摘要：研究了不同pH值对ELISA法检测肌肉组织中盐酸克伦特罗结果的影响。结果表明，在一定pH值范围内瘦肉精含量与样品pH值呈极显著负相关关系；在试剂盒所对应的推荐pH值范围以内，样品pH值的变化对检测结果的影响较小，反之，样品pH值每调节1个单位所得的检测结果间差异显著。 关键词：pH值；肌肉；盐酸克伦特罗；ELISA 中图分类号：S859.84 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）02-0023-03 盐酸克伦特罗属于β-兴奋剂类药物，俗称瘦肉精，是一类高度选择性的兴奋剂和激素[1]，可提高动物胴体瘦肉率，近年来被一些人非法添加至饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物的生长[2]。人食用了盐酸克伦特罗残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、颤栗等症状，残留的盐酸克伦特罗可引起食物中毒，严重者可引起死亡，各国已明文禁止其使用[3]。 本试验主要研究样品不同pH值对ELISA检测结果的影响，为基层检测盐酸克伦特罗提供一定的参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料 新鲜精瘦牛肉样品来源于襄阳市云集、帝苑等农贸市场，选取29份样品进行试验分析。 1.2 主要试剂与仪器 克伦特罗（CLE）酶联免疫试剂盒购自北京维德维康生物技术有限公司，乙酸乙酯溶液、异丙醇溶液、高氯酸溶液、NaOH溶液均为市售； SUNRISE酶标仪购自帝肯（上海）贸易有限公司、电子天平购自梅特勒-托利多公司、单道及多道移液器购自芬兰百得实验室（仪器）有限公司。 1.3 试验方法 1.3.1 肌肉组织检测样品的制备 准确称取（2±0.01） g均质后的肉脯样品于50 mL离心管中；加入6 mL 0.2 mol/L高氯酸溶液，涡动至组织完全分散； 室温[（25±2） ℃]条件下，摇床300 r/min振摇20 min；8 000 r/min离心10 min；将全部上清液转入新的离心管中，用1 mol/L NaOH溶液调节pH至11.6；加入6 mL乙酸乙酯-异丙醇（3：1）溶液；室温[（25±2） ℃]条件下，摇床300 r/min振摇20 min；8 000 r/min离心10 min；取2 mL上层有机相于新的离心管中；50～60 ℃水浴中，氮气吹干；加入2 mL正己烷，高速涡动30 s， 加入1 mL样品稀释液，充分涡动1 min；8 000 r/min离心5 min，除去上层正己烷。调节样品溶液pH，制备不用pH样品的待检测样品。 1.3.2 ELISA检测不同pH样品盐酸克伦特罗 将所需的酶标板条插入酶标板架上，记录下标准品和样品的位置，建议均做平行实验；将20 μL各标准品工作液和不同pH样品溶液分别加入对应的标准品和样品孔中；在每个板孔中加入50 μL酶标Ⅱ抗工作液；在每个板孔中加入80 μL的抗体工作液；盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温[（25±2） ℃]下，避光反应40 min；揭开盖板膜；甩掉板孔中液体，在每个板孔加入260 μL洗涤工作液，浸泡30 s；再重复上一步骤3次；甩掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；立即在每个板孔中加入100 μL A、B（按体积比1：1）混合液；盖上盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温[（25±2） ℃]下，避光反应15～20 min；揭开盖板膜，在每个板孔中加入50 μL终止液，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀；用酶标仪在450 nm、630 nm下检测吸光度值，结果在5 min内读取。 1.3.3 数据统计 利用Excel 2003、RIDAWIN MFC Application和SPSS 17.0软件对数据进行处理。 2 结果与分析 2.1 不同pH值对肌肉组织中盐酸克伦特罗检测结果的影响 从29份样品中随机抽取2份样品的检测结果，不同pH条件下检测盐酸克伦特罗的结果见表1。 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P 从表1可以看出，试剂盒检测样品中盐酸克伦特罗含量受pH值影响的规律比较明显，随着pH值由低到高的变化，用ELISA试剂盒检测到肌肉组织中盐酸克伦特罗含量逐渐降低。 2.2 同一样品不同pH值与盐酸克伦特罗含量之间的相关性 利用SPSS 17.0 软件对检测数据进行处理，可得出表2、表3关系矩阵。从表2、表3可以看出，检测同一样品不同pH值条件下盐酸克伦特罗含量时，pH值与盐酸克伦特罗含量之间呈极显著负相关关系。 注：“**”表示在0.01的水平差异极显著（P 3 小结与讨论 ELISA检测技术在实际应用中简便易学，因而广泛应用于我们基层实验室。但其影响因素较多，主要有试剂盒因素和实际操作中的影响因素[4]。 影响试验结果的试剂盒因素主要有以下5点：①固相载体。可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，是进行酶标记测定的基本条件。②抗原。包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果均有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高，抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。③结合物。用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性。④洗涤剂与稀释剂。为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部分会从固相载体上被洗涤下来，从而很可能会使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质吸附到原来包被抗原凹孔的空白处，增加本底颜色，产生假阳性反应，这是限制ELISA 特异性的一个因素。⑤底物。各种酶都有对底物的特异性，所以使用不同种类的酶要求有不同的底物[5]。 实际操作中的影响因素主要有以下5 点：①环境温、湿度。ELISA 检测中所用试剂与酶的活性有很大关系，试剂盒在用于正式试验前是否充分回温、反应过程中温度变化是否都达到试剂盒要求的反应条件、环境湿度过高或过低对微孔反应板也有较大的影响[6]。②反应时间。ELISA 中所加酶结合物浓度，与加酶结合物后孵育时间以及加底物后孵育时间等3个因素也是相互影响的。酶结合物浓度低，则要求孵育时间延长，而酶结合物浓度高则要求孵育时间缩短，可根据试验的具体情况，改变不同因素，以取得良好的结果[7]。③洗板。洗板不够充分或者洗板次数过多、洗板时间过长、甩板过干都会对检测结果有不同程度的影响。④仪器要求。清洁所用仪器如吸管、烧杯试管，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。⑤试验样品。血清、血浆或其他体液，均可作ELISA 的试验样品（标本）。不同样本的组成成分、理化性质都有较大区别，样品性质不同对酶联免疫反应的影响也各不相同。目前常规试验分析中所用的试剂盒是既定的，在实际工作中的检测人员操作娴熟、技术精湛，环境因素也比较稳定，在严格控制实验条件的情况下应按照试剂要求进行操作。对试验结果影响最大的是样品固有的理化性质[8]。 对样品进行pH值调节后进行分析可知，在试剂盒所推荐的适宜pH值范围内样品的检测结果受pH值影响的差异不显著，在试剂盒推荐的pH值范围以外每调高或调低1个pH值单位都会导致检测结果间产生显著差异。在实际检测过程中，若不调节样品的pH值直接进行检测可能无法反映样品中盐酸克伦特罗的实际含量。建议在用ELISA检测组织样品中克伦特罗含量时，一定要按照试剂盒推荐的范围内调节样品的pH值，以便得到可靠的检测结果。 参考文献： [1] 刘国艳，柴春彦.如何全面认识“瘦肉精”[J].动物科学与动物医学，2002，19（6）：1-3. [2] 张桂才，盐酸克伦特罗-违禁药品[J].湖南饲料，2001（3）：11. [3] 曾 芸，李 军. 克伦特罗的残留与危害[J].广西畜牧兽医， 2003（2）：93-95. [4] 徐国茂，胡翊炜，王 �，等. 盐酸克伦特罗检测中存在的问题[J].广东饲料，2007，16（3）：37-38. [5] 范 锋，毛爱民，倪谷间. 酶联免疫吸附法测定盐酸克伦特罗常见误差分析及解决对策[J].畜牧兽医杂志，2008，27（1）：28-29. [6] 贺 艳，郑文杰，刘 �，等. 酶联免疫法测定猪肉中克伦特罗残留量的测量不确定度评定[J].食品研究与开发，2009，30（4）：123-126. [7] 王 彪，王登临，兀 征，等. 猪尿液中盐酸克伦特罗的检测及分析[A].兽医药品学―2010 第三届中国兽药大会论文集[C].北京：中国畜牧兽医学会，2010. [8] 李华玮，李巧枝，卫 丽，等. ELISA 检测盐酸克伦特罗残留时的问题及控制对策[J].河南农业科学，2009（6）：144-146.
摘要：研究了不同pH值对ELISA法检测肌肉组织中盐酸克伦特罗结果的影响。结果表明，在一定pH值范围内瘦肉精含量与样品pH值呈极显著负相关关系；在试剂盒所对应的推荐pH值范围以内，样品pH值的变化对检测结果的影响较小，反之，样品pH值每调节1个单位所得的检测结果间差异显著。 关键词：pH值；肌肉；盐酸克伦特罗；ELISA 中图分类号：S859.84 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）02-0023-03 盐酸克伦特罗属于β-兴奋剂类药物，俗称瘦肉精，是一类高度选择性的兴奋剂和激素[1]，可提高动物胴体瘦肉率，近年来被一些人非法添加至饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物的生长[2]。人食用了盐酸克伦特罗残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、颤栗等症状，残留的盐酸克伦特罗可引起食物中毒，严重者可引起死亡，各国已明文禁止其使用[3]。 本试验主要研究样品不同pH值对ELISA检测结果的影响，为基层检测盐酸克伦特罗提供一定的参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料 新鲜精瘦牛肉样品来源于襄阳市云集、帝苑等农贸市场，选取29份样品进行试验分析。 1.2 主要试剂与仪器 克伦特罗（CLE）酶联免疫试剂盒购自北京维德维康生物技术有限公司，乙酸乙酯溶液、异丙醇溶液、高氯酸溶液、NaOH溶液均为市售； SUNRISE酶标仪购自帝肯（上海）贸易有限公司、电子天平购自梅特勒-托利多公司、单道及多道移液器购自芬兰百得实验室（仪器）有限公司。 1.3 试验方法 1.3.1 肌肉组织检测样品的制备 准确称取（2±0.01） g均质后的肉脯样品于50 mL离心管中；加入6 mL 0.2 mol/L高氯酸溶液，涡动至组织完全分散； 室温[（25±2） ℃]条件下，摇床300 r/min振摇20 min；8 000 r/min离心10 min；将全部上清液转入新的离心管中，用1 mol/L NaOH溶液调节pH至11.6；加入6 mL乙酸乙酯-异丙醇（3：1）溶液；室温[（25±2） ℃]条件下，摇床300 r/min振摇20 min；8 000 r/min离心10 min；取2 mL上层有机相于新的离心管中；50～60 ℃水浴中，氮气吹干；加入2 mL正己烷，高速涡动30 s， 加入1 mL样品稀释液，充分涡动1 min；8 000 r/min离心5 min，除去上层正己烷。调节样品溶液pH，制备不用pH样品的待检测样品。 1.3.2 ELISA检测不同pH样品盐酸克伦特罗 将所需的酶标板条插入酶标板架上，记录下标准品和样品的位置，建议均做平行实验；将20 μL各标准品工作液和不同pH样品溶液分别加入对应的标准品和样品孔中；在每个板孔中加入50 μL酶标Ⅱ抗工作液；在每个板孔中加入80 μL的抗体工作液；盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温[（25±2） ℃]下，避光反应40 min；揭开盖板膜；甩掉板孔中液体，在每个板孔加入260 μL洗涤工作液，浸泡30 s；再重复上一步骤3次；甩掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；立即在每个板孔中加入100 μL A、B（按体积比1：1）混合液；盖上盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温[（25±2） ℃]下，避光反应15～20 min；揭开盖板膜，在每个板孔中加入50 μL终止液，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀；用酶标仪在450 nm、630 nm下检测吸光度值，结果在5 min内读取。 1.3.3 数据统计 利用Excel 2003、RIDAWIN MFC Application和SPSS 17.0软件对数据进行处理。 2 结果与分析 2.1 不同pH值对肌肉组织中盐酸克伦特罗检测结果的影响 从29份样品中随机抽取2份样品的检测结果，不同pH条件下检测盐酸克伦特罗的结果见表1。 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P 从表1可以看出，试剂盒检测样品中盐酸克伦特罗含量受pH值影响的规律比较明显，随着pH值由低到高的变化，用ELISA试剂盒检测到肌肉组织中盐酸克伦特罗含量逐渐降低。 2.2 同一样品不同pH值与盐酸克伦特罗含量之间的相关性 利用SPSS 17.0 软件对检测数据进行处理，可得出表2、表3关系矩阵。从表2、表3可以看出，检测同一样品不同pH值条件下盐酸克伦特罗含量时，pH值与盐酸克伦特罗含量之间呈极显著负相关关系。 注：“**”表示在0.01的水平差异极显著（P 3 小结与讨论 ELISA检测技术在实际应用中简便易学，因而广泛应用于我们基层实验室。但其影响因素较多，主要有试剂盒因素和实际操作中的影响因素[4]。 影响试验结果的试剂盒因素主要有以下5点：①固相载体。可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，是进行酶标记测定的基本条件。②抗原。包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果均有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高，抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。③结合物。用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性。④洗涤剂与稀释剂。为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部分会从固相载体上被洗涤下来，从而很可能会使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质吸附到原来包被抗原凹孔的空白处，增加本底颜色，产生假阳性反应，这是限制ELISA 特异性的一个因素。⑤底物。各种酶都有对底物的特异性，所以使用不同种类的酶要求有不同的底物[5]。 实际操作中的影响因素主要有以下5 点：①环境温、湿度。ELISA 检测中所用试剂与酶的活性有很大关系，试剂盒在用于正式试验前是否充分回温、反应过程中温度变化是否都达到试剂盒要求的反应条件、环境湿度过高或过低对微孔反应板也有较大的影响[6]。②反应时间。ELISA 中所加酶结合物浓度，与加酶结合物后孵育时间以及加底物后孵育时间等3个因素也是相互影响的。酶结合物浓度低，则要求孵育时间延长，而酶结合物浓度高则要求孵育时间缩短，可根据试验的具体情况，改变不同因素，以取得良好的结果[7]。③洗板。洗板不够充分或者洗板次数过多、洗板时间过长、甩板过干都会对检测结果有不同程度的影响。④仪器要求。清洁所用仪器如吸管、烧杯试管，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。⑤试验样品。血清、血浆或其他体液，均可作ELISA 的试验样品（标本）。不同样本的组成成分、理化性质都有较大区别，样品性质不同对酶联免疫反应的影响也各不相同。目前常规试验分析中所用的试剂盒是既定的，在实际工作中的检测人员操作娴熟、技术精湛，环境因素也比较稳定，在严格控制实验条件的情况下应按照试剂要求进行操作。对试验结果影响最大的是样品固有的理化性质[8]。 对样品进行pH值调节后进行分析可知，在试剂盒所推荐的适宜pH值范围内样品的检测结果受pH值影响的差异不显著，在试剂盒推荐的pH值范围以外每调高或调低1个pH值单位都会导致检测结果间产生显著差异。在实际检测过程中，若不调节样品的pH值直接进行检测可能无法反映样品中盐酸克伦特罗的实际含量。建议在用ELISA检测组织样品中克伦特罗含量时，一定要按照试剂盒推荐的范围内调节样品的pH值，以便得到可靠的检测结果。 参考文献： [1] 刘国艳，柴春彦.如何全面认识“瘦肉精”[J].动物科学与动物医学，2002，19（6）：1-3. [2] 张桂才，盐酸克伦特罗-违禁药品[J].湖南饲料，2001（3）：11. [3] 曾 芸，李 军. 克伦特罗的残留与危害[J].广西畜牧兽医， 2003（2）：93-95. [4] 徐国茂，胡翊炜，王 �，等. 盐酸克伦特罗检测中存在的问题[J].广东饲料，2007，16（3）：37-38. [5] 范 锋，毛爱民，倪谷间. 酶联免疫吸附法测定盐酸克伦特罗常见误差分析及解决对策[J].畜牧兽医杂志，2008，27（1）：28-29. [6] 贺 艳，郑文杰，刘 �，等. 酶联免疫法测定猪肉中克伦特罗残留量的测量不确定度评定[J].食品研究与开发，2009，30（4）：123-126. [7] 王 彪，王登临，兀 征，等. 猪尿液中盐酸克伦特罗的检测及分析[A].兽医药品学―2010 第三届中国兽药大会论文集[C].北京：中国畜牧兽医学会，2010. [8] 李华玮，李巧枝，卫 丽，等. ELISA 检测盐酸克伦特罗残留时的问题及控制对策[J].河南农业科学，2009（6）：144-146.