第三章 愈伤组织的诱导与培养
第一节 愈伤组织的诱导与继代培养
愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征
1、愈伤组织的诱导
1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth） 外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：
外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：
外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征
质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素
愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养
继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
方法：一般每3~4周继代1次；每次取生长迅速、浅色、疏松的愈伤进行；继代用培养基与原来相同，或根据培养目标、培养阶段不同而改变成分，通常是改变激素配比。
注：
通过调节培养基成分，特别是生长调节剂种类和比例，可使不同类型愈伤在一定程度上相互转变。
提高生长调节剂浓度
紧实
减少或除去生长调节剂松脆
继代培养的目的：获得大量优良愈伤，供进一步研究之用。 优良愈伤的特点：
1）疏松易碎和旺盛的增殖能力，以便建立悬浮系或无性系；
2）经长期继代仍保持较强的再分化能力，便于获得再生植株或进行遗传操作。
三、悬浮培养
悬浮培养（suspension culture）：将疏松易碎、生长旺盛的愈伤小块放入液体培养基中进行振荡培养，以形成分散性好的游离单细胞和小细胞团的培养技术。
小型培养用100~250ml三角瓶；大规模培养用特制的培养容器进行。
1. 悬浮培养的用途
1）提供一个相对一致的细胞群体，供生理生化、胚胎发生、基因表达等研究。
2）次生代谢物质生产。
3）细胞突变体的诱变与筛选。
4）分离原生质体。
理想的悬浮系：应由大量增殖迅速的游离细胞组成，但一般的悬浮系是由单个细胞与大大小小的细胞团块组成的混合物。
2. 影响悬浮培养的因素
1）培养基成分：一般，适于培养松脆愈伤的培养基也适于建立悬浮系。
生长调节剂：通常生长素较多分散性好，如甘薯茎尖，MS+2mg/L 2,4-D。
无机磷：适当增加。
葡萄糖：作碳源效果较好。
2）细胞密度：接种足够的细胞块，过滤去掉大块。
3）振荡速度：30~150rpm，使愈伤破碎、均匀分布，促进气体交换。
4）继代时间：一般7~15 d一次。
3. 悬浮培养物的继代与测定
1）继代培养：
小型培养：将培养瓶静置，吸去上清，加入新鲜培养液；或者吸取悬浮液，转接到含新鲜培养液的培养瓶。
大规模培养：在培养容器中不断注入新鲜培养液，排出旧培养液，保持体积恒定和营养物的补充。
2）细胞增殖的测定：
A. 细胞鲜、干重：尼龙丝网收集细胞，经真空抽滤称鲜重，经60~80℃烘干称干重。
B. 细胞密实/叠积体积：将已知体积的悬浮液转入刻度离心管中，低速离心，用每毫升培养液中细胞的毫升数表示。
C. 细胞数：血球计数板或特制的计数盘。
注意：
1）长期继代培养会发生体细胞无性系变异（somaclonal variation）：染色体数目、结构变异，或基因突变，不利于保持供体植物的遗传稳定性，并使再生力下降甚至丧失，但有利于育种和遗传研究，是重要育种方法，如从马铃薯育成抗早疫病品种，从水稻育成抗白叶枯病品种等。
2）长期继代培养会造成试管苗玻璃化加重。
因此，要及时进行分化培养。
第二节 愈伤组织分化和植物再生
一、器官发生与植株再生
器官发生（organogenesis）：指培养物在适宜条件下产生不定芽（adventitious bud）和不定根（adventitious root），然后形成完整植株的过程。又称器官建成/形成/不定器官形成。
常见再生途径。
1. 器官发生的方式/途径
1）直接发生：从外植体中已存在的器官原基（茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎）直接形成相应的器官，或者从外植体脱分化形成的分生细胞团上直接形成器官原基。
2）间接发生：由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤分化成器官原基并发育成器官(常见方式)。
2. 器官发生的顺序
1）先芽后根：在同一培养基上从芽的基部分化出根，或将芽移入生根培养基而生根(常见)。
2）先根后芽：较难诱导生芽，尤其单子叶植物。
3）在愈伤不同部位分别形成根或芽，再通过维管组织联系而形成完整植株。
4）仅形成芽或根。
芽是外起源，即由愈伤外层细胞形成芽原基;
根是内起源，即根原基发生于组织深处。
3. 器官发生的生理与分子基础（了解）
器官发生时有特异蛋白产生，同功酶谱变化；
淀粉积累是芽和根分化的先决条件，供能，随着进一步发育而消失； 一些氨基酸、多胺和内源激素水平也有变化。
拟南芥等，在不定根和不定芽发生时都有特异基因表达。 外源和内源激素可能通过调节基因表达而调节器官发生。
二、体细胞胚胎发生与植株再生
合子胚（zygotic embryo）：植物通过自然受精作用而形成的受精卵/合子，经历原胚proembryo、球形胚global embryo 、心形胚heart-stage embryo 、鱼雷形胚torpedo-stage embryo和子叶形胚cotyledon-stage embryo发育而成的胚。
体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）：指体细胞培养物在适宜培养条件下形成类似于合子胚的结构，进而发育成完整植株的过程。
它的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚 期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。
胚状体（embryoid）: 经体胚发生形成的类似于合子胚的结构称为体细胞胚或胚状体，或不定胚。
花粉胚pollen embryoid：由小孢子或者其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，发育成单倍体植株。
2. 体胚与合子胚的比较
1) 胚胎发生和发育过程相似，形成具有胚芽、胚根,、胚轴的胚状结构，进而形成完整植株。
2) 无胚乳endosperm或胚乳/子叶发育不良；
3) 无种皮；物质积累少；
4) 质量差，萌发率低；
5) 一般体胚的干燥和休眠过程短暂或缺乏。
体胚再生途径的优点：
1）数量多、速度快、成苗率高；
2）可制成人工种子，便于运输和保存；
3）再生过程简单，遗传性稳定。
4）多数认为体胚起源于单细胞，转基因植株嵌合体少，遗传稳定。 胚性愈伤/细胞（embryogenic callus/cell）：能够形成胚状体的愈伤或细胞。
3. 体胚发生的生理与分子基础（了解）
胚性与非胚性细胞在蛋白、同功酶电泳谱带上存在差异；
拟南芥合子胚发育的必需基因有500~1000个，已发现影响体胚发生的基因有近40个，其中一些基因在胚胎发生中表达增强（如钙信号转导基因），另一些则为发育阶段或组织特异性表达，如体胚发生的受体激酶基因SERK只在胚胎发生的早期表达。
4. 胚状体与不定芽的区别及其优点
1）在外观上，体胚和不定芽均有光滑、圆形的突起，早期区别难。
2）组织学区别：
（1）胚状体有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。
（2）胚状体有生理隔离：其维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往与愈伤或外植体的维管组织相连。
（3）胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽无此现象。
单细胞培养胚状体的突破有重要意义：
1、可给植物基因工程提供最有效的受体材料；
2、可有效服务于物种改良及稀有物种的种质资源保藏。
三、 影响植株再生的因素
1. 外植体
基因型：烟草、胡萝卜和矮牵年等易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等比较困难；柑橘类、胡萝卜、矮牵牛等较易诱导体胚，而烟草较难。
来源或生理状态：如油菜的花器官、水稻和小麦的幼穗比叶、根等易于分化成苗；幼嫩组织（如子叶）比老组织易于发生体胚。
2. 培养基成分
1） 激素：常用较高细胞分裂素/生长素促进生芽，但有时绝对浓度更重要；将二者配合使用常利于诱导体胚。培养物的内源激素水平使问题复杂化。
2,4-D：诱导特异基因表达，进而诱导胚性细胞形成，但在体胚发育中需降低或去除。
ABA：促进某些植物体胚发育。
细胞分裂素：对体胚诱导作用不显，但可显著促进体胚成熟，特别利于子叶发育。
乙烯和GA：常抑制体胚发生。
2）其他成分
增加无机磷可促进茄科Solanaceae植物的器官分化；
减少矿质元素可提高大多数植物生根（1/2MS或White）； 较高浓度蔗糖利于禾本科器官形成；
K+和铁盐为体胚诱导所必需;
高浓度Ca2+抑制体胚发生；
NH4+ 利于体胚发生。
3. 培养条件
1）光照
一般14~16 h光照、8~10 h黑暗；近紫外和蓝紫光促进生芽，而红光促进生根；光照一般促进体胚发生。
2）温度
接近于植物原产地的温度利于再生。
经验之谈，应根据实验确定。
第三节 试管苗的移栽
一、试管苗与自然苗的区别
1. 试管苗角质层/蜡质层薄弱，易失水；
2. 试管苗生长势弱，适应性差；
3. 试管苗根系弱、功能差。
二、试管苗移栽的注意事项
1. 要炼苗（domestication）
移前加强光照，开瓶塞，使适应外境。约需1周。
2. 选择合适的移栽介质
先移入人工调配的混合营养土（腐殖土、泥炭土、蛭石等），最好灭
菌。
3. 移栽时洗净琼脂，防止污染。
4. 防止伤根。
5. 加强栽后管理
用喷雾、搭棚等保湿，但土壤湿度不能过高；遮强光；温度逐渐接近室外。
第三章 愈伤组织的诱导与培养
第一节 愈伤组织的诱导与继代培养
愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征
1、愈伤组织的诱导
1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth） 外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：
外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：
外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征
质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素
愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养
继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
方法：一般每3~4周继代1次；每次取生长迅速、浅色、疏松的愈伤进行；继代用培养基与原来相同，或根据培养目标、培养阶段不同而改变成分，通常是改变激素配比。
注：
通过调节培养基成分，特别是生长调节剂种类和比例，可使不同类型愈伤在一定程度上相互转变。
提高生长调节剂浓度
紧实
减少或除去生长调节剂松脆
继代培养的目的：获得大量优良愈伤，供进一步研究之用。 优良愈伤的特点：
1）疏松易碎和旺盛的增殖能力，以便建立悬浮系或无性系；
2）经长期继代仍保持较强的再分化能力，便于获得再生植株或进行遗传操作。
三、悬浮培养
悬浮培养（suspension culture）：将疏松易碎、生长旺盛的愈伤小块放入液体培养基中进行振荡培养，以形成分散性好的游离单细胞和小细胞团的培养技术。
小型培养用100~250ml三角瓶；大规模培养用特制的培养容器进行。
1. 悬浮培养的用途
1）提供一个相对一致的细胞群体，供生理生化、胚胎发生、基因表达等研究。
2）次生代谢物质生产。
3）细胞突变体的诱变与筛选。
4）分离原生质体。
理想的悬浮系：应由大量增殖迅速的游离细胞组成，但一般的悬浮系是由单个细胞与大大小小的细胞团块组成的混合物。
2. 影响悬浮培养的因素
1）培养基成分：一般，适于培养松脆愈伤的培养基也适于建立悬浮系。
生长调节剂：通常生长素较多分散性好，如甘薯茎尖，MS+2mg/L 2,4-D。
无机磷：适当增加。
葡萄糖：作碳源效果较好。
2）细胞密度：接种足够的细胞块，过滤去掉大块。
3）振荡速度：30~150rpm，使愈伤破碎、均匀分布，促进气体交换。
4）继代时间：一般7~15 d一次。
3. 悬浮培养物的继代与测定
1）继代培养：
小型培养：将培养瓶静置，吸去上清，加入新鲜培养液；或者吸取悬浮液，转接到含新鲜培养液的培养瓶。
大规模培养：在培养容器中不断注入新鲜培养液，排出旧培养液，保持体积恒定和营养物的补充。
2）细胞增殖的测定：
A. 细胞鲜、干重：尼龙丝网收集细胞，经真空抽滤称鲜重，经60~80℃烘干称干重。
B. 细胞密实/叠积体积：将已知体积的悬浮液转入刻度离心管中，低速离心，用每毫升培养液中细胞的毫升数表示。
C. 细胞数：血球计数板或特制的计数盘。
注意：
1）长期继代培养会发生体细胞无性系变异（somaclonal variation）：染色体数目、结构变异，或基因突变，不利于保持供体植物的遗传稳定性，并使再生力下降甚至丧失，但有利于育种和遗传研究，是重要育种方法，如从马铃薯育成抗早疫病品种，从水稻育成抗白叶枯病品种等。
2）长期继代培养会造成试管苗玻璃化加重。
因此，要及时进行分化培养。
第二节 愈伤组织分化和植物再生
一、器官发生与植株再生
器官发生（organogenesis）：指培养物在适宜条件下产生不定芽（adventitious bud）和不定根（adventitious root），然后形成完整植株的过程。又称器官建成/形成/不定器官形成。
常见再生途径。
1. 器官发生的方式/途径
1）直接发生：从外植体中已存在的器官原基（茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎）直接形成相应的器官，或者从外植体脱分化形成的分生细胞团上直接形成器官原基。
2）间接发生：由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤分化成器官原基并发育成器官(常见方式)。
2. 器官发生的顺序
1）先芽后根：在同一培养基上从芽的基部分化出根，或将芽移入生根培养基而生根(常见)。
2）先根后芽：较难诱导生芽，尤其单子叶植物。
3）在愈伤不同部位分别形成根或芽，再通过维管组织联系而形成完整植株。
4）仅形成芽或根。
芽是外起源，即由愈伤外层细胞形成芽原基;
根是内起源，即根原基发生于组织深处。
3. 器官发生的生理与分子基础（了解）
器官发生时有特异蛋白产生，同功酶谱变化；
淀粉积累是芽和根分化的先决条件，供能，随着进一步发育而消失； 一些氨基酸、多胺和内源激素水平也有变化。
拟南芥等，在不定根和不定芽发生时都有特异基因表达。 外源和内源激素可能通过调节基因表达而调节器官发生。
二、体细胞胚胎发生与植株再生
合子胚（zygotic embryo）：植物通过自然受精作用而形成的受精卵/合子，经历原胚proembryo、球形胚global embryo 、心形胚heart-stage embryo 、鱼雷形胚torpedo-stage embryo和子叶形胚cotyledon-stage embryo发育而成的胚。
体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）：指体细胞培养物在适宜培养条件下形成类似于合子胚的结构，进而发育成完整植株的过程。
它的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚 期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。
胚状体（embryoid）: 经体胚发生形成的类似于合子胚的结构称为体细胞胚或胚状体，或不定胚。
花粉胚pollen embryoid：由小孢子或者其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，发育成单倍体植株。
2. 体胚与合子胚的比较
1) 胚胎发生和发育过程相似，形成具有胚芽、胚根,、胚轴的胚状结构，进而形成完整植株。
2) 无胚乳endosperm或胚乳/子叶发育不良；
3) 无种皮；物质积累少；
4) 质量差，萌发率低；
5) 一般体胚的干燥和休眠过程短暂或缺乏。
体胚再生途径的优点：
1）数量多、速度快、成苗率高；
2）可制成人工种子，便于运输和保存；
3）再生过程简单，遗传性稳定。
4）多数认为体胚起源于单细胞，转基因植株嵌合体少，遗传稳定。 胚性愈伤/细胞（embryogenic callus/cell）：能够形成胚状体的愈伤或细胞。
3. 体胚发生的生理与分子基础（了解）
胚性与非胚性细胞在蛋白、同功酶电泳谱带上存在差异；
拟南芥合子胚发育的必需基因有500~1000个，已发现影响体胚发生的基因有近40个，其中一些基因在胚胎发生中表达增强（如钙信号转导基因），另一些则为发育阶段或组织特异性表达，如体胚发生的受体激酶基因SERK只在胚胎发生的早期表达。
4. 胚状体与不定芽的区别及其优点
1）在外观上，体胚和不定芽均有光滑、圆形的突起，早期区别难。
2）组织学区别：
（1）胚状体有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。
（2）胚状体有生理隔离：其维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往与愈伤或外植体的维管组织相连。
（3）胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽无此现象。
单细胞培养胚状体的突破有重要意义：
1、可给植物基因工程提供最有效的受体材料；
2、可有效服务于物种改良及稀有物种的种质资源保藏。
三、 影响植株再生的因素
1. 外植体
基因型：烟草、胡萝卜和矮牵年等易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等比较困难；柑橘类、胡萝卜、矮牵牛等较易诱导体胚，而烟草较难。
来源或生理状态：如油菜的花器官、水稻和小麦的幼穗比叶、根等易于分化成苗；幼嫩组织（如子叶）比老组织易于发生体胚。
2. 培养基成分
1） 激素：常用较高细胞分裂素/生长素促进生芽，但有时绝对浓度更重要；将二者配合使用常利于诱导体胚。培养物的内源激素水平使问题复杂化。
2,4-D：诱导特异基因表达，进而诱导胚性细胞形成，但在体胚发育中需降低或去除。
ABA：促进某些植物体胚发育。
细胞分裂素：对体胚诱导作用不显，但可显著促进体胚成熟，特别利于子叶发育。
乙烯和GA：常抑制体胚发生。
2）其他成分
增加无机磷可促进茄科Solanaceae植物的器官分化；
减少矿质元素可提高大多数植物生根（1/2MS或White）； 较高浓度蔗糖利于禾本科器官形成；
K+和铁盐为体胚诱导所必需;
高浓度Ca2+抑制体胚发生；
NH4+ 利于体胚发生。
3. 培养条件
1）光照
一般14~16 h光照、8~10 h黑暗；近紫外和蓝紫光促进生芽，而红光促进生根；光照一般促进体胚发生。
2）温度
接近于植物原产地的温度利于再生。
经验之谈，应根据实验确定。
第三节 试管苗的移栽
一、试管苗与自然苗的区别
1. 试管苗角质层/蜡质层薄弱，易失水；
2. 试管苗生长势弱，适应性差；
3. 试管苗根系弱、功能差。
二、试管苗移栽的注意事项
1. 要炼苗（domestication）
移前加强光照，开瓶塞，使适应外境。约需1周。
2. 选择合适的移栽介质
先移入人工调配的混合营养土（腐殖土、泥炭土、蛭石等），最好灭
菌。
3. 移栽时洗净琼脂，防止污染。
4. 防止伤根。
5. 加强栽后管理
用喷雾、搭棚等保湿，但土壤湿度不能过高；遮强光；温度逐渐接近室外。