第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005
除虫菊愈伤组织的诱导与继代培养
李小六，李艳梅，陈 超，田立民
（唐山师范学院 生物科学技术系，河北 唐山 063000）
摘 要：诱导除虫菊愈伤组织，结果显示：除虫菊愈伤组织从第8d 开始迅速生长，20d 达到最大生长量；并
对除虫菊愈伤组织继代培养条件进行了探讨。
关键词：除虫菊；愈伤组织诱导；继代培养
中图分类号：Q949.9 文献标识码：A 文章编号：1009-9115（2005）02-0001-03
从除虫菊经提取和加工后获得的天然除虫菊酯农药，具有起效快、作用广谱、药物残留低、对人畜无害等优点, 是世界公认的。目前天然除虫菊酯主要从除虫菊干花中提取，[1]由于近几年世界范围内除虫菊花市场供应短缺，造成其市场价格上扬，难以满足市场需求。本文以除虫菊花蕾为材料，诱导愈伤组织，并进行继代培养，并对愈伤组织细胞生长的优化条件作了探讨，目的是为用植物生物反应器建立大规模除虫菊细胞培养体系，[2][3][4]大量生产除虫菊酯等杀虫成分，进而工厂化生产天然除虫菊酯杀虫剂。 1 材料和方法
1.1 材料
除虫菊（Pyrethrum Cinerariifolium）未成熟花蕾。
1.2 方法
1.2.1 培养条件
琼脂5 g·L-1 。 初始诱导培养基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+ 0.1 mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，
继代培养基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+ 0.1 mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，琼脂5 g·L-1，pH 为5.8，培养温度为25～27℃，光照强度为2 000～2 500lx，光照时间12h·d-1。
1.2.2 诱导方法
取除虫菊（Pyrethrum Cinerariifolium）未成熟花蕾，于4℃下处理24 h，70%乙醇消毒30 s，再转入0.1％HgCl 2溶液中消毒5 min，无菌水冲洗3～4次，剥去花萼后接种于初始诱导培养基。
1.2.3 继代培养
（1）继代接种方法 选取典型活性的愈伤组织，在无菌条件下称取0.1g ，用镊子接种于100ml 的三角瓶固体培养基上，均分为7～10块，轻轻按压，使愈伤组织和培养基充分接触。
（2）细胞生长量测定 采用细胞鲜重法，将收获的愈伤组织称重得鲜重（DW ），减去接种量0.1g ，即得愈伤组织总生长量。测定细胞生长曲线，一次性接种150瓶，从第二天开始，每次随机取10瓶，每2天测定一次除虫菊愈伤组织总细胞生长量，进行除虫菊愈伤组织生长曲线的测定（测定到第30d ）。[2]
（3）继代培养基的优化 在我们以往工作的基础上，对2,4-D 、NAA 、6-BA 、蔗糖4个因素3个水平进行正交试验，[5]正交实验的因素水平表见表1。
1.2.4 培养条件
1.2.4.1 温度对愈伤组织生长的影响
选取适于愈伤组织继代培养的培养基，将温度设为23℃、25℃、27℃、29℃共4个处理（每个处理6个重复），光照强度均为2 500lx，分别进行试验，各处理在开始褐化时收获测定总生长量。
──────────
基金项目：唐山市科技局硕博基金（02813031A-4）
收稿日期：2004-11-01
作者简介：李小六（1971-），男，河南确山人，唐山师范学院生物科学技术系讲师，理学硕士。 - 1 -
第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年第2期
1.2.4.2 光照时间对愈伤组织生长的影响
选取适于愈伤组织继代培养的培养基，将光照时间设为4h/d、8h/d、12h/d、16h/d共4个处理（光照强度均为2 500lx），温度为27℃分别进行试验，各处理在开始褐化时收获测定总生长量。
1.2.4.3 pH 对愈伤组织生长的影响
选取适于愈伤组织继代培养的培养基，将pH 设为5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，光照时间12h/d（光照强度均为2 500lx），温度为27℃，分别进行试验，各处理在开始褐化时收获测定总生长量。
表1 正交实验因素水平
因 素
水 平 A B C D
2,4-D NAA 6-BA Sucrose
1
2
3 2 0.1 0.1 20 000 3 0.3 0.2 30 000 4 0.6 0.3 40 000
2 结果与讨论
2.1 除虫菊花蕾愈伤组织的诱导及细胞形态学观察
花蕾接入后，4～8d 开始出现愈伤组织，15d 后愈伤组织大量形成，初期生长缓慢，转入继代培养基后，愈伤组织生长加快，1mon 后可以增重数倍，愈伤组织（图1-a ）黄色或淡黄色，细胞大多为圆形，细胞之间联系紧密，多个细胞成为细胞团（图1-b ）。30~40d后，继代培养的愈伤组织开始出现不同程度的褐化，每隔20d 继代一次。
图1 除虫菊愈伤组织及细胞形态 a ：除虫菊花蕾诱导的愈伤组织 b ：除虫菊愈伤组织的小细胞团
(600X)
总生长量（g /瓶) b 2.2 除虫菊细胞的生长进程 1.4除虫菊愈伤组织生长量随着时间的变化约呈“S”形1.21（图2）。继代接种后1～8ｄ内细胞生长缓慢，8ｄ后，0.8生长加快，8～18ｄ内细胞迅速增殖，呈直线上升趋势，0.60.4在20ｄ时生长量达到最大，以后细胞增殖减慢，细胞0.2
0大量衰老，开始出现褐化，生长量增长速度减慢并趋[***********]224262830
培养天数于停止。
图图5 细胞生长曲线2 细胞生长曲线2.3 优化培养基的选择
通过四因素三水平的正交试验，测定各组合不同培
养基成份对愈伤组织继代培养生长量的影响，方差分析的结果表明，各因素对指标影响的主次顺序为：蔗糖＞NAA>6-BA＞2,4-D ，即蔗糖对细胞生长的影响最大。根据正交实验最终确定培养基MS+ 4 mg·L-12,4-D ＋0.1 mg·L-1NAA mg·L-1＋0.3 mg·L-16-BA ＋g·L-1 蔗糖为除虫菊细胞的最适培养基。
2.4 除虫菊愈伤组织的生长条件
2.4.1 温度的影响
- 2 -
李小六，李艳梅，陈 超，田立民：除虫菊愈伤组织的诱导与继代培养
表2 不同温度对愈伤组织生长情况的影响
温度（℃） 总生长量（g/瓶） 日均生长量（g/d/瓶）褐化开始时间（d ）颜色
23 2.981 0.071
25 3.785 0.108
27 3.972 0.132
29 3.423 0.131 42 淡黄色，疏松 35 淡黄色，疏松 30 黄色，致密 26 黄色，致密
由表2可以看出，温度相对低的条件下，细胞增长缓慢，褐化开始时间长，随着温度的增加，细胞生长量也增大，25～27℃为最适温度，温度继续升高时，细胞可能过早衰老以致细胞总生长量迅速下降，23℃低温条件下，愈伤组织褐化时间延长，适合愈伤组织的保存。
2.4.2 光照时间的影响
表3 不同光照时间对愈伤组织生长情况的影响
光照时间（h/d） 总生长量（g/瓶） 日均生长量（g/d/瓶）褐化开始时间（d ） 颜色
4 3.281 0.073
8 3.952 0.113
12 3.914 0.131
16 3.423 0.127 45 淡黄色，疏松 35 淡黄色，疏松 30 黄色，致密 27 黄色，致密
由表3可见，随着光照时间的增加愈伤组织生长量升高，但愈伤组织褐变开始时间缩短，愈伤组织颜色由淡黄色到黄色，形态由疏松变为致密，光照时间为12h/d时，日平均生长量最大，适合愈伤组织的培养。
2.4.3 pH的影响
表4 不同pH 对愈伤组织生长情况的影响
pH 总生长量（g/瓶） 日均生长量（g/d/瓶）褐化开始时间（d ） 颜 色
5.2 2.281
5.4 3.152
5.6 3.414
5.8 3.523
6.0 3.446 0.084 0.113 0.114 0.117 0.108 27 黄白色，疏松 28 淡黄色，疏松 30 黄色，致密 30 黄色，致密 32 黄色，致密
由表4可见，在pH 为5.8时，愈伤组织总生长量和日均生长量最大，但在pH5.4～6.0范围内，愈伤组织总生长量和褐化开始时间没有明显的变化，确定继代培养时pH 为5.8。
参考文献：
[1] 陈宗莲, 侯岁稳, 俞宏渊. 除虫菊的组织培养[J].云南植物研究,1998,20(3):351-354.
[2] 孙敬三, 桂耀林. 植物细胞工程实验技术[M].北京:科学出版社,1995.36-38.
[3] 唐巍, 吴绛云. 人参悬浮细胞系的建立及其生长特性的研究[J].生物技术,1994,4(1):26-29.
[4] 于荣敏, 赵鸿莲, 张辉, 等. 银杏细胞悬浮培养及银杏内酯产生的研究[J].生物工程学报,1994,15(2):207-210.
[5] 李春喜, 王志和, 王文林. 生物统计学[M].北京:科学出版社,2000（第二版）.149-155.
Callus Induced and Successive Transfer Culture of Pyrethrum
Cinerariifolium
LI Xiao-Liu, LI Yan-Mei, CHEN Chao, Tian Li-min
(Biological Science and Technology Department, Tangshan Teachers College, Hebei Tangshan 063000, China)
Abstract: Callus induced in pyrethrum Cinerariifolium begin to grow rapidly from the 8th day and the maximum growth amount is obtained in the 20th day; and its successive transfer culture is also discussed.
Key words: pyrethrum Cinerariifolium; callus induced; successive transfer culture
责任编辑、校对：李春香
- 3 -
第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005
除虫菊愈伤组织的诱导与继代培养
李小六，李艳梅，陈 超，田立民
（唐山师范学院 生物科学技术系，河北 唐山 063000）
摘 要：诱导除虫菊愈伤组织，结果显示：除虫菊愈伤组织从第8d 开始迅速生长，20d 达到最大生长量；并
对除虫菊愈伤组织继代培养条件进行了探讨。
关键词：除虫菊；愈伤组织诱导；继代培养
中图分类号：Q949.9 文献标识码：A 文章编号：1009-9115（2005）02-0001-03
从除虫菊经提取和加工后获得的天然除虫菊酯农药，具有起效快、作用广谱、药物残留低、对人畜无害等优点, 是世界公认的。目前天然除虫菊酯主要从除虫菊干花中提取，[1]由于近几年世界范围内除虫菊花市场供应短缺，造成其市场价格上扬，难以满足市场需求。本文以除虫菊花蕾为材料，诱导愈伤组织，并进行继代培养，并对愈伤组织细胞生长的优化条件作了探讨，目的是为用植物生物反应器建立大规模除虫菊细胞培养体系，[2][3][4]大量生产除虫菊酯等杀虫成分，进而工厂化生产天然除虫菊酯杀虫剂。 1 材料和方法
1.1 材料
除虫菊（Pyrethrum Cinerariifolium）未成熟花蕾。
1.2 方法
1.2.1 培养条件
琼脂5 g·L-1 。 初始诱导培养基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+ 0.1 mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，
继代培养基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+ 0.1 mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，琼脂5 g·L-1，pH 为5.8，培养温度为25～27℃，光照强度为2 000～2 500lx，光照时间12h·d-1。
1.2.2 诱导方法
取除虫菊（Pyrethrum Cinerariifolium）未成熟花蕾，于4℃下处理24 h，70%乙醇消毒30 s，再转入0.1％HgCl 2溶液中消毒5 min，无菌水冲洗3～4次，剥去花萼后接种于初始诱导培养基。
1.2.3 继代培养
（1）继代接种方法 选取典型活性的愈伤组织，在无菌条件下称取0.1g ，用镊子接种于100ml 的三角瓶固体培养基上，均分为7～10块，轻轻按压，使愈伤组织和培养基充分接触。
（2）细胞生长量测定 采用细胞鲜重法，将收获的愈伤组织称重得鲜重（DW ），减去接种量0.1g ，即得愈伤组织总生长量。测定细胞生长曲线，一次性接种150瓶，从第二天开始，每次随机取10瓶，每2天测定一次除虫菊愈伤组织总细胞生长量，进行除虫菊愈伤组织生长曲线的测定（测定到第30d ）。[2]
（3）继代培养基的优化 在我们以往工作的基础上，对2,4-D 、NAA 、6-BA 、蔗糖4个因素3个水平进行正交试验，[5]正交实验的因素水平表见表1。
1.2.4 培养条件
1.2.4.1 温度对愈伤组织生长的影响
选取适于愈伤组织继代培养的培养基，将温度设为23℃、25℃、27℃、29℃共4个处理（每个处理6个重复），光照强度均为2 500lx，分别进行试验，各处理在开始褐化时收获测定总生长量。
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基金项目：唐山市科技局硕博基金（02813031A-4）
收稿日期：2004-11-01
作者简介：李小六（1971-），男，河南确山人，唐山师范学院生物科学技术系讲师，理学硕士。 - 1 -
第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年第2期
1.2.4.2 光照时间对愈伤组织生长的影响
选取适于愈伤组织继代培养的培养基，将光照时间设为4h/d、8h/d、12h/d、16h/d共4个处理（光照强度均为2 500lx），温度为27℃分别进行试验，各处理在开始褐化时收获测定总生长量。
1.2.4.3 pH 对愈伤组织生长的影响
选取适于愈伤组织继代培养的培养基，将pH 设为5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，光照时间12h/d（光照强度均为2 500lx），温度为27℃，分别进行试验，各处理在开始褐化时收获测定总生长量。
表1 正交实验因素水平
因 素
水 平 A B C D
2,4-D NAA 6-BA Sucrose
1
2
3 2 0.1 0.1 20 000 3 0.3 0.2 30 000 4 0.6 0.3 40 000
2 结果与讨论
2.1 除虫菊花蕾愈伤组织的诱导及细胞形态学观察
花蕾接入后，4～8d 开始出现愈伤组织，15d 后愈伤组织大量形成，初期生长缓慢，转入继代培养基后，愈伤组织生长加快，1mon 后可以增重数倍，愈伤组织（图1-a ）黄色或淡黄色，细胞大多为圆形，细胞之间联系紧密，多个细胞成为细胞团（图1-b ）。30~40d后，继代培养的愈伤组织开始出现不同程度的褐化，每隔20d 继代一次。
图1 除虫菊愈伤组织及细胞形态 a ：除虫菊花蕾诱导的愈伤组织 b ：除虫菊愈伤组织的小细胞团
(600X)
总生长量（g /瓶) b 2.2 除虫菊细胞的生长进程 1.4除虫菊愈伤组织生长量随着时间的变化约呈“S”形1.21（图2）。继代接种后1～8ｄ内细胞生长缓慢，8ｄ后，0.8生长加快，8～18ｄ内细胞迅速增殖，呈直线上升趋势，0.60.4在20ｄ时生长量达到最大，以后细胞增殖减慢，细胞0.2
0大量衰老，开始出现褐化，生长量增长速度减慢并趋[***********]224262830
培养天数于停止。
图图5 细胞生长曲线2 细胞生长曲线2.3 优化培养基的选择
通过四因素三水平的正交试验，测定各组合不同培
养基成份对愈伤组织继代培养生长量的影响，方差分析的结果表明，各因素对指标影响的主次顺序为：蔗糖＞NAA>6-BA＞2,4-D ，即蔗糖对细胞生长的影响最大。根据正交实验最终确定培养基MS+ 4 mg·L-12,4-D ＋0.1 mg·L-1NAA mg·L-1＋0.3 mg·L-16-BA ＋g·L-1 蔗糖为除虫菊细胞的最适培养基。
2.4 除虫菊愈伤组织的生长条件
2.4.1 温度的影响
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李小六，李艳梅，陈 超，田立民：除虫菊愈伤组织的诱导与继代培养
表2 不同温度对愈伤组织生长情况的影响
温度（℃） 总生长量（g/瓶） 日均生长量（g/d/瓶）褐化开始时间（d ）颜色
23 2.981 0.071
25 3.785 0.108
27 3.972 0.132
29 3.423 0.131 42 淡黄色，疏松 35 淡黄色，疏松 30 黄色，致密 26 黄色，致密
由表2可以看出，温度相对低的条件下，细胞增长缓慢，褐化开始时间长，随着温度的增加，细胞生长量也增大，25～27℃为最适温度，温度继续升高时，细胞可能过早衰老以致细胞总生长量迅速下降，23℃低温条件下，愈伤组织褐化时间延长，适合愈伤组织的保存。
2.4.2 光照时间的影响
表3 不同光照时间对愈伤组织生长情况的影响
光照时间（h/d） 总生长量（g/瓶） 日均生长量（g/d/瓶）褐化开始时间（d ） 颜色
4 3.281 0.073
8 3.952 0.113
12 3.914 0.131
16 3.423 0.127 45 淡黄色，疏松 35 淡黄色，疏松 30 黄色，致密 27 黄色，致密
由表3可见，随着光照时间的增加愈伤组织生长量升高，但愈伤组织褐变开始时间缩短，愈伤组织颜色由淡黄色到黄色，形态由疏松变为致密，光照时间为12h/d时，日平均生长量最大，适合愈伤组织的培养。
2.4.3 pH的影响
表4 不同pH 对愈伤组织生长情况的影响
pH 总生长量（g/瓶） 日均生长量（g/d/瓶）褐化开始时间（d ） 颜 色
5.2 2.281
5.4 3.152
5.6 3.414
5.8 3.523
6.0 3.446 0.084 0.113 0.114 0.117 0.108 27 黄白色，疏松 28 淡黄色，疏松 30 黄色，致密 30 黄色，致密 32 黄色，致密
由表4可见，在pH 为5.8时，愈伤组织总生长量和日均生长量最大，但在pH5.4～6.0范围内，愈伤组织总生长量和褐化开始时间没有明显的变化，确定继代培养时pH 为5.8。
参考文献：
[1] 陈宗莲, 侯岁稳, 俞宏渊. 除虫菊的组织培养[J].云南植物研究,1998,20(3):351-354.
[2] 孙敬三, 桂耀林. 植物细胞工程实验技术[M].北京:科学出版社,1995.36-38.
[3] 唐巍, 吴绛云. 人参悬浮细胞系的建立及其生长特性的研究[J].生物技术,1994,4(1):26-29.
[4] 于荣敏, 赵鸿莲, 张辉, 等. 银杏细胞悬浮培养及银杏内酯产生的研究[J].生物工程学报,1994,15(2):207-210.
[5] 李春喜, 王志和, 王文林. 生物统计学[M].北京:科学出版社,2000（第二版）.149-155.
Callus Induced and Successive Transfer Culture of Pyrethrum
Cinerariifolium
LI Xiao-Liu, LI Yan-Mei, CHEN Chao, Tian Li-min
(Biological Science and Technology Department, Tangshan Teachers College, Hebei Tangshan 063000, China)
Abstract: Callus induced in pyrethrum Cinerariifolium begin to grow rapidly from the 8th day and the maximum growth amount is obtained in the 20th day; and its successive transfer culture is also discussed.
Key words: pyrethrum Cinerariifolium; callus induced; successive transfer culture
责任编辑、校对：李春香
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