516 2009, Vol. 30, No. 23
食品科学※专题论述
我国传统食品中乳酸菌资源的开发
李青青，陈启和，何国庆*，朱东升，穆 琳，叶雪飞
(浙江大学食品科学与营养系，浙江 杭州 310029)
摘 要：我国存在着丰富的乳酸菌资源，一些少数民族地区包括内蒙古、新疆、西藏、川西高原、青海等地的牧民仍然沿用传统而古老的方法来制造各种乳制品，包括酸牛乳、酸马奶、酸驼乳、马奶酒、开菲尔等，从而使当地自然环境中的有益微生物得到了很好的保存。泡菜、腌渍菜和腊肠也是蕴藏乳酸菌的良好载体。不同来源的制品中蕴藏着不同种类的乳酸菌，这很大程度上取决于制品的制作方法和地域。传统的乳酸菌鉴定方法主要是依据其形态学及生理生化特性进行，近年来采用分子生物学方法对乳酸菌进行鉴定已有较大进展。目前对传统食品中乳酸菌菌株的鉴定存在的最大问题就是缺乏一种通用的系统或平台来鉴定不同来源的乳酸菌。关键词：传统乳制品；乳酸菌；分离；鉴定
Diversity and Identification of Lactic Acid Bacteria in Chinese Traditional Foods
LI Qing-qing，CHEN Qi-he，HE Guo-qing*，ZHU Dong-sheng，MU Lin，YE Xue-fei(Department of Food Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
Abstract ：This review deals with recent research advances on the biodiversity of Chinese traditional foods lactic acid bacteria(LAB). Traditional foods like yoghourt, kumiss, kefir and fermented camel milk are abundant in LAB. The distribution of LABtaxa is highly variable from one traditional food to another. Isolation of LAB taxa mainly depends on the sample plating methods,incubation media and conditions. It is therefore difficult to define associations between population composition and either thetype of traditional food or the geographic location. Identification of isolated strains needs a ployphasic approach, including acombination of phenotypic and genotypic methods, among which the latter often based on the polymerase chain reaction (PCR)and encompassing 16S rRNA sequencing and DNA-DNA hybridizations. The main obstacle in current identification approachof LAB strains is the lack of a robust and exchangeable identification system for all LAB species. Some proposal are come up inthis paper : 1) to establish a reliable and scientific system in sample collection, strain isolation and identification. 2) to isolate newcharacteristic strains. 3) to explore and develop new products contained LAB. 4) to intensify the research on the function andmechanism of isolated strains.
Key words：traditional dairy foods；LAB ；isolation ；identification
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)23-0516-05
乳酸菌是指能够代谢糖类，产生大量乳酸的细菌的总称，是生产发酵乳制品(包括酸乳、发酵乳饮料、酸奶、发酵奶油和干酪) 必不可少的菌种。乳酸菌是重要的益生菌，具有改善肠道菌群，增强人体免疫力，抗肿瘤，降低血液胆固醇，降血压等功能[1]。因此，乳酸菌已经成为了现代食品工业重要的生产菌种。1873年，Lister 最先从酸乳中分离并研究了乳酸链球菌，将分离制得的纯乳酸菌作为发酵剂生产酸乳制品，从此开始了乳酸菌发酵剂的研究和应用。而我国针对乳酸菌的
研究起步较晚，与发达国家的研究水平已经有了相当大的差距。而缩短这一差距的根本在于研究和开发具有自主知识产权的高活性乳酸菌菌种和商品化发酵剂。我国幅员辽阔，具有丰富的乳酸菌资源，如何有效地开发我国现有的乳酸菌资源显得尤为重要。近年来，许多学者从我国各地的传统食品中分离到了诸多乳酸菌菌株。不同的地域，不同的食品，不同的分离以及鉴定方法所得到的乳酸菌菌种十分丰富。本文针对我国乳酸菌资源的分布，传统食品中乳酸菌的分离和鉴定现状进
收稿日期：2008-12-17
基金项目：浙江省重大课题攻关项目(2006C12005)
作者简介：李青青(1982－) ，女，博士研究生，主要从事益生菌相关研究。E-mail ：[email protected]*通讯作者：何国庆(1957－) ，男，教授，主要从事食品微生物及生物技术研究。E-mail ：[email protected]
※专题论述食品科学
2009, Vol. 30, No. 23517
行了综述，并且结合国外的一些研究，对我国传统食品中乳酸菌资源的开发提出了建议。1
我国乳酸菌资源的分布
表1 传统食品中的乳酸菌Table 1 LAB from traditional foods
传统食品
来源
分离菌株参考文献
Lactobacillus
Lactococcus 内蒙古
Bifidobacterium [2]Enterococcus Streptococcus
L.helveticus
L.casei subsp .pesudoplantarum L.delbrueckii subsp.bulgaricus
新疆
L.curvatus [3]
Ped.acidilactici 自然发酵乳
Ped.urinaeequi Enterococcus feacalis
川西高原
未鉴定
[4]
L.delbrueckii subsp .Lactis L.delbrueckii subsp .bulgaricus
L.acidophilus
青海
L.corynifonnis subsp.corynformis [5]
S.thermophilus Ped.Urindeequi
Leu.mesenteriodes subsp .mesenterriodes
马奶酒内蒙古
Lactococcus
[6]
L.delbrueckii subsp .delbrueckii L.delbrueckii subsp .bulgaricus
L.kefir L.acidophilus 开菲尔内蒙古E.feacalis [7]
E.feacium S.thermophilus L.lactis subsp .cermoris Leuconostoc mesenteroides泡菜市售Lactobacillus brevisLactobacillus planetarium[8]
L.brevis 淹渍菜市售L.plantarum L.fermentati [9]
Pediacoccus acidila发酵肉制品湖南Lactobacillus Lactococcus [10]青方腐乳北京Atopobium parvulus
L.plantarum [11]自然发酵黄豆酱黑龙江Tetragenococcus halophilus
[12]Lactobacillus 西藏雪莲
西藏
Bifidobacterium [13]
Lactococcus
我国是以大米和面粉为主食的国家，相对西方国家而言，乳制品不属于人们的日常饮食。但是在我国一些
少数民族地区包括内蒙、西藏、新疆、青海和四川甘孜州等地的居民，仍然沿用传统而古老的方法来制造各种乳制品，包括酸马奶、酸驼乳、山羊乳、马奶酒、开菲尔等，从而使当地自然环境中的有益微生物得到了很好的保存。泡菜是我国传统的食品之一，至今仍沿袭着传统的发酵方式，丰富的泡菜资源也是蕴藏乳酸菌的良好载体。诸多学者从不同来源的发酵食品中分离得到了大量的乳酸菌，选出几种有代表性列出见表1。
由表1可知，我国存在着丰富的乳酸菌资源。由传统食品中可以分离到乳品工业常用的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus ) 、嗜热链球菌(S.thermophilus ) 、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)和凯氏乳杆菌(L.casei ) 。不同地区的乳制品中的优势菌种有所不同，张文羿等[5]自青海传统发酵山羊乳中所分离得到的乳酸菌菌株中，L.delbrueckii 占33%，S.themophilus 占被鉴定乳酸菌的36%，为样品中的优势菌种。而袁清珠等[14]从内蒙古牧民家中所采集的绵山羊乳中分离得到的63株乳酸菌菌株中，乳球菌属7株，肠球菌属53株为乳样品中的优势菌种。孙天松等[3]在新疆和蒙古国采集的四份酸驼乳中分离得到的10株乳酸菌，经鉴定10株(77%)为乳杆菌，3株(23%)为乳球菌。新疆的2份样品中只分离到乳杆菌，蒙古的1份样品中仅有乳球菌，另1份样品中既有乳杆菌又有乳球菌。自然发酵泡菜中大多以乳杆菌和肠膜明串珠菌为优势菌株。Miyamoto 等[15]自哈尔滨传统发酵的酸菜中分离得到一株新型的乳酸菌，经鉴定后将其命名为Lactobacillus harbinensis sp nov。
张和平等自1994年以来，从内蒙、西藏等地的乳制品中分离筛选到了2000多株乳酸菌菌株，并建立了我国第一个具有自主知识产权的乳酸菌资源库。但是，到目前为止，仍然有很多潜在的乳酸菌资源尚未得到开发。2
传统食品中乳酸菌的分离2.1
样品的处理
在对传统食品中的乳酸菌进行分离时，第一步就是要对所采取的样品进行处理。对于样品的稀释或者浸泡用液，不同的研究者采取了不同的方式。应用最广的是0.1%蛋白胨溶液或者0.1%蛋白胨和0.85%生理盐水的混合溶液。Collins 等[16]对以下几种稀释液对乳制品中双歧杆菌的分离计数结果的影响做了研究：0. 9%生理盐水、0. 1%蛋白胨溶液、0. 9%生理盐水＋0. 1%蛋白胨溶液、生理盐水＋蛋白胨缓冲液＋0.03%KH2PO 4+0.06%Na2HPO 4。结果表明，0.1%的蛋白胨溶液效果最好，其他的几种稀释液所分离得到的双歧杆菌数目是0.1%蛋白胨溶液的70%。Hartemink 等[17]研究了生理盐水和低生理盐水(生理盐水＋0.5g/L半胱氨酸＋HCl ，pH6.7) 等稀释液对检测肠道中菌落总数的影响，结果表明这两种稀释液为最佳。
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食品科学※专题论述
除了双歧杆菌外，大多的乳酸菌属于兼性厌氧菌。但是，在有氧及无氧条件下对样品进行稀释或者浸泡处理均对分离结果无太大影响，只是接种后的平板应当迅速置于无氧条件下进行培养。2.2
分离方法
对于益生菌的分离方法有很多种。有时候一种培养基能分离出所有的益生菌；但有的时候某一种特定的培养基只能分离出一种特定的益生菌；或者某种特异的益生菌只能在某一种培养基上生长。如何针对不同的食品，来选择最佳的分离方法则要考虑益生菌的耐氧性、营养需求、抗生素敏感性等。对于分离得到的菌株要进行更进一步的筛选则需要对其菌落特性进行分析。2.2.1
培养基
表2 用于筛选不同乳酸菌的培养基
[18]
Table 2 Culture mediums for screening different LAB[18]
乳酸菌种类培养基M17嗜热链球菌
PCMA S T
保加利亚乳杆菌
MRS
reinforced clostridial agar(pH5.5)
MRS-maltose
EC
嗜酸乳杆菌
MRS-trehalose
TPPY MRS-bile X GluBL-NPNL MRS-MPNL 双歧杆菌
TPY-NPNL MRS-Dicloxacillin TPY-Dicloxacillin
BFM
同一种传统的乳制品中常常含有多种乳酸菌。现代乳品工业中应用最广泛的乳酸菌包括保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等，MR S 培养基是在对传统乳制品中乳酸菌的分离时使用最为广泛的培养基，但是几乎所有的乳酸菌都能在这种培养基中生长，仅仅通过菌落特征很难将所有的乳酸菌都区分开来。表2中列出了适合不同乳酸菌生长的一些选择性培养基。MRS 和reinforced clostridial agar(pH5.5)通常被用于分离保加利亚乳杆菌，而M17和PCMA(pH7)通常被用于分离嗜热链球菌。其中MRS 和M17是IDF(1988)规定在乳制品工业中对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行分离计数时使用的培养基。用于分离嗜酸乳杆菌的培养基有MRS-麦芽糖培养基、T P P Y 、E C 培养基等。通常采用需氧培养来将嗜酸乳杆菌和双歧杆菌分离开来，但是表中所列出的一些培养基很难将嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌分离开来。表2还列出了用于分离乳制品中
双歧杆菌的一些培养基。这些培养基中都加入了某些能够降低培养基氧化还原电势的物质，比如说半胱氨酸、抗坏血酸和亚硫酸钠；或者在培养基中加入某些抗生素来抑制其他乳酸菌的生长；或者加入马血或者羊血来促进双歧杆菌的生长。B L -N P L N (包括新霉素、巴龙霉素、萘啶酸和氯化铝) 是迄今为止筛选双歧杆菌最有效的培养基[19]，但是该培养基的配制过程复杂。有学者对双氯青霉素在双歧杆菌的筛选中的应用进行了研究[20]，结果表明，在TPY 琼脂中添加2μg/ml的双氯青霉素具有与NPLN 相同的作用。2.2.2
分离条件
培养基是传统食品中乳酸菌分离的重要决定因素，但是分离条件同样在很大程度上也影响分离结果[21]。一些新的乳酸菌菌株就是在前人研究的基础上改变分离条件所获得的。Ehrmann 等[22]在分离L.pontis 时所使用的改良MRS 培养基的基础上添加果糖和麦芽糖，30℃，厌氧条件下，分离得到了另外的菌株L. m i n d e n s i s 。L.rossiae [23]的分离条件是：MRS 琼脂中分别添加1%麦芽糖和10%酵母提取物，初始pH 值5.6，30℃，好氧。L.acidifarinae [24]的分离条件为：MRS 琼脂中添加1%的麦芽糖和果糖、0.1%环己酰亚胺，初始pH 值5.4，37℃，好氧。用19种培养基在不同条件下对几种乳酸菌进行分别计数的研究显示，用MRS-万古霉素琼脂培养基，在43℃，厌氧条件下最适合于分离L.rhamnosus ，而当其他条件不变，仅仅将培养温度改为37℃便可以分离出L. c a s e i 。由此可见，培养温度、初始p H 值、氧气的需求量等是影响分离结果的主要因素。在对传统食品中的乳酸菌进行分离时，应当把分离条件作为一个重要的实验因素进行设计。3
乳酸菌的鉴定
对分离得到的单一乳酸菌菌落，应当首先根据其菌落特征及生理生化特性进行初步鉴定，然后采用分子生物学方法更进一步进行鉴定。目前国内的研究中，对传统食品中分离得到的乳酸菌进行鉴定时，通常是依据其形态学及生理生化等特性进行。由于乳酸菌大多属于兼性厌氧菌，且其营养要求的复杂性，采用单纯的糖发酵等特性无法区分生化性状相近的乳酸菌菌种。由于传统食品是一个复杂的生境系统，其中可能会存在许多人们尚未发现过的乳酸菌菌种，如何对一种新型的乳酸菌菌种进行描述与鉴定不是传统的鉴定方法所能解决的。国外的研究通常是采用分子生物学的方法来对分离自传统食品中的乳酸菌进行鉴定。3.1
常用于鉴定乳酸菌的分子生物学方法
常用于鉴定乳酸菌的分子生物学方法包括：PCR 技术、DNA-DNA 杂交技术、遗传标记技术等。PCR 技
※专题论述食品科学
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术是近年来发展起来的一项新的分子遗传学技术，是基于天然DNA 复制规律而设计的一种特异性DNA 靶序列体外扩增方法。许多其他的分子生物学鉴定方法都是基于PCR 技术而进行的。DNA-DNA 分子杂交方法是将待测菌株DNA 解链，通过测定待测菌株与参照菌株间的DNA 同源性来进行鉴定。遗传标记指受基因控制的能够稳定遗传的且能代表个体或者群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质。常用的遗传标记技术有：限制性片段长度多态性(RFLP，restriction fragment lengthpolymorphism) 、扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified Fragment Length Polymorphism)、末端限制性片断长度多态性(T-RFLP，Terminal Restriction Fragment lengthPolymorphism) 、随机扩增多态性DNA(RAPD，random amplified polymorhpic DNA) 。根据不同来源的乳酸菌可以选取某一种鉴定方法或者几种方法同时采用。3.2
现用鉴定方法存在的问题
目前，对传统食品中乳酸菌菌株的鉴定存在的最大问题就是：缺乏一种通用的系统或平台来鉴定不同来源的乳酸菌[21]。根据基因序列相似性来进行鉴定的一些方法需要使用已知基因序列的参照菌株与待测菌株进行对比来进行鉴定。由于不同的实验室所采用的参照菌株的不同，可能会导致鉴定结果的不同，同时，由于这些方法操作的复杂性，在不同实验室采用同样的方法可能会产生不同的鉴定结果。Cachat 等[25]用DNA-DNA 杂交技术对分离自麦芽威士忌酒蒸馏车间的一株乳酸菌(L.suntoryeus ) 进行鉴定时表明，与该菌的遗传特性最为相似的两株菌是L.helveticus 和L.gallinarum (43%)，而Naser 等[26]的研究则表明与L.helveticus 的相似度为70%。d e V u y s t a 等[21]在研究中发现L. k i m c h i i y u 与L.paralimentarius 的DNA 相似度为68%，但是很难更进一步将两种菌区分开来。3.3
新的鉴定技术
多位点序列分析法(Multi-locus sequence analysis，M L S A ) 是近年来发展起来的一种新的细菌鉴定方法。Naser 等
[26]
采用MLSA 对已知的肠球菌(Enterococcus ) 进
行了鉴定，结果表明，这种新的鉴定方法能将16S rRNA 序列几乎相同的乳酸菌区分开来。Naser 等[26]和Svec 等
[27]
分别证实了用MLSA 对一些新的菌株进行鉴定
时十分有效。4
结 语
我国幅员辽阔，物质资源丰富。除了目前已经分离得到的乳酸菌资源，在我国范围内，仍然有许多地域的传统发酵食品中的乳酸菌尚未被开发。比如说西藏干酪、曲拉、奶渣等。开菲尔是近年来国际上研究的热点，国外许多学者从开菲尔中分离得到了许多优良的
乳酸菌菌株，我国的蒙古是盛产开菲尔的区域之一，未来可以利用这一资源，开发更多的优良菌株。
针对我国传统食品中乳酸菌资源的开发提出以下几项建议：1) 建立科学的采样、分离与鉴定方法。针对我国独特的地理环境，对不同区域的传统食品进行科学采样，分离鉴定并比较不同区域食品中乳酸菌的分布，建立具有自主知识产权的乳酸菌资源库。2) 筛选具有特异性的新菌株。如针对不同肠道消化道区域需要不同的菌株；或者特别对某些疾病有功效的菌株；筛选具有良好加工性能的菌株如耐氧性双歧杆菌。3) 开发添加来自传统食品中的优良乳酸菌菌株的新型产品。目前乳酸菌多数用于乳制品，婴儿配方、幼儿食品、发酵果汁、发酵豆制品及特定医疗食品等将是添加乳酸菌的新功能食品。4) 对分离得到的乳酸菌的功能性进行研究。有许多研究表明，牧民们常年食用的各种发酵乳，对肺结核、肠胃炎、心血管等疾病有治疗作用，尽管有人认为这可能与发酵酸奶中的益生菌有关，但是其治病机理尚未阐明。目前针对益生菌功能性的研究大多基于体外或动物试验，分离自传统发酵乳制品中的乳酸菌的益生功能应当进行更进一步的人体实验，以期对其功能性有更多的了解。
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摘 要：我国存在着丰富的乳酸菌资源，一些少数民族地区包括内蒙古、新疆、西藏、川西高原、青海等地的牧民仍然沿用传统而古老的方法来制造各种乳制品，包括酸牛乳、酸马奶、酸驼乳、马奶酒、开菲尔等，从而使当地自然环境中的有益微生物得到了很好的保存。泡菜、腌渍菜和腊肠也是蕴藏乳酸菌的良好载体。不同来源的制品中蕴藏着不同种类的乳酸菌，这很大程度上取决于制品的制作方法和地域。传统的乳酸菌鉴定方法主要是依据其形态学及生理生化特性进行，近年来采用分子生物学方法对乳酸菌进行鉴定已有较大进展。目前对传统食品中乳酸菌菌株的鉴定存在的最大问题就是缺乏一种通用的系统或平台来鉴定不同来源的乳酸菌。关键词：传统乳制品；乳酸菌；分离；鉴定
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Abstract ：This review deals with recent research advances on the biodiversity of Chinese traditional foods lactic acid bacteria(LAB). Traditional foods like yoghourt, kumiss, kefir and fermented camel milk are abundant in LAB. The distribution of LABtaxa is highly variable from one traditional food to another. Isolation of LAB taxa mainly depends on the sample plating methods,incubation media and conditions. It is therefore difficult to define associations between population composition and either thetype of traditional food or the geographic location. Identification of isolated strains needs a ployphasic approach, including acombination of phenotypic and genotypic methods, among which the latter often based on the polymerase chain reaction (PCR)and encompassing 16S rRNA sequencing and DNA-DNA hybridizations. The main obstacle in current identification approachof LAB strains is the lack of a robust and exchangeable identification system for all LAB species. Some proposal are come up inthis paper : 1) to establish a reliable and scientific system in sample collection, strain isolation and identification. 2) to isolate newcharacteristic strains. 3) to explore and develop new products contained LAB. 4) to intensify the research on the function andmechanism of isolated strains.
Key words：traditional dairy foods；LAB ；isolation ；identification
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)23-0516-05
乳酸菌是指能够代谢糖类，产生大量乳酸的细菌的总称，是生产发酵乳制品(包括酸乳、发酵乳饮料、酸奶、发酵奶油和干酪) 必不可少的菌种。乳酸菌是重要的益生菌，具有改善肠道菌群，增强人体免疫力，抗肿瘤，降低血液胆固醇，降血压等功能[1]。因此，乳酸菌已经成为了现代食品工业重要的生产菌种。1873年，Lister 最先从酸乳中分离并研究了乳酸链球菌，将分离制得的纯乳酸菌作为发酵剂生产酸乳制品，从此开始了乳酸菌发酵剂的研究和应用。而我国针对乳酸菌的
研究起步较晚，与发达国家的研究水平已经有了相当大的差距。而缩短这一差距的根本在于研究和开发具有自主知识产权的高活性乳酸菌菌种和商品化发酵剂。我国幅员辽阔，具有丰富的乳酸菌资源，如何有效地开发我国现有的乳酸菌资源显得尤为重要。近年来，许多学者从我国各地的传统食品中分离到了诸多乳酸菌菌株。不同的地域，不同的食品，不同的分离以及鉴定方法所得到的乳酸菌菌种十分丰富。本文针对我国乳酸菌资源的分布，传统食品中乳酸菌的分离和鉴定现状进
收稿日期：2008-12-17
基金项目：浙江省重大课题攻关项目(2006C12005)
作者简介：李青青(1982－) ，女，博士研究生，主要从事益生菌相关研究。E-mail ：[email protected]*通讯作者：何国庆(1957－) ，男，教授，主要从事食品微生物及生物技术研究。E-mail ：[email protected]
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我国乳酸菌资源的分布
表1 传统食品中的乳酸菌Table 1 LAB from traditional foods
传统食品
来源
分离菌株参考文献
Lactobacillus
Lactococcus 内蒙古
Bifidobacterium [2]Enterococcus Streptococcus
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L.casei subsp .pesudoplantarum L.delbrueckii subsp.bulgaricus
新疆
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Ped.urinaeequi Enterococcus feacalis
川西高原
未鉴定
[4]
L.delbrueckii subsp .Lactis L.delbrueckii subsp .bulgaricus
L.acidophilus
青海
L.corynifonnis subsp.corynformis [5]
S.thermophilus Ped.Urindeequi
Leu.mesenteriodes subsp .mesenterriodes
马奶酒内蒙古
Lactococcus
[6]
L.delbrueckii subsp .delbrueckii L.delbrueckii subsp .bulgaricus
L.kefir L.acidophilus 开菲尔内蒙古E.feacalis [7]
E.feacium S.thermophilus L.lactis subsp .cermoris Leuconostoc mesenteroides泡菜市售Lactobacillus brevisLactobacillus planetarium[8]
L.brevis 淹渍菜市售L.plantarum L.fermentati [9]
Pediacoccus acidila发酵肉制品湖南Lactobacillus Lactococcus [10]青方腐乳北京Atopobium parvulus
L.plantarum [11]自然发酵黄豆酱黑龙江Tetragenococcus halophilus
[12]Lactobacillus 西藏雪莲
西藏
Bifidobacterium [13]
Lactococcus
我国是以大米和面粉为主食的国家，相对西方国家而言，乳制品不属于人们的日常饮食。但是在我国一些
少数民族地区包括内蒙、西藏、新疆、青海和四川甘孜州等地的居民，仍然沿用传统而古老的方法来制造各种乳制品，包括酸马奶、酸驼乳、山羊乳、马奶酒、开菲尔等，从而使当地自然环境中的有益微生物得到了很好的保存。泡菜是我国传统的食品之一，至今仍沿袭着传统的发酵方式，丰富的泡菜资源也是蕴藏乳酸菌的良好载体。诸多学者从不同来源的发酵食品中分离得到了大量的乳酸菌，选出几种有代表性列出见表1。
由表1可知，我国存在着丰富的乳酸菌资源。由传统食品中可以分离到乳品工业常用的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus ) 、嗜热链球菌(S.thermophilus ) 、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)和凯氏乳杆菌(L.casei ) 。不同地区的乳制品中的优势菌种有所不同，张文羿等[5]自青海传统发酵山羊乳中所分离得到的乳酸菌菌株中，L.delbrueckii 占33%，S.themophilus 占被鉴定乳酸菌的36%，为样品中的优势菌种。而袁清珠等[14]从内蒙古牧民家中所采集的绵山羊乳中分离得到的63株乳酸菌菌株中，乳球菌属7株，肠球菌属53株为乳样品中的优势菌种。孙天松等[3]在新疆和蒙古国采集的四份酸驼乳中分离得到的10株乳酸菌，经鉴定10株(77%)为乳杆菌，3株(23%)为乳球菌。新疆的2份样品中只分离到乳杆菌，蒙古的1份样品中仅有乳球菌，另1份样品中既有乳杆菌又有乳球菌。自然发酵泡菜中大多以乳杆菌和肠膜明串珠菌为优势菌株。Miyamoto 等[15]自哈尔滨传统发酵的酸菜中分离得到一株新型的乳酸菌，经鉴定后将其命名为Lactobacillus harbinensis sp nov。
张和平等自1994年以来，从内蒙、西藏等地的乳制品中分离筛选到了2000多株乳酸菌菌株，并建立了我国第一个具有自主知识产权的乳酸菌资源库。但是，到目前为止，仍然有很多潜在的乳酸菌资源尚未得到开发。2
传统食品中乳酸菌的分离2.1
样品的处理
在对传统食品中的乳酸菌进行分离时，第一步就是要对所采取的样品进行处理。对于样品的稀释或者浸泡用液，不同的研究者采取了不同的方式。应用最广的是0.1%蛋白胨溶液或者0.1%蛋白胨和0.85%生理盐水的混合溶液。Collins 等[16]对以下几种稀释液对乳制品中双歧杆菌的分离计数结果的影响做了研究：0. 9%生理盐水、0. 1%蛋白胨溶液、0. 9%生理盐水＋0. 1%蛋白胨溶液、生理盐水＋蛋白胨缓冲液＋0.03%KH2PO 4+0.06%Na2HPO 4。结果表明，0.1%的蛋白胨溶液效果最好，其他的几种稀释液所分离得到的双歧杆菌数目是0.1%蛋白胨溶液的70%。Hartemink 等[17]研究了生理盐水和低生理盐水(生理盐水＋0.5g/L半胱氨酸＋HCl ，pH6.7) 等稀释液对检测肠道中菌落总数的影响，结果表明这两种稀释液为最佳。
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食品科学※专题论述
除了双歧杆菌外，大多的乳酸菌属于兼性厌氧菌。但是，在有氧及无氧条件下对样品进行稀释或者浸泡处理均对分离结果无太大影响，只是接种后的平板应当迅速置于无氧条件下进行培养。2.2
分离方法
对于益生菌的分离方法有很多种。有时候一种培养基能分离出所有的益生菌；但有的时候某一种特定的培养基只能分离出一种特定的益生菌；或者某种特异的益生菌只能在某一种培养基上生长。如何针对不同的食品，来选择最佳的分离方法则要考虑益生菌的耐氧性、营养需求、抗生素敏感性等。对于分离得到的菌株要进行更进一步的筛选则需要对其菌落特性进行分析。2.2.1
培养基
表2 用于筛选不同乳酸菌的培养基
[18]
Table 2 Culture mediums for screening different LAB[18]
乳酸菌种类培养基M17嗜热链球菌
PCMA S T
保加利亚乳杆菌
MRS
reinforced clostridial agar(pH5.5)
MRS-maltose
EC
嗜酸乳杆菌
MRS-trehalose
TPPY MRS-bile X GluBL-NPNL MRS-MPNL 双歧杆菌
TPY-NPNL MRS-Dicloxacillin TPY-Dicloxacillin
BFM
同一种传统的乳制品中常常含有多种乳酸菌。现代乳品工业中应用最广泛的乳酸菌包括保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等，MR S 培养基是在对传统乳制品中乳酸菌的分离时使用最为广泛的培养基，但是几乎所有的乳酸菌都能在这种培养基中生长，仅仅通过菌落特征很难将所有的乳酸菌都区分开来。表2中列出了适合不同乳酸菌生长的一些选择性培养基。MRS 和reinforced clostridial agar(pH5.5)通常被用于分离保加利亚乳杆菌，而M17和PCMA(pH7)通常被用于分离嗜热链球菌。其中MRS 和M17是IDF(1988)规定在乳制品工业中对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行分离计数时使用的培养基。用于分离嗜酸乳杆菌的培养基有MRS-麦芽糖培养基、T P P Y 、E C 培养基等。通常采用需氧培养来将嗜酸乳杆菌和双歧杆菌分离开来，但是表中所列出的一些培养基很难将嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌分离开来。表2还列出了用于分离乳制品中
双歧杆菌的一些培养基。这些培养基中都加入了某些能够降低培养基氧化还原电势的物质，比如说半胱氨酸、抗坏血酸和亚硫酸钠；或者在培养基中加入某些抗生素来抑制其他乳酸菌的生长；或者加入马血或者羊血来促进双歧杆菌的生长。B L -N P L N (包括新霉素、巴龙霉素、萘啶酸和氯化铝) 是迄今为止筛选双歧杆菌最有效的培养基[19]，但是该培养基的配制过程复杂。有学者对双氯青霉素在双歧杆菌的筛选中的应用进行了研究[20]，结果表明，在TPY 琼脂中添加2μg/ml的双氯青霉素具有与NPLN 相同的作用。2.2.2
分离条件
培养基是传统食品中乳酸菌分离的重要决定因素，但是分离条件同样在很大程度上也影响分离结果[21]。一些新的乳酸菌菌株就是在前人研究的基础上改变分离条件所获得的。Ehrmann 等[22]在分离L.pontis 时所使用的改良MRS 培养基的基础上添加果糖和麦芽糖，30℃，厌氧条件下，分离得到了另外的菌株L. m i n d e n s i s 。L.rossiae [23]的分离条件是：MRS 琼脂中分别添加1%麦芽糖和10%酵母提取物，初始pH 值5.6，30℃，好氧。L.acidifarinae [24]的分离条件为：MRS 琼脂中添加1%的麦芽糖和果糖、0.1%环己酰亚胺，初始pH 值5.4，37℃，好氧。用19种培养基在不同条件下对几种乳酸菌进行分别计数的研究显示，用MRS-万古霉素琼脂培养基，在43℃，厌氧条件下最适合于分离L.rhamnosus ，而当其他条件不变，仅仅将培养温度改为37℃便可以分离出L. c a s e i 。由此可见，培养温度、初始p H 值、氧气的需求量等是影响分离结果的主要因素。在对传统食品中的乳酸菌进行分离时，应当把分离条件作为一个重要的实验因素进行设计。3
乳酸菌的鉴定
对分离得到的单一乳酸菌菌落，应当首先根据其菌落特征及生理生化特性进行初步鉴定，然后采用分子生物学方法更进一步进行鉴定。目前国内的研究中，对传统食品中分离得到的乳酸菌进行鉴定时，通常是依据其形态学及生理生化等特性进行。由于乳酸菌大多属于兼性厌氧菌，且其营养要求的复杂性，采用单纯的糖发酵等特性无法区分生化性状相近的乳酸菌菌种。由于传统食品是一个复杂的生境系统，其中可能会存在许多人们尚未发现过的乳酸菌菌种，如何对一种新型的乳酸菌菌种进行描述与鉴定不是传统的鉴定方法所能解决的。国外的研究通常是采用分子生物学的方法来对分离自传统食品中的乳酸菌进行鉴定。3.1
常用于鉴定乳酸菌的分子生物学方法
常用于鉴定乳酸菌的分子生物学方法包括：PCR 技术、DNA-DNA 杂交技术、遗传标记技术等。PCR 技
※专题论述食品科学
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术是近年来发展起来的一项新的分子遗传学技术，是基于天然DNA 复制规律而设计的一种特异性DNA 靶序列体外扩增方法。许多其他的分子生物学鉴定方法都是基于PCR 技术而进行的。DNA-DNA 分子杂交方法是将待测菌株DNA 解链，通过测定待测菌株与参照菌株间的DNA 同源性来进行鉴定。遗传标记指受基因控制的能够稳定遗传的且能代表个体或者群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质。常用的遗传标记技术有：限制性片段长度多态性(RFLP，restriction fragment lengthpolymorphism) 、扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified Fragment Length Polymorphism)、末端限制性片断长度多态性(T-RFLP，Terminal Restriction Fragment lengthPolymorphism) 、随机扩增多态性DNA(RAPD，random amplified polymorhpic DNA) 。根据不同来源的乳酸菌可以选取某一种鉴定方法或者几种方法同时采用。3.2
现用鉴定方法存在的问题
目前，对传统食品中乳酸菌菌株的鉴定存在的最大问题就是：缺乏一种通用的系统或平台来鉴定不同来源的乳酸菌[21]。根据基因序列相似性来进行鉴定的一些方法需要使用已知基因序列的参照菌株与待测菌株进行对比来进行鉴定。由于不同的实验室所采用的参照菌株的不同，可能会导致鉴定结果的不同，同时，由于这些方法操作的复杂性，在不同实验室采用同样的方法可能会产生不同的鉴定结果。Cachat 等[25]用DNA-DNA 杂交技术对分离自麦芽威士忌酒蒸馏车间的一株乳酸菌(L.suntoryeus ) 进行鉴定时表明，与该菌的遗传特性最为相似的两株菌是L.helveticus 和L.gallinarum (43%)，而Naser 等[26]的研究则表明与L.helveticus 的相似度为70%。d e V u y s t a 等[21]在研究中发现L. k i m c h i i y u 与L.paralimentarius 的DNA 相似度为68%，但是很难更进一步将两种菌区分开来。3.3
新的鉴定技术
多位点序列分析法(Multi-locus sequence analysis，M L S A ) 是近年来发展起来的一种新的细菌鉴定方法。Naser 等
[26]
采用MLSA 对已知的肠球菌(Enterococcus ) 进
行了鉴定，结果表明，这种新的鉴定方法能将16S rRNA 序列几乎相同的乳酸菌区分开来。Naser 等[26]和Svec 等
[27]
分别证实了用MLSA 对一些新的菌株进行鉴定
时十分有效。4
结 语
我国幅员辽阔，物质资源丰富。除了目前已经分离得到的乳酸菌资源，在我国范围内，仍然有许多地域的传统发酵食品中的乳酸菌尚未被开发。比如说西藏干酪、曲拉、奶渣等。开菲尔是近年来国际上研究的热点，国外许多学者从开菲尔中分离得到了许多优良的
乳酸菌菌株，我国的蒙古是盛产开菲尔的区域之一，未来可以利用这一资源，开发更多的优良菌株。
针对我国传统食品中乳酸菌资源的开发提出以下几项建议：1) 建立科学的采样、分离与鉴定方法。针对我国独特的地理环境，对不同区域的传统食品进行科学采样，分离鉴定并比较不同区域食品中乳酸菌的分布，建立具有自主知识产权的乳酸菌资源库。2) 筛选具有特异性的新菌株。如针对不同肠道消化道区域需要不同的菌株；或者特别对某些疾病有功效的菌株；筛选具有良好加工性能的菌株如耐氧性双歧杆菌。3) 开发添加来自传统食品中的优良乳酸菌菌株的新型产品。目前乳酸菌多数用于乳制品，婴儿配方、幼儿食品、发酵果汁、发酵豆制品及特定医疗食品等将是添加乳酸菌的新功能食品。4) 对分离得到的乳酸菌的功能性进行研究。有许多研究表明，牧民们常年食用的各种发酵乳，对肺结核、肠胃炎、心血管等疾病有治疗作用，尽管有人认为这可能与发酵酸奶中的益生菌有关，但是其治病机理尚未阐明。目前针对益生菌功能性的研究大多基于体外或动物试验，分离自传统发酵乳制品中的乳酸菌的益生功能应当进行更进一步的人体实验，以期对其功能性有更多的了解。
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