・220・() ・综 述・
国内银杏叶化学成分及制备工艺的研究进展
李金生 赵 琪 郝 勇
【关键词】 银杏叶; 化学成分; 制备工艺
【中图分类号】 R 284. 2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-2876(2006) 04-0220-03
[1]
银杏叶为银杏科植物银杏G inkg o biloba L. 的干燥叶。皮素232葡萄糖262鼠李糖苷、槲皮素232葡萄糖22,62二鼠李糖苷、山奈素232鼠李糖苷、山奈素232葡萄糖262鼠李糖苷、山奈素232鼠李糖222葡萄糖苷、山奈素232、山奈素232葡萄糖22,62、、异鼠李素232葡萄糖222。桂皮5:22222(62对羟基2反式2桂皮) 232鼠李糖222(62对羟基2反式2桂皮酰) 2、槲皮素232鼠李糖222(62对羟基2反式2桂皮酰2葡萄糖) 27葡萄糖苷、槲皮素232鼠李222(62对葡萄糖氧基2反式2桂皮酰) 2葡萄糖苷、山奈素232鼠糖李糖222(62对葡萄糖氧基2反式2桂皮酰) 2葡萄糖苷。
1. 1. 4 儿茶素类 儿茶素类根据母核上22位碳原子旋光性
秋季叶尚绿时采收, 及时干燥。性味甘、苦、涩、平。归心、肺经。具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效, 临床用于改善微循环, 防治心脑血管疾病等
[2,3]
。从上个世纪60年代起,
国内开始对银杏叶的化学成分、药理作用进行研究, 并相继研制成制剂应用于临床, 取得了良好的效果。有研究表明银杏叶提取物(EG B ) 改善冠心病、心绞痛总有效率为91. 33改善心电图总有效率为73. 99%
[4]
和临床治疗效果, , 点。
1 银杏叶的化学成分
银杏叶的化学成分十分复杂, 迄今为止, 在银杏叶中发现的化合物已达160多种, 但其中最重要的活性成分是黄酮类化合物和银杏内酯; 此外, 还有有机酸类、酚类、聚戊烯醇类、原花青素类和营养成分等。
1. 1 黄酮类化合物 黄酮类化合物都含有C15核, 在银杏
的不同及5′2位是否含有羟基分为4种:儿茶素、表儿茶素、没食子酸儿茶素和表没食子酸儿茶素; 药理实验表明儿茶素类具有治疗肝中毒和抗肿瘤的作用。
1. 2 萜类内酯 银杏内酯包括银杏内酯A 、B 、C 、J 、M 和白果
内酯, 其中银杏内酯M 仅存在于银杏的根皮中, 因此银杏叶中的有效活性内酯成分主要指银杏内酯A 、B 、C 、J 和白果内酯, 银杏内酯属二萜类内酯; 分子中都含6个五元环, 其中含有3个γ2内酯环和1个四氢呋喃环, 它们的侧链上均含一个叔丁基; 银杏内酯B 的活性最强, 特异性最高, 这是区别其他天然内酯化合物的重要特征, 白果内酯属倍半萜类内酯, 分子结构中仅含有一个戊烷环, 此类化合物在水溶液中易分解, 这就是不同生产工艺产品质量不稳定的主要原因。
1. 3 酚酸类 此类化合物成分属于羟基取代的水杨酸衍生
叶提取物中的含量约占5. 91%, 目前从银杏叶提取物中已分离的黄酮类化合物有40种四大类:
1. 1. 1 单黄酮 银杏叶中的单黄酮有7种; 山萘素、槲皮
[5-7]
; 根据分子结构不同, 可分为
素、异鼠李素、洋芹素、木樨草素、三粒麦黄酮、杨梅树皮素, 它们的结构中含有5,7,4’-三羟基,32OH 连接糖基, 糖基可以是单糖、双糖、三糖, 大多数为葡萄糖和鼠李糖; 前3种是其主要成分, 被作为银杏制剂质量控制的主要指标之一, 是治疗心脑血管系统疾病的有效成分。
1. 1. 2 双黄酮 双黄酮即二聚体黄酮, 通常是裸子植物的
物, 主要有白果酸、白果酚、D 2糖质酸、莽草酸和62羟基犬脲喹啉酸、银杏酸等, 研究表明银杏酚酸具有强烈的杀虫、抑菌杀菌作用以及抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种药理活性, 可用于植物农药的开发和新药的研究[8], 而另一方面此类物质具有细胞毒性, 可致过敏、致突变, 引起阵发性痉挛, 神经麻痹[9,10], 其主要毒性成分4’2甲氧基吡哆酸为维生素B 6拮抗剂, 抑制大脑中的谷氨酸转化为γ2氨基丁酸, 因此EG B 质量规定其含量必须低于5mg Πkg ; 国内市场上出售的EG B 粉末一般酚酸含量都在300～1500μg Πg 。
1. 4 其他成分 银杏叶含有17种氨基酸、蛋白质、糖类、多
特征性化学成分。在银杏叶中已发现的双黄酮有6种; 阿曼托黄素、白果黄素、银杏黄素、异银杏黄素、穗花杉双黄酮、5’2甲氧基白果黄素。分子结构皆以芹菜素3′、8″位碳链相连接而成的二聚体, 含有1～3个甲氧基。有研究表明双黄酮具有抗炎、抗组织胺的作用, 其活性随甲氧基的增加而降低。
1. 1. 3 黄酮苷 现已知的黄酮苷有17种:洋芹素272葡萄糖
苷、木樨草素232葡萄糖苷、杨梅树皮素232葡萄糖262鼠李糖苷、3’2甲基杨梅树皮素232葡萄糖262鼠李糖苷、槲皮素232鼠李糖苷、槲皮素232葡萄糖苷、槲皮素232鼠李糖222葡萄糖苷、槲
种维生素, 如维生素C 、维生素E 等。还含有游离矿物质Ca 、
Zn 、Cu 、P 、B 、Se , 其他微量元素Fe 、F 、Cr 的含量也较高。2 银杏叶有效成分的提取制备工艺
作者单位:050081 石家庄 白求恩军医学院
() ・221・
2. 1 水提取法 以水为溶剂的提取有水浸提法和水蒸汽蒸
和溶剂极性) 。侯峰等[19]通过改良C O 2的极性, 在提取的过程中有效去除银杏酚酸而活性成分银杏黄酮、内酯几乎没有损失。邓启焕等[20]以银杏叶有效成分分离为对象, 建立了一套超临界流体小试、中试装置和实验方法, 所得的提取物中银杏黄酮含量为28%, 银杏内酯含量为7. 2%, 均高于国际现行公认标准。国内学者用该法与传统的溶剂提取法相比较, 认为超临界C O 2萃取法的回收率几乎高出传统溶剂法的一倍, 但在萃取的过程中必须有改良剂的参与[21]。
2. 4 其他方法 还有细胞和组织培养合成法、微波预处理
馏法两种[11]; 这两种方法使用设备简单, 成本低, 产品安全, 但是浸出率低, 水溶性杂质含量高且不易去除, 资源浪费严重, 现在很少使用。
2. 2 有机溶剂萃取法 这是目前国内外普遍采用的方法。
提取的工艺程序较多, 提取步骤大致可归纳为两步:第一步是有机溶剂萃取得粗提物。这种方法是将银杏叶干燥、粉碎过筛, 颗粒大小约在50～70目之间, 然后用有机溶剂浸泡、萃取、过滤, 滤液中的有机溶剂用减压蒸馏去除, 得粗提物浸膏, 通常为棕黑色, 其中黄酮类含量为7%～10%, 萜类内酯为0. 6%～1%。这种方法影响有效成分产率主要因素是有机溶剂的选取, 研究表明用不同的有机溶剂提取对黄酮产率的影响各不相同
[12-15]
提取法和酶提取法。目前银杏有效成分主要来源于银杏叶, 而银杏叶有效成分的含量受地域、环境、气候、采收时间、工艺条件等影响有较大差别, 细胞组织培养合成法具有生长速度快、有克隆性、遗传性稳定、, 现已发展成[22], , 此, 有效成分得到充分解, ; 此法具有萃取效率高, 萃取时间[23]。酶提取法是在醇2水浸提之前对原料进行酶降解处理, 中南大学的王晖等研究了银杏叶黄酮的酶法提取, 黄酮得率为2. 01%, 高于直接醇2水提取得率1. 29%[24]。许明淑等在醇2水浸提时加入Suhong 475转苷酶, 以麦芽糖为糖基, 温度为50℃,pH 为6. 0～6. 5, 反应时间为10h , 总黄酮得率为44%[25]。
银杏叶作为一种天然植物, 因提取物具有独特的生理、药理、保健治疗作用, 近30年来国际国内对其理化、药理、提取工艺、临床应用进行深入研究并制定了药物质量标准, 如德国率先提出了银杏叶制剂含量的质量标准:黄酮醇糖甙≥
24%、萜内酯≥6%和白果酸
, 其中以甲醇为溶剂, 黄酮得率为17.
96mg Πg ; 以60%丙酮为溶剂, 黄酮得率为18. 11mg Πg ; 以(NH 4) 2S O 4为溶剂, 黄酮得率为6. 03mg Πg ; 以乙醇为溶剂,
不同浓度乙醇对黄酮得率有一定影响, 最佳萃取条件为:以
70%乙醇为溶剂, 温度控制在70℃, 黄酮得率为87,
以90%乙醇为溶剂, 温度控制在50℃16. 79g ; %成本低, , (即纯度高) , 是较好的提取溶剂, 。一步精制。此过程有液2液萃取和树脂吸附法两种。液2液萃取虽然设备简单, 工艺成熟, 但成本较高, 操作繁琐, 且有机溶剂残留多, 污染环境, 不宜工业化生产。葛洪等在传统工艺的基础上, 采用新型膨化和连循环逆流6级萃取工艺, 萃取率(以黄酮计) 达99%[16], 此方法操作简单, 生产稳定, 值得推广; 树脂吸附法近年来研究较多, 相对于液2液萃取操作程序简单, 成本低, 回收率高, 有机溶剂残留少, 影响此工艺提取率的因素主要是树脂、溶剂浓度、溶剂量和温度; 王若谷
[16]
界许多国家进出口银杏叶和制剂的检验标准。我国作为银杏叶资源大国, 资源拥有量约占世界总量的70%, 对银杏叶现代研究起步较晚, 银杏叶相关产业低水平重复、产品不稳定。要摆脱这种落后局面, 使之有能力参与国际大市场的激烈竞争, 应借鉴国外的先进经验, 以标准化的原料和生产工艺来生产高质量的标准化银杏叶提取物及其制剂, 在深入研究银杏叶中确切的有效成分的同时, 将传统的中医中药理论融入对资源的充分合理利用中, 推出具有中西药独特理论的药物制剂, 使其在国际上占有一定的市场份额。
参考文献
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4 邓杰, 吴难. 中药银杏叶提取物治疗冠心病心绞痛的临床研究. 中
等研究发现提取的最佳工艺条件为:用5倍、4倍70%
乙醇回流温度下加入一定量的2%的甲壳素絮凝剂, 过滤, 滤液上DM 130大孔树脂柱, 梯度洗脱, 分别浓缩干燥, 以70%
(V ΠV ) 乙醇以5倍和4倍量加热回流提取2h , 回收乙醇以
后, 调整适当比例, 加入7%量的2%浓度的甲壳素絮凝剂过滤, 滤液上DM 130树脂柱, 梯度洗脱, 洗脱液分别浓缩干燥; 用此方法提取黄酮的得率为27. 41%, 内酯得率8. 7%, 超过国际标准。应国清等以水为溶剂, 以D 201型树脂为吸附剂,
20%乙醇为脱洗剂进行分离纯化, 总黄酮的得率为71%
[18]
。
2. 3 超临界C O 2萃取法 该技术是一种新型分离技术, 利
用超临界作为萃取剂从液体中提取某种高沸点成分, 以达到分离纯化的目标。它综合了气相色谱法(CC ) 和高效液相色谱法(HP LC ) 的优点, 近年来在中药现代化的产业开发中, 此项分离技术研究和应用比较广泛。与溶剂法相比, 该方法具有提取效率高, 无溶剂残留, 无毒性, 活性成分和热不稳定性成分不易被分解破坏而保持其天然的特征等优点, 同时还可以通过控制临界温度和压力以及加入极性改良剂(改变C O 2极性) 等达到分离和纯化的目的。影响提取工艺效果的因素主要有萃取压力、萃取温度、C O 2的流量和改良剂(调整C O 2
国中医急症,1997,6(1) :528.
5 陈仲良. 银杏提取物的化学成分和制剂的质量. 中国药学杂志, 1996,31(6) :3262327.
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・222・() 17 王若谷, 邵胜荣, 范秀林. 银杏叶提取工艺研究. 药学实践杂志,
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19 侯峰, 华文俊, 姚煜东. 超临界CO 2脱除银杏叶提取物中酚酸的
展. 国外医学中医中药分册,2004,26(3) :142.
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21 韩玉谦, 隋晓. 银杏叶活性成分萃取工艺研究. 精细化工,2000,17
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16 葛洪, 房诗宏, 汪世新. .
研究. ,2006,12(4) :2.
(收稿日期:2006-04-26) (修回日期:2006-09-15)
扬州大学学报(自然科学板) (1甘 露 邱云志 苏德华 王志玲 勾凌燕
【关键词】 钙调素; 细胞增殖; 细胞周期
【中图分类号】 Q 253 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-2876(2006) 04-0222-02
钙调素(calm odulin , CaM ) 是Ca 2+调节蛋白中最保守、分布最广、调节功能最多的一种[1],1978年在纯化牛脑PDE 时发现[2], 对CaM 进行深入研究将有助于我们了解各种生理活动的发生机制, 并最终揭示细胞中生命活动的奥秘所在
1 细胞外CaM 的存在及其促进细胞增殖作用
2+
[3]
些作用。李家旭[6]用植物CaM 抗体和蛋白A 胶体金免疫电镜方法在超微结构水平定位了玉米根尖细胞CaM , 发现在细胞壁中也有少量金颗粒。这进一步证实了细胞壁中存在
CaM 的结论。Mao Neil 等
[7]
。
报道了在体液中发现了CaM 的存
在, 当把CaM 加入到培养细胞的介质中去时, 能促进细胞分裂, 并显示出与体液中的表皮生长因子(EG F ) 有定量的关系, 它随EG F 浓度的变化而变化。Boynton 等[8]研究表明, 在低钙培养基中(0. 02mm ol ΠL ) 培养鼠肝T 51B 细胞可阻止其DNA 的合成, 把培养基中钙浓度从0. 02mm ol ΠL 提高到1. 25mm ol Π
L 使得这些受抑制的细胞在1～2h 后开始合成DNA 。这种
目前已知Ca 2CaM 复合物与许多动、植物的生理过程有关, 但对其具体的作用机制还不甚了解
[5]
[4]
。为进一步研究
CaM 的功能, 人们对CaM 在组织和细胞水平的分布作了研
究。叶正华等研究结果表明小麦细胞壁中存在具有热稳定性、与动物CaM 抗体发生免疫交叉反应、依赖Ca
PDEase 的激活以及其激活受CPZ 的抑制、依赖Ca
2+
2+
的对
与苯基
疏水结合等特性的CaM , 并对细胞壁中的CaM 进行了定量, 表明存在于细胞壁中的CaM 以可溶性和离子键结合于细胞壁的两种形式存在, 并以后者为主。他们的研究表明, 用
CaM 亲和层析柱从细胞壁提取到9个亚基或多肽, 这些亚基
快速DNA 的合成对钙离子加入的响应, 可能是通过Ca 2+2
CaM 复合物来调节的。第一, 其受到公认的Ca 2CaM 拮抗
2+
剂CPZ 和TFP 的抑制。第二,TFP 所抑制的细胞可通过加入纯化的鼠CaM 来解除抑制, 并且在10～7或10～6m ol ΠL 浓度下, 纯化的CaM 本身也能像钙一样迅速而又有效地促进培养在缺钙、不含血清的培养基中细胞DNA 的合成。赵保华等[9]证实外源CaM 可促进谷子和珍珠粟原生质体细胞的第一次分裂及持续分裂, 提高胚性珍珠粟原生质体的植板率。马力耕等[10]的研究证实细胞外CaM 可以促进多种花粉的萌
或多肽可以与CaM 结合, 他们推测CaM 在细胞壁中具有某
作者单位:050081 石家庄 白求恩军医学院(甘露, 苏德华, 王志玲, 勾凌燕) ; 100030 北京 北京军区卫戍区门诊部(邱云志)
・220・() ・综 述・
国内银杏叶化学成分及制备工艺的研究进展
李金生 赵 琪 郝 勇
【关键词】 银杏叶; 化学成分; 制备工艺
【中图分类号】 R 284. 2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-2876(2006) 04-0220-03
[1]
银杏叶为银杏科植物银杏G inkg o biloba L. 的干燥叶。皮素232葡萄糖262鼠李糖苷、槲皮素232葡萄糖22,62二鼠李糖苷、山奈素232鼠李糖苷、山奈素232葡萄糖262鼠李糖苷、山奈素232鼠李糖222葡萄糖苷、山奈素232、山奈素232葡萄糖22,62、、异鼠李素232葡萄糖222。桂皮5:22222(62对羟基2反式2桂皮) 232鼠李糖222(62对羟基2反式2桂皮酰) 2、槲皮素232鼠李糖222(62对羟基2反式2桂皮酰2葡萄糖) 27葡萄糖苷、槲皮素232鼠李222(62对葡萄糖氧基2反式2桂皮酰) 2葡萄糖苷、山奈素232鼠糖李糖222(62对葡萄糖氧基2反式2桂皮酰) 2葡萄糖苷。
1. 1. 4 儿茶素类 儿茶素类根据母核上22位碳原子旋光性
秋季叶尚绿时采收, 及时干燥。性味甘、苦、涩、平。归心、肺经。具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效, 临床用于改善微循环, 防治心脑血管疾病等
[2,3]
。从上个世纪60年代起,
国内开始对银杏叶的化学成分、药理作用进行研究, 并相继研制成制剂应用于临床, 取得了良好的效果。有研究表明银杏叶提取物(EG B ) 改善冠心病、心绞痛总有效率为91. 33改善心电图总有效率为73. 99%
[4]
和临床治疗效果, , 点。
1 银杏叶的化学成分
银杏叶的化学成分十分复杂, 迄今为止, 在银杏叶中发现的化合物已达160多种, 但其中最重要的活性成分是黄酮类化合物和银杏内酯; 此外, 还有有机酸类、酚类、聚戊烯醇类、原花青素类和营养成分等。
1. 1 黄酮类化合物 黄酮类化合物都含有C15核, 在银杏
的不同及5′2位是否含有羟基分为4种:儿茶素、表儿茶素、没食子酸儿茶素和表没食子酸儿茶素; 药理实验表明儿茶素类具有治疗肝中毒和抗肿瘤的作用。
1. 2 萜类内酯 银杏内酯包括银杏内酯A 、B 、C 、J 、M 和白果
内酯, 其中银杏内酯M 仅存在于银杏的根皮中, 因此银杏叶中的有效活性内酯成分主要指银杏内酯A 、B 、C 、J 和白果内酯, 银杏内酯属二萜类内酯; 分子中都含6个五元环, 其中含有3个γ2内酯环和1个四氢呋喃环, 它们的侧链上均含一个叔丁基; 银杏内酯B 的活性最强, 特异性最高, 这是区别其他天然内酯化合物的重要特征, 白果内酯属倍半萜类内酯, 分子结构中仅含有一个戊烷环, 此类化合物在水溶液中易分解, 这就是不同生产工艺产品质量不稳定的主要原因。
1. 3 酚酸类 此类化合物成分属于羟基取代的水杨酸衍生
叶提取物中的含量约占5. 91%, 目前从银杏叶提取物中已分离的黄酮类化合物有40种四大类:
1. 1. 1 单黄酮 银杏叶中的单黄酮有7种; 山萘素、槲皮
[5-7]
; 根据分子结构不同, 可分为
素、异鼠李素、洋芹素、木樨草素、三粒麦黄酮、杨梅树皮素, 它们的结构中含有5,7,4’-三羟基,32OH 连接糖基, 糖基可以是单糖、双糖、三糖, 大多数为葡萄糖和鼠李糖; 前3种是其主要成分, 被作为银杏制剂质量控制的主要指标之一, 是治疗心脑血管系统疾病的有效成分。
1. 1. 2 双黄酮 双黄酮即二聚体黄酮, 通常是裸子植物的
物, 主要有白果酸、白果酚、D 2糖质酸、莽草酸和62羟基犬脲喹啉酸、银杏酸等, 研究表明银杏酚酸具有强烈的杀虫、抑菌杀菌作用以及抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种药理活性, 可用于植物农药的开发和新药的研究[8], 而另一方面此类物质具有细胞毒性, 可致过敏、致突变, 引起阵发性痉挛, 神经麻痹[9,10], 其主要毒性成分4’2甲氧基吡哆酸为维生素B 6拮抗剂, 抑制大脑中的谷氨酸转化为γ2氨基丁酸, 因此EG B 质量规定其含量必须低于5mg Πkg ; 国内市场上出售的EG B 粉末一般酚酸含量都在300～1500μg Πg 。
1. 4 其他成分 银杏叶含有17种氨基酸、蛋白质、糖类、多
特征性化学成分。在银杏叶中已发现的双黄酮有6种; 阿曼托黄素、白果黄素、银杏黄素、异银杏黄素、穗花杉双黄酮、5’2甲氧基白果黄素。分子结构皆以芹菜素3′、8″位碳链相连接而成的二聚体, 含有1～3个甲氧基。有研究表明双黄酮具有抗炎、抗组织胺的作用, 其活性随甲氧基的增加而降低。
1. 1. 3 黄酮苷 现已知的黄酮苷有17种:洋芹素272葡萄糖
苷、木樨草素232葡萄糖苷、杨梅树皮素232葡萄糖262鼠李糖苷、3’2甲基杨梅树皮素232葡萄糖262鼠李糖苷、槲皮素232鼠李糖苷、槲皮素232葡萄糖苷、槲皮素232鼠李糖222葡萄糖苷、槲
种维生素, 如维生素C 、维生素E 等。还含有游离矿物质Ca 、
Zn 、Cu 、P 、B 、Se , 其他微量元素Fe 、F 、Cr 的含量也较高。2 银杏叶有效成分的提取制备工艺
作者单位:050081 石家庄 白求恩军医学院
() ・221・
2. 1 水提取法 以水为溶剂的提取有水浸提法和水蒸汽蒸
和溶剂极性) 。侯峰等[19]通过改良C O 2的极性, 在提取的过程中有效去除银杏酚酸而活性成分银杏黄酮、内酯几乎没有损失。邓启焕等[20]以银杏叶有效成分分离为对象, 建立了一套超临界流体小试、中试装置和实验方法, 所得的提取物中银杏黄酮含量为28%, 银杏内酯含量为7. 2%, 均高于国际现行公认标准。国内学者用该法与传统的溶剂提取法相比较, 认为超临界C O 2萃取法的回收率几乎高出传统溶剂法的一倍, 但在萃取的过程中必须有改良剂的参与[21]。
2. 4 其他方法 还有细胞和组织培养合成法、微波预处理
馏法两种[11]; 这两种方法使用设备简单, 成本低, 产品安全, 但是浸出率低, 水溶性杂质含量高且不易去除, 资源浪费严重, 现在很少使用。
2. 2 有机溶剂萃取法 这是目前国内外普遍采用的方法。
提取的工艺程序较多, 提取步骤大致可归纳为两步:第一步是有机溶剂萃取得粗提物。这种方法是将银杏叶干燥、粉碎过筛, 颗粒大小约在50～70目之间, 然后用有机溶剂浸泡、萃取、过滤, 滤液中的有机溶剂用减压蒸馏去除, 得粗提物浸膏, 通常为棕黑色, 其中黄酮类含量为7%～10%, 萜类内酯为0. 6%～1%。这种方法影响有效成分产率主要因素是有机溶剂的选取, 研究表明用不同的有机溶剂提取对黄酮产率的影响各不相同
[12-15]
提取法和酶提取法。目前银杏有效成分主要来源于银杏叶, 而银杏叶有效成分的含量受地域、环境、气候、采收时间、工艺条件等影响有较大差别, 细胞组织培养合成法具有生长速度快、有克隆性、遗传性稳定、, 现已发展成[22], , 此, 有效成分得到充分解, ; 此法具有萃取效率高, 萃取时间[23]。酶提取法是在醇2水浸提之前对原料进行酶降解处理, 中南大学的王晖等研究了银杏叶黄酮的酶法提取, 黄酮得率为2. 01%, 高于直接醇2水提取得率1. 29%[24]。许明淑等在醇2水浸提时加入Suhong 475转苷酶, 以麦芽糖为糖基, 温度为50℃,pH 为6. 0～6. 5, 反应时间为10h , 总黄酮得率为44%[25]。
银杏叶作为一种天然植物, 因提取物具有独特的生理、药理、保健治疗作用, 近30年来国际国内对其理化、药理、提取工艺、临床应用进行深入研究并制定了药物质量标准, 如德国率先提出了银杏叶制剂含量的质量标准:黄酮醇糖甙≥
24%、萜内酯≥6%和白果酸
, 其中以甲醇为溶剂, 黄酮得率为17.
96mg Πg ; 以60%丙酮为溶剂, 黄酮得率为18. 11mg Πg ; 以(NH 4) 2S O 4为溶剂, 黄酮得率为6. 03mg Πg ; 以乙醇为溶剂,
不同浓度乙醇对黄酮得率有一定影响, 最佳萃取条件为:以
70%乙醇为溶剂, 温度控制在70℃, 黄酮得率为87,
以90%乙醇为溶剂, 温度控制在50℃16. 79g ; %成本低, , (即纯度高) , 是较好的提取溶剂, 。一步精制。此过程有液2液萃取和树脂吸附法两种。液2液萃取虽然设备简单, 工艺成熟, 但成本较高, 操作繁琐, 且有机溶剂残留多, 污染环境, 不宜工业化生产。葛洪等在传统工艺的基础上, 采用新型膨化和连循环逆流6级萃取工艺, 萃取率(以黄酮计) 达99%[16], 此方法操作简单, 生产稳定, 值得推广; 树脂吸附法近年来研究较多, 相对于液2液萃取操作程序简单, 成本低, 回收率高, 有机溶剂残留少, 影响此工艺提取率的因素主要是树脂、溶剂浓度、溶剂量和温度; 王若谷
[16]
界许多国家进出口银杏叶和制剂的检验标准。我国作为银杏叶资源大国, 资源拥有量约占世界总量的70%, 对银杏叶现代研究起步较晚, 银杏叶相关产业低水平重复、产品不稳定。要摆脱这种落后局面, 使之有能力参与国际大市场的激烈竞争, 应借鉴国外的先进经验, 以标准化的原料和生产工艺来生产高质量的标准化银杏叶提取物及其制剂, 在深入研究银杏叶中确切的有效成分的同时, 将传统的中医中药理论融入对资源的充分合理利用中, 推出具有中西药独特理论的药物制剂, 使其在国际上占有一定的市场份额。
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等研究发现提取的最佳工艺条件为:用5倍、4倍70%
乙醇回流温度下加入一定量的2%的甲壳素絮凝剂, 过滤, 滤液上DM 130大孔树脂柱, 梯度洗脱, 分别浓缩干燥, 以70%
(V ΠV ) 乙醇以5倍和4倍量加热回流提取2h , 回收乙醇以
后, 调整适当比例, 加入7%量的2%浓度的甲壳素絮凝剂过滤, 滤液上DM 130树脂柱, 梯度洗脱, 洗脱液分别浓缩干燥; 用此方法提取黄酮的得率为27. 41%, 内酯得率8. 7%, 超过国际标准。应国清等以水为溶剂, 以D 201型树脂为吸附剂,
20%乙醇为脱洗剂进行分离纯化, 总黄酮的得率为71%
[18]
。
2. 3 超临界C O 2萃取法 该技术是一种新型分离技术, 利
用超临界作为萃取剂从液体中提取某种高沸点成分, 以达到分离纯化的目标。它综合了气相色谱法(CC ) 和高效液相色谱法(HP LC ) 的优点, 近年来在中药现代化的产业开发中, 此项分离技术研究和应用比较广泛。与溶剂法相比, 该方法具有提取效率高, 无溶剂残留, 无毒性, 活性成分和热不稳定性成分不易被分解破坏而保持其天然的特征等优点, 同时还可以通过控制临界温度和压力以及加入极性改良剂(改变C O 2极性) 等达到分离和纯化的目的。影响提取工艺效果的因素主要有萃取压力、萃取温度、C O 2的流量和改良剂(调整C O 2
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(收稿日期:2006-04-26) (修回日期:2006-09-15)
扬州大学学报(自然科学板) (1甘 露 邱云志 苏德华 王志玲 勾凌燕
【关键词】 钙调素; 细胞增殖; 细胞周期
【中图分类号】 Q 253 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-2876(2006) 04-0222-02
钙调素(calm odulin , CaM ) 是Ca 2+调节蛋白中最保守、分布最广、调节功能最多的一种[1],1978年在纯化牛脑PDE 时发现[2], 对CaM 进行深入研究将有助于我们了解各种生理活动的发生机制, 并最终揭示细胞中生命活动的奥秘所在
1 细胞外CaM 的存在及其促进细胞增殖作用
2+
[3]
些作用。李家旭[6]用植物CaM 抗体和蛋白A 胶体金免疫电镜方法在超微结构水平定位了玉米根尖细胞CaM , 发现在细胞壁中也有少量金颗粒。这进一步证实了细胞壁中存在
CaM 的结论。Mao Neil 等
[7]
。
报道了在体液中发现了CaM 的存
在, 当把CaM 加入到培养细胞的介质中去时, 能促进细胞分裂, 并显示出与体液中的表皮生长因子(EG F ) 有定量的关系, 它随EG F 浓度的变化而变化。Boynton 等[8]研究表明, 在低钙培养基中(0. 02mm ol ΠL ) 培养鼠肝T 51B 细胞可阻止其DNA 的合成, 把培养基中钙浓度从0. 02mm ol ΠL 提高到1. 25mm ol Π
L 使得这些受抑制的细胞在1～2h 后开始合成DNA 。这种
目前已知Ca 2CaM 复合物与许多动、植物的生理过程有关, 但对其具体的作用机制还不甚了解
[5]
[4]
。为进一步研究
CaM 的功能, 人们对CaM 在组织和细胞水平的分布作了研
究。叶正华等研究结果表明小麦细胞壁中存在具有热稳定性、与动物CaM 抗体发生免疫交叉反应、依赖Ca
PDEase 的激活以及其激活受CPZ 的抑制、依赖Ca
2+
2+
的对
与苯基
疏水结合等特性的CaM , 并对细胞壁中的CaM 进行了定量, 表明存在于细胞壁中的CaM 以可溶性和离子键结合于细胞壁的两种形式存在, 并以后者为主。他们的研究表明, 用
CaM 亲和层析柱从细胞壁提取到9个亚基或多肽, 这些亚基
快速DNA 的合成对钙离子加入的响应, 可能是通过Ca 2+2
CaM 复合物来调节的。第一, 其受到公认的Ca 2CaM 拮抗
2+
剂CPZ 和TFP 的抑制。第二,TFP 所抑制的细胞可通过加入纯化的鼠CaM 来解除抑制, 并且在10～7或10～6m ol ΠL 浓度下, 纯化的CaM 本身也能像钙一样迅速而又有效地促进培养在缺钙、不含血清的培养基中细胞DNA 的合成。赵保华等[9]证实外源CaM 可促进谷子和珍珠粟原生质体细胞的第一次分裂及持续分裂, 提高胚性珍珠粟原生质体的植板率。马力耕等[10]的研究证实细胞外CaM 可以促进多种花粉的萌
或多肽可以与CaM 结合, 他们推测CaM 在细胞壁中具有某
作者单位:050081 石家庄 白求恩军医学院(甘露, 苏德华, 王志玲, 勾凌燕) ; 100030 北京 北京军区卫戍区门诊部(邱云志)