与自由基清除率变化的关系大量实践研究表明:不同种类茶叶中富含T P S 物质,是主要的抗氧化剂。TPS 含量对自由基清除率影响的实验结果见表2。

由表2可知,茶多酚含量大小顺序为:Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ>Ⅷ>Ⅵ>Ⅶ>Ⅴ,即:绿茶>半发酵乌龙茶>红茶,茶叶中多酚含量对自由基的清除率大小顺序如下:DP PH ·法:Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ>Ⅷ>Ⅵ>Ⅶ>Ⅴ;水杨酸法:Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅷ>Ⅵ>Ⅵ>Ⅴ;邻苯三

※基础研究

食品科学

2009, Vol. 30, No. 0365

表 2 茶多酚含量与自由基清除率的关系

Table 2 Contents of polyphenols in 95% ethanol extracts of eight

kinds of tea and their free radical (DPPH,·OH and O-

2·) scavenging rate

茶样茶多酚D P P H ·法水杨酸法邻苯三酚法含量(%)清除率(%)清除率(%)清除率(%)Ⅰ9.7582.8269.8025.76Ⅱ10.6789.2374.5632.73Ⅲ10.7289.0272.99 26.67Ⅳ8.5379.0080.1428.48Ⅴ1.7112.5829.1617.27Ⅵ2.7531.1338.3618.48Ⅶ2.1417.1639.1414.84Ⅷ

7.58

72.17

51.27

18.18

酚法:Ⅱ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅵ>Ⅷ>Ⅴ>Ⅶ。不同种类茶叶的抗氧化能力与其多酚的含量顺序一致。3讨 论

3.1

茶叶的加工方法对茶多糖及多酚含量有很大的影响茶叶在加工过程中,各种活性成分在微生物的参与下发生了复杂的变化,这正是不同品种茶叶滋味、香气和色泽不同的原因。乌龙茶、红茶、绿茶,多糖含量变化并不十分显著,乌龙茶和红茶略高于绿茶。这可能与乌龙茶、红茶在发酵过程中,由于微生物的胞外酶——纤维素酶的作用下,使纤维素水解成寡糖及小分子可溶性糖类物质,从而使多糖的含量有所增加

[10]

绿茶中多酚的含量略高于乌龙茶,二者多酚的含量远远高于红茶,与文献[10]的报道在加工过程中绿茶中多酚的含量变化较小、红茶中多酚的含量至少降低40%以上一致。3.2

不同茶叶多糖含量与抗氧化作用的复杂性表现实验表明,无论是测定总自由基清除率的DPPH ·法、还是测定·OH 的水杨酸法及测O -

2·邻苯三酚法,

云南西双版纳普洱茶(熟饼,Ⅴ) 、湖南祁门红茶(Ⅵ) 及福建政和红茶(Ⅶ) 多糖含量较高,均表现出对不同自由基有较强的清除率,这种现象说明多糖中的半缩醛还原基团、伯仲羟基等与氧自由基有明显的化学作用。福建安溪乌龙茶(Ⅷ,半发酵) 虽多糖含量最高,但对自由基的清除率在D P P H ·法、水杨酸法最低,邻苯三酚法中较低;这种现象可能与发酵过程中有效成分的水解、异构化和生物大分子间的相互作用有关,亦与抗氧化作用机理密切相关。众所周知,在生命活动的新陈代谢过程中,·O H 、O -2·及脂自由基(R O O ·) 是三种有代表性的自由基,其中·O H 氧化能力很强,是仅次于氟的一种非选择性氧化剂。O -2·极不稳定,其πg*2p反键轨道中有一个未成对的电子,它既可以得到电子,又可以失去电子,还可与有单电子的化合物结合。中性介质中,O -2·与O 2及H 2O 2的电极电势如下:

O 2+e=O-2·,E φ=-0. 33V ;O -2·+H++e=H2O 2,E

φ

=0.87V。抗氧化作用指能够使自由基氧化减缓或停止自由基氧化的各种过程,它主要包括[11]:(1)自由基的清除和阻止增殖;(2) 酶水解脂质中酯键以除去过氧化脂肪酸;(3) 过渡金属离子的阻断;(4) 酶催化过氧化物的还原。尽管使用不同方法比较、测定体外自由基的清除率表现,但无法模拟生物体内各种生物酶和活性氧自由基的浓度大小及真实的反应机理;另一方面研究表明,茶叶中含蛋白质、氨基酸、咖啡碱、茶多酚、脂类、维生素类等有机化合物450多种,无机矿物质15种以上。仅用多糖个别成分代表所有水溶性成分研究不同种类茶叶的抗氧化作用,尚有一定的困难,因而茶类水溶性成分抗氧化性有一定复杂性。3.3

茶多酚含量与自由基的清除能力呈现良好的量效关系茶叶中多酚含量顺序与其对自由基的清除能力大小顺序一致:绿茶>半发酵乌龙茶>红茶。茶多酚是茶叶中具有很强抗氧化性的物质。国内外众多学者研究表明,均认为茶多酚具有优异的抗氧化性能,它可以有效清除氧自由基,其抗氧化作用机理是由于儿茶素EC 、EGC 、ECG 、EGCG 的B 环和C 环上的酚性羟基具有供氢的活性。在发酵过程、多酚氧化酶的作用下,儿茶素类物质发生强烈的氧化反应、氧化偶联反应,在氧化过程中生成邻醌类及联苯酚醌如茶黄素(theaflavins)、茶红素(thearubingins)等物质,反应过程如下:

R 1

OH

B

HO

O OH

A

C

OR 2

OH

OH

OR OH

OR

HO

O OH

HO

O COOH OH

COOH HO

O

O HO

O

O OR

OH

OR OH

OH

茶黄素

茶红素

因此,在形成红茶的发酵过程中,由于多酚类羟基的氧化、偶联作用,多酚羟基数量大大减少,抗氧化能力相应降低。乌龙茶中多酚的含量略低于绿茶,远

66 2009, Vol. 30, No. 03

食品科学※基础研究

远高于红茶,其抗氧化性介于绿茶和红茶二者之间,上述实验结果进一步证实了茶多酚是茶叶中主要抗氧化成分,且茶多酚含量与自由基的清除能力呈现良好的量效关系。

4结 论

综上所述,多糖和多酚是不同种类茶叶抗氧化作用

的主要有效成分;对于同一种茶叶而言,一般情况下茶叶中多酚含量高于多糖的含量(除Ⅴ、Ⅶ外) ;绿茶的抗氧化作用主要来自茶多酚,红茶的抗氧化作用主要来自茶多糖。

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