酵母菌的染色与观察
摘要：本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察酵母形态和出芽生殖方式，并区分酵母菌
死活细胞。以生长在麦氏培养基上的酿酒酵母为材料，采用Schaeffer-Fulton氏染色法，进行子囊孢子的观察。
关键词：酵母菌 水浸片法 子囊孢子 出芽生殖 前言
酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明且分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖－醋酸钠培养基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。
1材料
1.1菌种
酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物。
1.2溶液和试剂
葡萄糖，KCl，酵母浸膏，醋酸钠，琼脂，蒸馏水，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，0.01%美兰水溶液。
1.3仪器和其他用品
酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，烧杯，试管等。
2实验步骤
2.1培养基的制备
2.1.1麦氏琼脂培养基的制备
2.1.2液体培养基的制备
取0.5g酵母膏、1g蛋白胨、2g葡萄糖加入100ml水配制成液体培养基。
2.2斜面接种
无菌操作由酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物挑取菌种，在已冷凝好的斜面培养基上划线接种。
2.3培养
在28℃条件下恒温培养7d。
2.4美蓝染液水浸片法
2.4.1制片
在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，无菌操作法取培养基中培养的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。用镊子夹盖玻片一块，小心盖在液滴上。 2.4.2镜检
将制好的水浸片放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。30min后再次观察。
2.5子囊孢子观察
2.5.1制片
在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜。
2.5.2干燥固定
待涂片自然干燥后，让菌膜朝上，通过火焰2～3次进行固定（以不烫手为宜）。
2.5.3染色
加5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，染色1~1.5min。
2.5.4水洗
用缓流自来水轻轻冲洗，直至流出的水无色为止。
2.5.5乙醇脱色
用95%的乙醇脱色30s，立即用水洗去乙醇。
2.5.6复染
用0.5%番红液染色30s~1min。
2.5.7水洗
用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。
2.5.8镜检
将载玻片晾干后，先低倍再高倍，最后在油镜观察酵母菌。
3结果与分析
3.1实验结果
3.1.1美蓝浸片观察实验结果（见图1、2）
在高倍显微镜下可以看到，酿酒酵母菌为单细胞，呈卵圆形或圆形，个体较大，细胞内有明显的液泡。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，出芽时，由母细胞生出小突起，为芽体(芽孢子)。
活着的酵母菌细胞呈现无色，死亡的酵母菌细胞被染成蓝色。因为美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。用它来对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
在30min后观察该片，蓝色细胞增多。得出美蓝染液的作用时间会使酿酒酵母的死细胞
增多，细胞死、活比例增大。
出芽细胞
芽体
图1 酵母菌形态结构（10×40）
3.1.2 子囊孢子观察实验结果（见图3及分析）
图2-1 美蓝水浸片3min（10×40） 图2-2美蓝水浸片30min（10×40）
局部放大图
图3 酵母菌子囊孢子形态观察（10×40）
通过染色镜检，酵母菌的子囊为圆形大细胞，呈现红色；其附近有2~4个圆形小细胞为酵母菌的子囊孢子，呈现绿色。这是因为先用着色力强的染色剂孔雀绿染色，子囊中残留染
料经酒精脱色，而孢子一经染色难以脱色，后用番红染液复染，子囊被染成红色。
3.3思考题
1.根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液的作用时间与酿酒酵母的死活细胞比例变化是否有关系？
答：有。随着作用时间的延长，死活细胞的比例增大。
2.酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性繁殖外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？
答：通过染色，可以观察到酿酒酵母的子囊孢子为圆形的小细胞，呈现绿色。
4小结
通过本实验，了解了酵母菌的形态及出芽方式，并用美蓝染液水浸片法区别酵母菌的死活细胞，掌握了子囊染色观察方法，并了解酵母菌通过形成子囊孢子进行有性生殖。
本实验中滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。染色的时间需要严格注意，在子囊孢子染色观察实验中，各步骤的时间要严格控制，以免影响实验结果。 参考文献：
1.沈萍 陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.70-81页
酵母菌的染色与观察
摘要：本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察酵母形态和出芽生殖方式，并区分酵母菌
死活细胞。以生长在麦氏培养基上的酿酒酵母为材料，采用Schaeffer-Fulton氏染色法，进行子囊孢子的观察。
关键词：酵母菌 水浸片法 子囊孢子 出芽生殖 前言
酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明且分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖－醋酸钠培养基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。
1材料
1.1菌种
酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物。
1.2溶液和试剂
葡萄糖，KCl，酵母浸膏，醋酸钠，琼脂，蒸馏水，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，0.01%美兰水溶液。
1.3仪器和其他用品
酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，烧杯，试管等。
2实验步骤
2.1培养基的制备
2.1.1麦氏琼脂培养基的制备
2.1.2液体培养基的制备
取0.5g酵母膏、1g蛋白胨、2g葡萄糖加入100ml水配制成液体培养基。
2.2斜面接种
无菌操作由酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物挑取菌种，在已冷凝好的斜面培养基上划线接种。
2.3培养
在28℃条件下恒温培养7d。
2.4美蓝染液水浸片法
2.4.1制片
在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，无菌操作法取培养基中培养的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。用镊子夹盖玻片一块，小心盖在液滴上。 2.4.2镜检
将制好的水浸片放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。30min后再次观察。
2.5子囊孢子观察
2.5.1制片
在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜。
2.5.2干燥固定
待涂片自然干燥后，让菌膜朝上，通过火焰2～3次进行固定（以不烫手为宜）。
2.5.3染色
加5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，染色1~1.5min。
2.5.4水洗
用缓流自来水轻轻冲洗，直至流出的水无色为止。
2.5.5乙醇脱色
用95%的乙醇脱色30s，立即用水洗去乙醇。
2.5.6复染
用0.5%番红液染色30s~1min。
2.5.7水洗
用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。
2.5.8镜检
将载玻片晾干后，先低倍再高倍，最后在油镜观察酵母菌。
3结果与分析
3.1实验结果
3.1.1美蓝浸片观察实验结果（见图1、2）
在高倍显微镜下可以看到，酿酒酵母菌为单细胞，呈卵圆形或圆形，个体较大，细胞内有明显的液泡。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，出芽时，由母细胞生出小突起，为芽体(芽孢子)。
活着的酵母菌细胞呈现无色，死亡的酵母菌细胞被染成蓝色。因为美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。用它来对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
在30min后观察该片，蓝色细胞增多。得出美蓝染液的作用时间会使酿酒酵母的死细胞
增多，细胞死、活比例增大。
出芽细胞
芽体
图1 酵母菌形态结构（10×40）
3.1.2 子囊孢子观察实验结果（见图3及分析）
图2-1 美蓝水浸片3min（10×40） 图2-2美蓝水浸片30min（10×40）
局部放大图
图3 酵母菌子囊孢子形态观察（10×40）
通过染色镜检，酵母菌的子囊为圆形大细胞，呈现红色；其附近有2~4个圆形小细胞为酵母菌的子囊孢子，呈现绿色。这是因为先用着色力强的染色剂孔雀绿染色，子囊中残留染
料经酒精脱色，而孢子一经染色难以脱色，后用番红染液复染，子囊被染成红色。
3.3思考题
1.根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液的作用时间与酿酒酵母的死活细胞比例变化是否有关系？
答：有。随着作用时间的延长，死活细胞的比例增大。
2.酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性繁殖外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？
答：通过染色，可以观察到酿酒酵母的子囊孢子为圆形的小细胞，呈现绿色。
4小结
通过本实验，了解了酵母菌的形态及出芽方式，并用美蓝染液水浸片法区别酵母菌的死活细胞，掌握了子囊染色观察方法，并了解酵母菌通过形成子囊孢子进行有性生殖。
本实验中滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。染色的时间需要严格注意，在子囊孢子染色观察实验中，各步骤的时间要严格控制，以免影响实验结果。 参考文献：
1.沈萍 陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.70-81页