重组肺癌抑癌基因1蛋白的表达_纯化及其多克隆抗体的制备_冉永刚

DOI ：10.13200/j.cjb.2010.12.56.ranyg.006

中国生物制品学杂志2010年12月第23卷第12期Chin J Biologicals December 2010，Vol. 23No. 12中国图书分类号Q78R734. 2文献标识码A 文章编号

1004-5503（2010）12-1329-04

·1329·

【基础研究】

重组肺癌抑癌基因1蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

冉永刚1

游颜杰2

【摘要】目的表达、纯化重组人肺癌抑癌基因1（Tumor suppressor in lung cancer 1，TSLC1）蛋白，并制备其多克隆抗体。方法采用RT-PCR 法扩增TSLC1基因全长编码区序列，克隆入原核表达质粒pQE30，转化大肠杆菌M15，IPTG 诱导表达，表免疫家兔，Protein A 亲和层析纯化抗血清，并经Western blot 分析其反应原性。结果达的重组蛋白经Ni 2＋-NTA 亲和层析纯化后，

重组表达质粒pQE30-TSLC1经双酶切及测序鉴定证明构建正确。重组TSLC1蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14％，主要以包涵体形式存在。纯化的重组蛋白纯度为93. 4％，可与小鼠抗His-Tag 单克隆抗体发生特异性反应。以其制备的多克隆抗体具有良好的抗原识别特异性。结论已成功制备TSLC1多克隆抗体，为深入研究TSLC1分子的生物学活性奠定了基础。【关键词】肺癌抑癌基因1；原核细胞；基因表达；纯化；抗体

Expression and Purification of Recombinant Tumor Suppressor in Lung Can－cer 1Protein and Preparation of Its Polyclonal Antibody

RAN Yong-gang △，YOU Yan-jie （△Department of Biochemistry ，Bethune Military Medicine College ，Shijiazhuang 050081，China ）

【Abstract 】Objective

To express and purify tumor suppressor in lung cancer 1（TSLC1）protein and prepare its polyclonal

antibody．Methods The full-length sequence of encoding region of TSLC1gene was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryot－ic expression vector pQE30，and the constructed recombinant plasmid pQE30-TSLC1was transformed to E . coli M15for expression under induction of IPTG．The expressed protein was purified by Ni 2＋-NTA affinity chromatography and used for the immunization of rabbits．The antisera were purified by Protein A affinity chromatography and analyzed for reactogenicity by Western blot．Results Both restriction analysis and sequencing proved that recombinant plasmid pQE30-TSLC1was constructed correctly．Recombinant TSLC1protein mainly existed in a form of inclusion body and contained about 14％of total somatic protein．Purified TSLC1protein reached a purity of 93. 4％and showed specific reaction with mouse anti-His-Tag monoclonal antibody．The polyclonal antibody pre－pared with purifed TSLC1protein showed high specificity in antigen recognition．Conclusions

The polyclonal antibody against

TSLC1was successfully prepared ，which laid a foundation of further study on the biological activity of TSLC1molecules．【Key words 】Tumor suppressor in lung cancer 1（TSLC1）；Prokaryotic cells ；Gene expression ；Purification ；Antibody

肺癌抑癌基因1（Tumor suppressor in lung can－cer 1，TSLC1）是新近发现的抑癌基因，其作用为介导细胞间相互黏附、胞内信号传导及膜蛋白与细胞骨架之间的交联［1］。现已研究证实，TSLC1的表达下调是肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要因素之一，与肺癌、乳腺癌、食道癌、宫颈癌等多种上皮恶性肿瘤的发生发展密切相关［2-5］。本实验在原核表达系统中表达TSLC1融合蛋白，免疫家兔制备抗血清，经为该基因的进一步纯化后获得TSLC1多克隆抗体，研究奠定了基础。

1. 材料与方法1. 1菌株、质粒及细胞

大肠杆菌M15和原核表达载体pQE30由第四

作者单位：1白求恩军医学院生物化学教研室（石家庄050081）；2汕头大学医学院附属肿瘤医院（广东汕头515041）．通讯作者：游颜杰，E-mail ：youyanjie＠163．com

军医大学生物技术中心惠赠；人乳腺癌细胞株MCF-7由汕头大学医学院附属肿瘤医院中心实验室保存。

1. 2实验动物

SPF 级成年家兔，雄性，体重2. 5kg ，购自汕头大学医学院动物实验中心。

1．3主要试剂

各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶、逆转录试剂盒、Pfu 酶、PCR 引物和DNA marker 均购自TaKaRa 公司；Protein A 和Ni 2＋-NTA 亲和层析填料购自Amer－sham 公司；小鼠抗His-Tag 单克隆抗体和HRP 标记的山羊抗兔或抗鼠IgG 购自北京中杉金桥公司；Tri－zol 试剂、蛋白质marker 、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生物有限公司；其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯。

1．4TSLC1基因的扩增

根据GenBank 中登录的TSLC1基因全长编码

）设计引物，序列如下：上游：5′-区序列（NM _014333

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（下划线为BamH Ⅰ酶切位点），下游：5′-TGGTCGACCTAGA-TGAAGTACTCTT-3′（下划线为Sal Ⅰ酶切位点）。用

Trizol 试剂提取MCF-7细胞总RNA ，逆转录试剂盒合成cDNA ，操作均按试剂说明书进行。以合成的cDNA 为模板，PCR 扩增TSLC1基因。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1. 5重组原核表达质粒的构建

将纯化回收的TSLC1基因与原核表达载体pQE30分别经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，以T4DNA 连接酶连接，转化感受态大肠杆菌M15，提取质粒，经双酶切鉴定并送上海英骏生物技术有限公司测序，鉴定正确的质粒命名为pQE30-TSLC1。1. 6目的基因的诱导表达及表达形式的分析

将含重组质粒pQE30-TSLC1的工程菌接种于含Amp （100mg ／L ）的LB 培养液中，于37℃培养过夜，次日按1∶100的比例转接，继续培养至对数生长期（A 600＝0. 4～0. 6）时，加1μmol ／L IPTG 37℃诱导表达，4h 后，离心收集菌体，取样进行SDS-灰度扫描分析菌体总蛋白中目的蛋白PAGE 分析，

所占比例。超声裂解诱导的工程菌，离心分离上清和沉淀，分别取样，SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达形式。

1. 7重组融合蛋白的纯化及复性

采用将洗涤后的沉淀用8mol ／L 尿素溶解后，Ni 2＋-NTA 柱进行亲和层析纯化，分别使用25mmol ／L 和250mmol ／L 的咪唑进行洗脱，SDS-PAGE 分析纯化效果。纯化后的重组蛋白稀释后进行梯度透析复

性，Bradford 法测定蛋白浓度。

1. 8纯化产物的Western blot 分析

纯化的重组蛋白经SDS-PAGE 后，转移至NC 膜上，以小鼠抗His-Tag 单克隆抗体（1∶1000稀释）为一抗，HRP 标记的山羊抗小鼠IgG （1∶2000稀释）为二抗，进行Western blot 分析。1. 9家兔免疫及抗血清效价的测定

免疫前，留取少量阴性血清。将500μg 融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀后，经家兔背部皮下多点注射进行初免，2周后，与弗氏不完全佐剂等体积混均后，再次免疫，隔周重复免疫，第5次免疫后10d ，麻醉动物，颈动脉放血，分离血清，-70℃冻存备用。第3次免疫后10d ，经耳缘静脉采血，采用ELISA 法测定抗血清效价。

1. 10TSLC1多克隆抗体的纯化及鉴定

抗血清经Protein A 上样缓冲液10倍稀释后，过滤，上Protein A 柱亲和纯化，收集洗脱峰，与等体

－20℃冻存备用。将TSLC1融合蛋白积甘油混合后，

经SDS-PAGE 后，转移至NC 膜上，以纯化的TSLC1多克隆抗体（1∶5000稀释）为一抗，HRP 标记的山羊抗兔IgG （1∶2000稀释）为二抗，进行Western blot 分析。

1. 11统计学分析

数据资料以±s 表示，采用SPSS 11. 0统计软件包对实验数据进行统计分析，差异显著性采用方差分析检验，以P ＜0. 05为差异有统计学意义。2. 结果

2. 1TSLC1基因扩增产物的鉴定

TSLC1基因PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1300bp 的特异性条带，见图1。

bp M 1

2000

[**************]0

M ：DNA marker DL2000；1：TSLC1基因PCR 产物图1TSLC1基因PCR 扩增产物电泳图

Fig 1. Electrophoretic profile of PCR product of TSLC1gene

2. 2重组原核表达质粒的鉴定

重组原核表达质粒pQE30-TSLC1经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析可见约1300bp 的目的基因条带，见图2。测序结果证实，插入片段的基因序列与预期一致。2. 3表达产物的鉴定

M15／pQE30-TSLC1的诱导表达产物经SDS-PAGE 分析，在相对分子质量约50000处可见特异的蛋白条带，大小与预期相符；灰度扫描分析显示，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14％；融合蛋白主要以包涵体的形式存在。见图3。2. 4纯化产物的鉴定

亲和层析图谱见图4，峰2为目的蛋白洗脱峰。纯化的融合蛋白经SDS-PAGE 分析，可见单一条带，经灰度扫描分析，其纯度为93. 4％。Western 见图3；

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blot 分析显示，目的蛋白可与小鼠抗His-Tag 单克隆抗体反应，在相对分子质量约50000处可见特异性反应条带，见图3。表明重组蛋白具有良好的反应原性。

[1**********]0m A U

5000－500

[***********]00

－1000

[***********]160时间（min ）

1：穿过峰；2：目的蛋白洗脱峰

图4融合蛋白的Ni 2＋-NTA 亲和层析纯化图谱

Fig 4. Ni 2＋-NTA affinity chromatographic profile of fu－sion protein

M ：DNA marker DL2000；1：质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双

酶切的产物

图2重组原核表达质粒pQE30-TSLC1的双酶切鉴定Fig 2. Restriction map of recombinant plasmid pQE30-TSLC1

116664535

M r [1**********]0

M 123

25000

M r [***********][***********]

1840014400

M ：蛋白质marker ；1：上样前样品；2：穿过峰；3：目的蛋白洗脱峰

图5纯化的TSLC1多克隆抗体的SDS-PAGE 分析Fig 5. SDS-PAGE profile of purified polyclonal anti－body against TSLC1

M ：蛋白质marker ；1：未经诱导的M15／pQE30-TSLC1；2：诱导后的M15／pQE30-TSLC1；3：菌体裂解上清；4：菌体裂解沉淀；5：纯化的重组TSLC1蛋白；6：纯化的重组TSLC1蛋白的Western bot 分析

图3表达及纯化产物的鉴定

Fig 3. Identification of expressed and purified TSLC1fusion protein

M r M 116000

[***********]00

2. 5免疫家兔的抗血清效价

免疫家兔的抗血清ELISA 效价为1∶150000。2. 6纯化的TSLC1多克隆抗体的鉴定

纯化的TSLC1多克隆抗体经SDS-PAGE 分析，可见相对分子质量约50000的蛋白条带，见图5。Western blot 分析显示，其可与TSLC1融合蛋白发生特异性反应，在相对分子质量约50000处可见特异的反应条带，见图6。表明制备的TSLC1多克隆抗体

具有良好的抗原识别特异性。

1840014400

M ：蛋白质marker ；1：未经诱导的M15／pQE30-TSLC1；2：诱导后的M15／pQE30-TSLC1；3：纯化的TSLC1蛋白

图6纯化TSLC1多克隆抗体的Western blot 分析Fig 6. Western blotting of purified ploycolonal antibody against TSLC1

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3. 讨论

TSLC1基因属于免疫球蛋白超家族成员，定位

参考文献

［1］Murakami Y．Involvement of a cell adhesion molecule ，TSLC1／

IGSF4，in human oncogenesis ［J ］．Cancer Sci ，2005，96（9）：543-552．

［2］Heller G ，Fong KM ，Girard L ，et al ．Expression and methylation

．Onco－pattern of TSLC1cascade genes in lung carcinomas ［J ］）：959-968．gene ，2006，25（6

［3］Ito T ，Shimada Y ，Hashimoto Y ，et al ．Involvement of TSLC1in

．Cancer progression of esophageal squamous cell carcinoma ［J ］Res ，2003，63（19）：6320-6326．

［4］Yang YX ，Yang AH ，Yang ZJ ，et al ．Involvement of tumor sup－

pressor in lung cancer 1gene expression in cervical carcinogenesis ［J ］．Int J Gynecol Cancer ，2006，16（5）：1868-1872．

［5］Heller G ，Geradts J ，Ziegler B ，et al ．Downregulation of TSLC1

and DAL-1expression occurs frequently in breast cancer ［J ］．103（3）：283-291．Breast Cancer Res Treat ，2007，

［6］Fu L ，Gao Z ，Zhang X ，et al ．Frequent concomitant epigenetic si－

lencing of the stress-responsive tumor suppressor gene CADM1，and its interacting partner DAL-1in nasal NK ／T-cell lymphoma ［J ］．Int J Cancer ，2009，124（7）：1572-1578．

（收稿日期：2010-03-05）

于人染色体11q23. 2，编码由442个氨基酸残基组成

的跨膜糖蛋白，含胞外区、跨膜区和胞质区，其参与细胞间黏附、细胞运动、信号转导及免疫调节，是唯一同时参与细胞黏附和机体免疫应答的抑癌基因［6］。作为一种新发现的抑癌基因，TSLC1已被证实在多种肿瘤中表达下调或缺失，是导致肿瘤细胞增殖与侵袭能力增强的重要因素之一。TSLC1基因可作为潜在的诊断因子和药物靶点，用于多种恶性肿瘤的治疗。

制备一种效价高、特异性好的抗体，是研究疾病相关基因的表达、定位和生物学功能非常重要的一步。本研究通过RT-PCR 法扩增全长TSLC1基因序列，并采用原核系统进行表达，经Ni 2＋-NTA 柱亲和层析纯化后，获得纯度较高的TSLC1融合蛋白，在此基础上，进一步制备了特异性较强的TSLC1多克隆抗体，为深入研究该基因的功能奠定了基础。

（上接第1324页）2006，237（2）：248-255．

［8］张静敏，金宁一，连海，等．实时荧光定量PCR 方法检测人、鼠正

．中国生物制品学常组织及脑癌组织中CD109蛋白的表达［J ］杂志，2006，19（3）：249-251．

［9］陈建，王缦，陈华，等．实时荧光PCR 法快速检测乙型肝炎病毒

基因YMDD 突变株［J ］．中国生物制品学杂志，2008，21（4）：333-342．335，

［10］宣姚吉，周祥山，张元兴．实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基

因组中外源基因拷贝数［J ］．中国生物制品学杂志，2009，22（12）：1236-1239，1243．

［11］Bendtsen JD ，Nielsen H ，von Heijne G ，et al ．Improved predic－

tion of signal peptides ：SignalP 3．0［J ］．J Mol Biol ，2004，340（4）：783-795．

［12］Nielsen H ，Engelbrecht J ，Brunak S ，et al ．Identification of

prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites ［J ］．Protein Eng ，1997，10（1）：1-6．

［13］柳展基，邵凤霞，唐桂英，等．一个新的玉米NAC 类基因

（ZmNAC1）的克隆与分析［J ］．遗传，2009，31（2）：199-205．［14］朱依敏．人卵泡发育超微结构、基因表达谱的研究及未成熟卵

．杭州：浙江大学，2007．体外培养的临床应用［D ］

［15］王中原，陈光辉．神经元特异性烯醇化酶与脑损伤［J ］．医学研

究生学报，2000，13（4）：250-253．

［16］朱理安，方宁远．α-烯醇化酶—古老的蛋白，崭新的功能［J ］．

国际病理科学与临床杂志，2007，27（4）：347-350．

鹅的卵泡发育过程，进而参与调控籽鹅产蛋性能。

参考文献

［1］康波．籽鹅卵巢组织基因差异表达及产蛋相关基因定量的研究

［D ］．长春：吉林大学，2009．

［2］Kang B ，Guo JR ，Yang HM ，et al ．Differential expression profil－

ing of ovarian genes in prelaying and laying geese ［J ］．Poult Sci ，2009，88（9）：1975-1983．

［3］Wistow GJ ，Lietman T ，Williams LA ，et al ．Tau-crystallin ／alpha-enolase ：one gene encodes both an enzyme and a lens structural protein ［J ］．J Cell Biol ，1988，107（6Pt2）：2729-2736．

［4］Subramanian A ，Miller DM．Structural analysis of alpha-enolase．

Mapping the functional domains involved in down-regulation of the c-myc protooncogene ［J ］．J Biol Chem ，2000，275（8）：5958-5965．

［5］Budhia S ，Haring LF ，McConnell I ，et al ．Quantitation of ovine

cytokine mRNA by real-time RT-PCR ［J ］．J Immunol Methods ，2006，309（1-2）：160-172．

［6］Singh R ，Recions RF ，Agresti M ，et al ．Real-Time reverse tran－

scriptase polymerase chain reaction ：an improvement in detecting mRNA levels in mouse cranial tissue ［J ］．Plast Reconstr Surg ，2006，117（7）：2227-2234．

［7］Smith RA ，Lea RA ，Weinstein SR ，et al ．Detection of mRNA lev－

els for the estrogen alpha ，estrogen beta and androgen nuclear re－．Cancer Lett ，ceptor genes in archival breast cancer tissue ［J ］

（收稿日期：2010-04-02）