杂交水稻 1996(5) ・27・
基础理论 Basic research
A FLP 的原理及其应用
王 斌 翁曼丽
(中国科学院遗传研究所 100101)
提 要:AFLP 是检测DNA 多态性的一种新的分子标记技术。对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。
关键词:分子标记技术 AFLP 原理 应用
1 分子标记技术的快速发展
在过去10a 中, 分子标记技术得到了突飞猛进
的发展, 至今已有10余种分子标记技术相继出现, 并在各个研究领域得到了应用。其中在植物分子生物学领域中应用最广泛的是RF LP 和RA PD 。R FL P 的结果稳定可靠, 重复性好, 特别适应于建立连锁
1, 2〕图, 例如水稻RF LP 连锁图的建立〔。RF L P 比较作图进一步揭示了在主要粮食作物中, R FL P 标记3, 4〕
在染色体上的排列具有类似的顺序〔。因此R FL P 自出现至今虽然已有10多a 了, 但它仍是当今应用
记, 不管所研究的基因组DN A 有多么复杂, 理论上讲, 用A FL P 方法都可以检测出任何DN A 之间的多态性。
2 A FL P 的发展及其基本原理
AF L P (Amplified Fr agment L eng th Po ly mor -phism) 是1992年由荷兰科学家Zabeau 和V os 发展起来的一种检测DN A 多态性的新方法。由于它具有重要的实用价值, 一出现就被Key g ene 公司以专
7〕利形式买下〔。由于A FL P 较其它分子标记有着明显的优越性, 因此迅速传播开来, 尽管它已受到了专
最广泛的一种分子标记。然而, R FL P 必须经过滤膜转移和So uthern 杂交, 费时、费力、周期长。另外, RF L P 对DN A 多态性检出的灵敏度不高, RF L P 连锁图上还有很多大的空间区, 这限制了它的进一步发展。PCR 对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用, 迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多种类型, 其实除了以传统的Souther n 杂交为基础的RF L P 外, 其它各类分子标记都涉及P CR 。R AP D 就是以随机引物为模板通过P CR 扩增进行DN A 多态性研究的, 与RF LP 相比, 它较便宜, 方便易行, 非常灵敏, DN A 用量少, 而且不需要同位素, 安全性好。继RF L P 之后, RA PD 是应用最广泛的, 特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面, 近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的R AP D 标记。近来西红柿P to 基因和水稻Xa21基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RA PD 标记, 然后通过M BC(M ap based clo ning ) 方法克隆了目
5, 6〕
的基因〔。但是RA PD 受条件影响很大, 因此对设备、条件及操作的要求都很严格, 如果达不到要求, 稳定性和重复性就难保证。
A FL P 是在RF LP 和RA PD 的基础上发展起来的。它是R FL P 和RA PD 的结合, 但不是笼统的结合, 它克服了二者各自的缺点, 而集中了二者的长处。它既有R FL P 的可靠性, 也具有RA PD 的方便〔性利保护, 但世界上很多实验室都在努力探索在自己
的研究中应用A FL P 技术。因此Zabeau 和V os 不
7〕得不将其专利解密〔, 并以论文形式正式发表出8〕来〔。至今正式发表的关于A F LP 的论文还不8～10〕多〔, 可是实际上做这方面研究的人已很多。
与RF L P 类似, A FL P 也是通过限制性内切酶
片段的不同长度检测DN A 多态性的一种DN A 分子标记技术。但A FL P 是通过PCR 反应先把酶切片段扩增, 然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳, 多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来(附图) 。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接, 连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR 反应的引物结合位点。实验中, 根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物, 可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段, 进行结合, 导致特异性扩增。
3 A FL P 的基本反应程序
AF L P 反应程序主要包括模板D NA 制备, 酶切片段扩增及凝胶电泳分析3个步骤:
3. 1 模板DN A 制备
在进行A FL P 分析时, 首先要制备高分子量(HM W ) 基因组D NA , 然后用两种限制性内切酶酶,
・28・
个碱基, 如Eco R Ⅰ和M se Ⅰ, 选择这样两种酶共同酶切可以产生比较小的酶切片段, 经过P CR 反应扩增出的产物主要在lkb 左右, 范围可能在100～1500bp 。
HM W 基因组DN A 的成功制备和避免部分降解是A FL P 成功的关键。在制备过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。在用限制性内切酶酶解时, 一定要彻底。DN A 酶切完成后, 经加热使限制性内切酶失活, 再把酶切片段连结到特定的接头(adapter ) 上, 形成扩增反应的模板。经过连接反应, 接头和基因组DN A 酶切片段的粘性末端之间进行碱基配对并接连在一起, 该接头及其毗邻的酶切位点这段共同顺序就存在于所有限制性酶切片段的两端, 成为以后进行PCR 扩增时引物的结合位点。
A FL P 接头是一种人工合成的双链DN A , 一般长度是14～18个核苷酸, 由核心顺序和内切酶位点特异顺序两部分组成。因为在绝大多数真核生物基因组DN A 中, EcoR Ⅰ总是给予可靠的酶切结果, 价格又便宜, 而M se Ⅰ可以产生比较小而稳定的酶切片段。因此, 目前商品出售的A FL P 试剂盒中用的是EcoR Ⅰ接头和M se Ⅰ接头。目前, 已有报道使用过的6碱基内切酶接头, 除EcoR Ⅰ外, 还有P st Ⅰ接头和Sac Ⅰ接头; 4碱基内切酶接头除M se Ⅰ外, 还有T aq Ⅰ接头和Sse Ⅰ接头。3. 2 酶切片段的扩增
3. 2. 1 扩增反应的模板。
在酶切片段中接上去的接头及其毗邻的酶切位点顺序就成为以后P CR 扩增时引物结合的位点。在AF L P 反应中, 引物的3′末端有1～3个选择性核苷酸顺序。酶切片段结合位点中能够与引物上的选择性核苷酸适当配对的, 就被识别并用作模板而选择性地扩增出来。3. 2. 2 扩增反应的引物。
A FL P 引物是一种人工合成的单链寡核苷酸, 一般长度为18～20个核苷酸。由核心顺序(co re ) 、内切酶位点特异顺序(ENZ ) 和选择性核苷酸顺序(EXT ) 三部分组成。下面以目前常用的Eco R Ⅰ引物和M se Ⅰ引物为例说明各部分的组成, 图中N 代表某个核苷酸。
核心顺序(core)
ENZ E XT
EcoR I 引物5′-GACT GC GT ACCAA TT C NNN-3′M se I 引物5′-GATGAGTCC TGAG TAA NNN-3′
杂交水稻 1996(5)
附图 AF L P 反应过程示意图
T he pro cess of A F L P . 在A FL P 引物中, 3′末端上选择性核苷酸数目的多少决定了A FL P 扩增产物的多少。实验中可根据基因组DN A 的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。一般大于108bp 的基因组D NA 可以用3个选择性核苷酸; 105～108bp 的基因组D NA 可以用2个选择性核苷酸, 文献中常提到的+3或+2就是表示在引物3′末端的选择性核苷酸数目分为3或2。其它6碱基内切酶引物与Eco R Ⅰ引物类似, 4碱基内切酶引物与M se Ⅰ引物类似, 只是各自的内切酶位点特异顺序彼此不同。
目前作为商品出售的A F LP 选择性扩增引物只有两种, 即EcoR Ⅰ引物和M se Ⅰ引物, 都是含有3个选择性核苷酸的引物, 按照这3个核苷酸排列顺, 和
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M se Ⅰ引物, 这两类引物可以组成64种扩增组合。对于不同作物基因组D NA 而言, 不同的引物组合扩增效果不同。
3. 2. 3 扩增反应的条件。
酶切片段要经过连续2次P CR 扩增, 通过这样两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好。第1次PCR 扩增被称为预扩增反应(Pr eamplifi-ca tio n) , 所用的A FL P 引物只含有1个选择性核苷酸, 选择扩增性能较差, 因此大量的扩增产物在凝胶中往往形成连续的一片。预扩增反应条件与常规
预扩增反应的产物经过大PCR 反应条件大致相同。
量稀释后用作第2次扩增反应(即选择性扩增反应,
选择性扩增反应所Selective amplificatio n ) 的模板。
用的引物中选择性核苷酸数目的多少是决定扩增产
物多少的主要因子。目前在植物基因组D NA 的A FL P 分析中, 选择性扩增反应所用的引物一般含有3个选择性核苷酸顺序。在这种情况下, 每个样品扩增产物数目平均在50个左右, 范围为10～100个。另外, 引物中用作选择性核苷酸的G 和C 含量也对扩增出的产物数目有较大影响。一般而言, G 和C 含量越高, 扩增出的产物数目越少。当然, 所分析的基因组DN A 越大, 扩增出的产物数目也相应较多, 其DN A 指纹图也较复杂。
选择性扩增的反应条件与普通PCR 有所不同, 主要不同之处是复性温度, 它是采用温度梯度PCR , 其P CR 开始于高温复性(一般采用65℃, 比常规P CR 反应的复性温度高10℃) 以期获得最佳选择性。以后复性温度逐步降低, 一直降到复性效果最好的温度(一般是56℃) , 然后保持在这个温度下复性, 完成其余的P CR 循环周期。3. 3 扩增产物的凝胶电泳分析
选择性扩增产物一般在5%～6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PA GE 序列分析胶) 上经过电泳分离, 形成DN A 指纹, 凝胶经过干燥、放射性自显影后即可进行结果分析。
4 A F L P 的应用前景
由于A FL P 结合了RF L P 和R A PD 各自的优点, 它方便快速, 只需要极少量D NA 材料, 不需要Souther n 杂交, 不需要预先知道DN A 的顺序信息, 实验结果又稳定可靠, 可以快速获得大量的信息; A FL P 产物呈典型的孟德尔方式遗传, 因此A FL P 称为最有力的分子标记或下一代分子标记。它可以应用于一般分子标记的所有应用范围, 如遗传多样, 等等。
4. 1 遗传多样性和种质鉴定
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AF L P 的最适应用范围, 也就是M. Z abeau 和P. Vo s 申请专利的关键, 是利用A FL P 技术鉴定品种指纹(Fing erpr int) , 检测品种的质量和纯度, 辨别真伪, 十分灵敏。著名的美国先锋种子公司首先引用了A FL P 技术用于玉米自交系和杂交种的鉴定工作, 建立它们的指纹档案, 保护品种专利。法国F aye 用1个A F L P 引物组合在玉米2个基因型中发现了30多条多态性区带, 这表明A F L P 非常适合用于玉米基因型的指纹鉴定。
Zabeau 实验室的T homas 等人通过对F 2群体进行集群聚类分析(BSA ) , 从42000个A F LP 位点中找到了3个与西红柿叶霉病抗性基因Cf -9连锁
10〕
并表现为共分离的AF L P 标记〔, 并以这些标记为起点, 通过M BC 方法已将Cf-9基因克隆。应该指出的是:完成42000个位点分析, 对于R FL P 和R A PD 分析而言是相当大的工作量, 但对A FL P 分析而言, 只要10多块胶板即可完成, 每块胶板可以比较几千个AF L P 位点, 信息量很大, 这是AF L P 突出的优点。
美国康耐尔大学的Blair 利用A FL P 技术对54份水稻品种的遗传多样性进行了分析, 研究其系统发育和分类, 并与用同功酶研究得出的结果进行了比较, 发现不仅其结论一致, 而且认为A F LP 对研究水稻品种的遗传变异和构建基因组图谱十分理想。我所在英国剑桥实验室的博士生朱嘉辉从2000份水稻种质资源中随机选取来源于不同生态区域的200份材料, 用AF L P 技术研究其多样性, 并根据分析结果提出水稻模式核心种(M o del cor e co llectio n) 假说。比利时Br eyne P eter 分析了拟南芥菜种内和种间的22个生态型, 发现1个反应即可发现大量特异性区带, 在所有检测的区带中50%以上在不同的生态型中表现出多态性。4. 2 构建遗传图谱
英国M ackill 等人比较了RA PD 、SSR 及A F L P 在水稻多态性检测中的有效性, 结果表明就检出多态性的百分比而言, SSR 居首位, AF L P 和R AP D 次之, 都远远高于R FL P , 由于A F L P 可分析的总数目相当大, 在他们的实验中平均每块胶板中可以找出8个多态产物, 而且实践证明在A FL P 多态产物中可以定位于图谱上的部分所占的比例相当高, 因此很适用于构建遗传图谱(私人通讯) 。
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时间就构建了玉米A FL P 图谱, 共有1032个A FL P 标记。荷兰K ey g ene 公司P ot Jerina 与PE 公司合作构建了拟南芥菜高密度的A F LP 图谱, 含有700多个A F LP 位点。
4. 3 基因定位
美国普渡大学D weikat I. 以小麦近等基因系为材料, 通过A FL P 分析定位了抗麦蝇(Hessian fly ) 基因H6和H9。德国M ax -P lanck 研究所发现了马铃薯V 染色体上7个与抗晚疫病的基因R 1连锁的A FL P 标记, 其中距R 1最近的1个标记与R 1的遗传距离只有0. 8cM 。本实验室用A F L P 方法对光温敏核不育水稻及其可育恢复突变体进行了多态性分析, 找到了与其不育基因连锁的分子标记, 并用A FL P 方法对多种作物的多态性进行了比较研
11〕究〔。
4. 4 标记辅助育种
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分析) , 用A F L P 分析能达到满意的结果。高密度基因图谱的绘制或对某个特定基因所在区域的精细作图, AF L P 是最理想的方法, 是技术路线的首选方案。
参考文献
1 Caus se M A et al. Saturated molecular map of rice genome based on an intersp ecific backcross popula-tion. Genetics, 1994, 138:1251～1274.
2 Ku rata N et al . A 300kilobase interval genetic map of
rice including 883expr ess ed sequ ences. Natur e Genet, 1994, 8:365～372. 3 Ah n S et al. Homologous relationships of rice, w heat,
and maize ch romosomes. M ol Gen Genet, 1994, 241:483～490.
4 M oore G et al. Grasses, line up and form a circle. Cur-rent Biology , 1995, 5:737～740. 5 M artin GB et al. M ap based cloning of pr otein kin as e
gene conferring dis ease resis tance in tom ato . Science , 1993, 262:1432～1436.
6 S ong WY et al . A r eceptor k inas e -like protein en cod-ed by the rice disease resistance gene, Xa21, Science, 1995, 270:1804～1806. 7 Zabeau M an d Vos P. Selective res triction fragm ent
amplification :a gen eral method for DNA fingerprint-in g . Eu ropean Patent Application 92402629. 7(Pub li-cation No. 0534858Al ) . European Patent Office, Paris .
8 Vos P et al. AFLP:a n ew tech nique for DNA finger-pr inting . Nucleic Acids Res earch , 1995, 23(21) :4407～4414.
9 Becker J et al. Combin ed mapping of AFLP and RFLP
mark ers in barley, M ol Gen Genet, 1995, 249:65～73.
10 T homas C M et al. Identification of amplified res tr ic-tion fragemnt polymorph ism (AFLP ) mark ers tightly linked to the tomato Cf -9gene for resistance to Cla-dos porium fulvum, T he Plant J ou rnal, 1995, 8(5) :785～794.
11 王斌等. AFLP 在作物品种多态性研究中的应用. 科学
通报(在出版中) , 1996.
美国T exas A &M大学的R eddy 用AF L P 技术指导棉花育种, 把长绒的海岛棉与高产的陆地棉进行远缘杂交, 利用计算机Genesca n 672软件分析64个A F LP 引物的扩增结果, 在杂交后代F 2群体中发现300个标记与亲本的长绒和高产性状有关。美国农业部土壤排水研究站的V antoal T. 等用A FL P 技术指导大豆回交育种, 比较大豆双亲与回交1代C O 及回交2代C 1的异质程度, 发现平均每对A F LP 引物可以产生10个多态性标记, 10对A F L P 引物可检测出100个位点的纯合或异质程度。美国生命技术公司的L iu J. J. 利用AF L P 技术研究大豆的数量性状, 发现每个反应都可检查出大量的多态性区带, 每对引物都具有高频率(>90%) 的多态性, 可以作为大豆数量性状的标准。
但是, A F L P 的费用是昂贵的, 只要起动这项工作就需大量费用, 而且实验涉及面广, 要求技术比较全面, 对操作人员素质要求也高, 因此在基层开展A FL P 研究, 还有相当多困难。在那些多态性很少, 而且待测样品较少的情况下(如近等基因系和BSA
The Principle and Application of AFLP
Wang Bin , Weng Manli
(I nstitute of Genetics , Chinese A cademy of Sciences , Beij ing 100101)
Abstract :A FL P , i . e , A mplified F ra gment L engt h Po ly mor phism , is a new ly developed technique for DN A finger printing by Dutch scientists Zabeau M. and V os P. in 1992. T he pr inciple, o per ating pro cedur e, application and pr ospects o f this technique w ere br iefly indro duced and described in the paper .
ker L pr n
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基础理论 Basic research
A FLP 的原理及其应用
王 斌 翁曼丽
(中国科学院遗传研究所 100101)
提 要:AFLP 是检测DNA 多态性的一种新的分子标记技术。对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。
关键词:分子标记技术 AFLP 原理 应用
1 分子标记技术的快速发展
在过去10a 中, 分子标记技术得到了突飞猛进
的发展, 至今已有10余种分子标记技术相继出现, 并在各个研究领域得到了应用。其中在植物分子生物学领域中应用最广泛的是RF LP 和RA PD 。R FL P 的结果稳定可靠, 重复性好, 特别适应于建立连锁
1, 2〕图, 例如水稻RF LP 连锁图的建立〔。RF L P 比较作图进一步揭示了在主要粮食作物中, R FL P 标记3, 4〕
在染色体上的排列具有类似的顺序〔。因此R FL P 自出现至今虽然已有10多a 了, 但它仍是当今应用
记, 不管所研究的基因组DN A 有多么复杂, 理论上讲, 用A FL P 方法都可以检测出任何DN A 之间的多态性。
2 A FL P 的发展及其基本原理
AF L P (Amplified Fr agment L eng th Po ly mor -phism) 是1992年由荷兰科学家Zabeau 和V os 发展起来的一种检测DN A 多态性的新方法。由于它具有重要的实用价值, 一出现就被Key g ene 公司以专
7〕利形式买下〔。由于A FL P 较其它分子标记有着明显的优越性, 因此迅速传播开来, 尽管它已受到了专
最广泛的一种分子标记。然而, R FL P 必须经过滤膜转移和So uthern 杂交, 费时、费力、周期长。另外, RF L P 对DN A 多态性检出的灵敏度不高, RF L P 连锁图上还有很多大的空间区, 这限制了它的进一步发展。PCR 对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用, 迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多种类型, 其实除了以传统的Souther n 杂交为基础的RF L P 外, 其它各类分子标记都涉及P CR 。R AP D 就是以随机引物为模板通过P CR 扩增进行DN A 多态性研究的, 与RF LP 相比, 它较便宜, 方便易行, 非常灵敏, DN A 用量少, 而且不需要同位素, 安全性好。继RF L P 之后, RA PD 是应用最广泛的, 特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面, 近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的R AP D 标记。近来西红柿P to 基因和水稻Xa21基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RA PD 标记, 然后通过M BC(M ap based clo ning ) 方法克隆了目
5, 6〕
的基因〔。但是RA PD 受条件影响很大, 因此对设备、条件及操作的要求都很严格, 如果达不到要求, 稳定性和重复性就难保证。
A FL P 是在RF LP 和RA PD 的基础上发展起来的。它是R FL P 和RA PD 的结合, 但不是笼统的结合, 它克服了二者各自的缺点, 而集中了二者的长处。它既有R FL P 的可靠性, 也具有RA PD 的方便〔性利保护, 但世界上很多实验室都在努力探索在自己
的研究中应用A FL P 技术。因此Zabeau 和V os 不
7〕得不将其专利解密〔, 并以论文形式正式发表出8〕来〔。至今正式发表的关于A F LP 的论文还不8～10〕多〔, 可是实际上做这方面研究的人已很多。
与RF L P 类似, A FL P 也是通过限制性内切酶
片段的不同长度检测DN A 多态性的一种DN A 分子标记技术。但A FL P 是通过PCR 反应先把酶切片段扩增, 然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳, 多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来(附图) 。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接, 连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR 反应的引物结合位点。实验中, 根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物, 可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段, 进行结合, 导致特异性扩增。
3 A FL P 的基本反应程序
AF L P 反应程序主要包括模板D NA 制备, 酶切片段扩增及凝胶电泳分析3个步骤:
3. 1 模板DN A 制备
在进行A FL P 分析时, 首先要制备高分子量(HM W ) 基因组D NA , 然后用两种限制性内切酶酶,
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个碱基, 如Eco R Ⅰ和M se Ⅰ, 选择这样两种酶共同酶切可以产生比较小的酶切片段, 经过P CR 反应扩增出的产物主要在lkb 左右, 范围可能在100～1500bp 。
HM W 基因组DN A 的成功制备和避免部分降解是A FL P 成功的关键。在制备过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。在用限制性内切酶酶解时, 一定要彻底。DN A 酶切完成后, 经加热使限制性内切酶失活, 再把酶切片段连结到特定的接头(adapter ) 上, 形成扩增反应的模板。经过连接反应, 接头和基因组DN A 酶切片段的粘性末端之间进行碱基配对并接连在一起, 该接头及其毗邻的酶切位点这段共同顺序就存在于所有限制性酶切片段的两端, 成为以后进行PCR 扩增时引物的结合位点。
A FL P 接头是一种人工合成的双链DN A , 一般长度是14～18个核苷酸, 由核心顺序和内切酶位点特异顺序两部分组成。因为在绝大多数真核生物基因组DN A 中, EcoR Ⅰ总是给予可靠的酶切结果, 价格又便宜, 而M se Ⅰ可以产生比较小而稳定的酶切片段。因此, 目前商品出售的A FL P 试剂盒中用的是EcoR Ⅰ接头和M se Ⅰ接头。目前, 已有报道使用过的6碱基内切酶接头, 除EcoR Ⅰ外, 还有P st Ⅰ接头和Sac Ⅰ接头; 4碱基内切酶接头除M se Ⅰ外, 还有T aq Ⅰ接头和Sse Ⅰ接头。3. 2 酶切片段的扩增
3. 2. 1 扩增反应的模板。
在酶切片段中接上去的接头及其毗邻的酶切位点顺序就成为以后P CR 扩增时引物结合的位点。在AF L P 反应中, 引物的3′末端有1～3个选择性核苷酸顺序。酶切片段结合位点中能够与引物上的选择性核苷酸适当配对的, 就被识别并用作模板而选择性地扩增出来。3. 2. 2 扩增反应的引物。
A FL P 引物是一种人工合成的单链寡核苷酸, 一般长度为18～20个核苷酸。由核心顺序(co re ) 、内切酶位点特异顺序(ENZ ) 和选择性核苷酸顺序(EXT ) 三部分组成。下面以目前常用的Eco R Ⅰ引物和M se Ⅰ引物为例说明各部分的组成, 图中N 代表某个核苷酸。
核心顺序(core)
ENZ E XT
EcoR I 引物5′-GACT GC GT ACCAA TT C NNN-3′M se I 引物5′-GATGAGTCC TGAG TAA NNN-3′
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附图 AF L P 反应过程示意图
T he pro cess of A F L P . 在A FL P 引物中, 3′末端上选择性核苷酸数目的多少决定了A FL P 扩增产物的多少。实验中可根据基因组DN A 的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。一般大于108bp 的基因组D NA 可以用3个选择性核苷酸; 105～108bp 的基因组D NA 可以用2个选择性核苷酸, 文献中常提到的+3或+2就是表示在引物3′末端的选择性核苷酸数目分为3或2。其它6碱基内切酶引物与Eco R Ⅰ引物类似, 4碱基内切酶引物与M se Ⅰ引物类似, 只是各自的内切酶位点特异顺序彼此不同。
目前作为商品出售的A F LP 选择性扩增引物只有两种, 即EcoR Ⅰ引物和M se Ⅰ引物, 都是含有3个选择性核苷酸的引物, 按照这3个核苷酸排列顺, 和
杂交水稻 1996(5)
M se Ⅰ引物, 这两类引物可以组成64种扩增组合。对于不同作物基因组D NA 而言, 不同的引物组合扩增效果不同。
3. 2. 3 扩增反应的条件。
酶切片段要经过连续2次P CR 扩增, 通过这样两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好。第1次PCR 扩增被称为预扩增反应(Pr eamplifi-ca tio n) , 所用的A FL P 引物只含有1个选择性核苷酸, 选择扩增性能较差, 因此大量的扩增产物在凝胶中往往形成连续的一片。预扩增反应条件与常规
预扩增反应的产物经过大PCR 反应条件大致相同。
量稀释后用作第2次扩增反应(即选择性扩增反应,
选择性扩增反应所Selective amplificatio n ) 的模板。
用的引物中选择性核苷酸数目的多少是决定扩增产
物多少的主要因子。目前在植物基因组D NA 的A FL P 分析中, 选择性扩增反应所用的引物一般含有3个选择性核苷酸顺序。在这种情况下, 每个样品扩增产物数目平均在50个左右, 范围为10～100个。另外, 引物中用作选择性核苷酸的G 和C 含量也对扩增出的产物数目有较大影响。一般而言, G 和C 含量越高, 扩增出的产物数目越少。当然, 所分析的基因组DN A 越大, 扩增出的产物数目也相应较多, 其DN A 指纹图也较复杂。
选择性扩增的反应条件与普通PCR 有所不同, 主要不同之处是复性温度, 它是采用温度梯度PCR , 其P CR 开始于高温复性(一般采用65℃, 比常规P CR 反应的复性温度高10℃) 以期获得最佳选择性。以后复性温度逐步降低, 一直降到复性效果最好的温度(一般是56℃) , 然后保持在这个温度下复性, 完成其余的P CR 循环周期。3. 3 扩增产物的凝胶电泳分析
选择性扩增产物一般在5%～6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PA GE 序列分析胶) 上经过电泳分离, 形成DN A 指纹, 凝胶经过干燥、放射性自显影后即可进行结果分析。
4 A F L P 的应用前景
由于A FL P 结合了RF L P 和R A PD 各自的优点, 它方便快速, 只需要极少量D NA 材料, 不需要Souther n 杂交, 不需要预先知道DN A 的顺序信息, 实验结果又稳定可靠, 可以快速获得大量的信息; A FL P 产物呈典型的孟德尔方式遗传, 因此A FL P 称为最有力的分子标记或下一代分子标记。它可以应用于一般分子标记的所有应用范围, 如遗传多样, 等等。
4. 1 遗传多样性和种质鉴定
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AF L P 的最适应用范围, 也就是M. Z abeau 和P. Vo s 申请专利的关键, 是利用A FL P 技术鉴定品种指纹(Fing erpr int) , 检测品种的质量和纯度, 辨别真伪, 十分灵敏。著名的美国先锋种子公司首先引用了A FL P 技术用于玉米自交系和杂交种的鉴定工作, 建立它们的指纹档案, 保护品种专利。法国F aye 用1个A F L P 引物组合在玉米2个基因型中发现了30多条多态性区带, 这表明A F L P 非常适合用于玉米基因型的指纹鉴定。
Zabeau 实验室的T homas 等人通过对F 2群体进行集群聚类分析(BSA ) , 从42000个A F LP 位点中找到了3个与西红柿叶霉病抗性基因Cf -9连锁
10〕
并表现为共分离的AF L P 标记〔, 并以这些标记为起点, 通过M BC 方法已将Cf-9基因克隆。应该指出的是:完成42000个位点分析, 对于R FL P 和R A PD 分析而言是相当大的工作量, 但对A FL P 分析而言, 只要10多块胶板即可完成, 每块胶板可以比较几千个AF L P 位点, 信息量很大, 这是AF L P 突出的优点。
美国康耐尔大学的Blair 利用A FL P 技术对54份水稻品种的遗传多样性进行了分析, 研究其系统发育和分类, 并与用同功酶研究得出的结果进行了比较, 发现不仅其结论一致, 而且认为A F LP 对研究水稻品种的遗传变异和构建基因组图谱十分理想。我所在英国剑桥实验室的博士生朱嘉辉从2000份水稻种质资源中随机选取来源于不同生态区域的200份材料, 用AF L P 技术研究其多样性, 并根据分析结果提出水稻模式核心种(M o del cor e co llectio n) 假说。比利时Br eyne P eter 分析了拟南芥菜种内和种间的22个生态型, 发现1个反应即可发现大量特异性区带, 在所有检测的区带中50%以上在不同的生态型中表现出多态性。4. 2 构建遗传图谱
英国M ackill 等人比较了RA PD 、SSR 及A F L P 在水稻多态性检测中的有效性, 结果表明就检出多态性的百分比而言, SSR 居首位, AF L P 和R AP D 次之, 都远远高于R FL P , 由于A F L P 可分析的总数目相当大, 在他们的实验中平均每块胶板中可以找出8个多态产物, 而且实践证明在A FL P 多态产物中可以定位于图谱上的部分所占的比例相当高, 因此很适用于构建遗传图谱(私人通讯) 。
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时间就构建了玉米A FL P 图谱, 共有1032个A FL P 标记。荷兰K ey g ene 公司P ot Jerina 与PE 公司合作构建了拟南芥菜高密度的A F LP 图谱, 含有700多个A F LP 位点。
4. 3 基因定位
美国普渡大学D weikat I. 以小麦近等基因系为材料, 通过A FL P 分析定位了抗麦蝇(Hessian fly ) 基因H6和H9。德国M ax -P lanck 研究所发现了马铃薯V 染色体上7个与抗晚疫病的基因R 1连锁的A FL P 标记, 其中距R 1最近的1个标记与R 1的遗传距离只有0. 8cM 。本实验室用A F L P 方法对光温敏核不育水稻及其可育恢复突变体进行了多态性分析, 找到了与其不育基因连锁的分子标记, 并用A FL P 方法对多种作物的多态性进行了比较研
11〕究〔。
4. 4 标记辅助育种
杂交水稻 1996(5)
分析) , 用A F L P 分析能达到满意的结果。高密度基因图谱的绘制或对某个特定基因所在区域的精细作图, AF L P 是最理想的方法, 是技术路线的首选方案。
参考文献
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10 T homas C M et al. Identification of amplified res tr ic-tion fragemnt polymorph ism (AFLP ) mark ers tightly linked to the tomato Cf -9gene for resistance to Cla-dos porium fulvum, T he Plant J ou rnal, 1995, 8(5) :785～794.
11 王斌等. AFLP 在作物品种多态性研究中的应用. 科学
通报(在出版中) , 1996.
美国T exas A &M大学的R eddy 用AF L P 技术指导棉花育种, 把长绒的海岛棉与高产的陆地棉进行远缘杂交, 利用计算机Genesca n 672软件分析64个A F LP 引物的扩增结果, 在杂交后代F 2群体中发现300个标记与亲本的长绒和高产性状有关。美国农业部土壤排水研究站的V antoal T. 等用A FL P 技术指导大豆回交育种, 比较大豆双亲与回交1代C O 及回交2代C 1的异质程度, 发现平均每对A F LP 引物可以产生10个多态性标记, 10对A F L P 引物可检测出100个位点的纯合或异质程度。美国生命技术公司的L iu J. J. 利用AF L P 技术研究大豆的数量性状, 发现每个反应都可检查出大量的多态性区带, 每对引物都具有高频率(>90%) 的多态性, 可以作为大豆数量性状的标准。
但是, A F L P 的费用是昂贵的, 只要起动这项工作就需大量费用, 而且实验涉及面广, 要求技术比较全面, 对操作人员素质要求也高, 因此在基层开展A FL P 研究, 还有相当多困难。在那些多态性很少, 而且待测样品较少的情况下(如近等基因系和BSA
The Principle and Application of AFLP
Wang Bin , Weng Manli
(I nstitute of Genetics , Chinese A cademy of Sciences , Beij ing 100101)
Abstract :A FL P , i . e , A mplified F ra gment L engt h Po ly mor phism , is a new ly developed technique for DN A finger printing by Dutch scientists Zabeau M. and V os P. in 1992. T he pr inciple, o per ating pro cedur e, application and pr ospects o f this technique w ere br iefly indro duced and described in the paper .
ker L pr n