2013第十五卷第二期★Vol.15No.2
丹参总酚酸类成分的提取纯化工艺
和质量研究＊
□张秋燕
张盈颖
崔翰明＊＊
北京
100053）
（中国中医科学院广安门医院
摘要：目的：提取纯化丹参中水溶性酚酸类有效成分，并对其进行质量分析。方法：以HPLC 检
采用单因素和正交试验优化丹参的提取工艺；采用大孔吸附树脂法纯化丹参水测丹酚酸B 的含量，
制定相应质量标准。结果：溶性成分，并对丹参及其提取物的水溶性成分进行HPLC 指纹图谱研究，
丹参总酚酸提取物中主要水溶性成分丹酚酸B 的提取转移率达85%，提取纯化物中含丹酚酸B>65%，其他丹酚酸12%；相应HPLC 指纹图谱分析方法可有效分析和鉴别主要水溶性成分的特征峰。结论：该方法能够快速高效分离纯化丹参水溶性成分，得到较高纯度的丹参总酚酸；HPLC 指纹图谱分析方法的精密度、重复性良好。
关键词：丹酚酸柱色谱高效液相色谱指纹图谱doi:10.11842/wst.2013.02.029中图分类号：R284文献标识码：A
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia milti －orrhiza Bunge 的干燥根及根茎，性苦，微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，普遍用于心血管疾病的治疗。丹参的有效成分主要为丹酚酸类和丹参酮类。丹酚酸类化合物以抗氧
化、抗凝血和细胞保护作用为主[1]；丹参酮类化合物以改善血液循环、抗菌和抗炎作用为主[2]，具有显著的抗菌和温和的性激素样作用[3]。丹酚酸类是由不同个数的丹参素（β-3,4-二羟苯乳酸，β-3,4-di －hydroxybenyllactic acid ）和咖啡酸缩合而成，主要有丹酚酸A ，B ，C ，迷迭香酸(rosmarinicacid) 和丹参素、原儿茶醛等。
本研究以HPLC 检测丹酚酸B 的含量，采用醇
收稿日期：2012-08-06修回日期：2012-08-31
＊＊＊
提和水提相结合的方法，分别提取丹参脂溶性和水溶性成分，单因素和正交试验优化丹参的提取工艺；采用大孔吸附树脂柱色谱法纯化丹参水溶性成
分，并对丹参及其总酚酸提取物进行HPLC 指纹图谱研究，制定相应质量标准。
一、材料
1. Agilent 1200型液相色谱仪，岛津CLASS-LC10型液相色谱仪；Agilent TC C 18（4.6mm ×150mm ，5μm ）色谱柱和保护柱；Kromasil 100-5C 18（4.6mm ×250mm ，5μm ）色谱柱；FA2104型1/万级电子天平；高纯水机（Millipore ）；SY7200DH 型超声仪；DRT-TW 型调温电热套；玻璃色谱柱（30mm ×410mm ）。
国家重大新药创制科技重大专项（2009ZX09103-355）：活血安心方治疗冠心病组分配伍优化研究，负责人：王阶。通讯作者：崔翰明，副研究员，主要研究方向：中药药效物质和新药开发。
299〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
世界科学技术—中医药现代化★技术应用研究
2. 甲醇和乙腈（Fisher ，色谱级），98%甲酸（北京化学试剂公司），药用乙醇（北京市远弘药用酒精有限责任公司），高纯水（自制）；丹参素钠、丹酚酸B 、原儿茶醛对照品均购自中国药品生物制品检定所（批111562-200605,110810-号分别为110855-200508，
200506）；迷迭香酸（批号：09092931）购自上海同田生物技术有限公司；丹参来自天士力商洛GAP 种植基地。
二、方法与结果
1. （1）丹酚酸Ｂ含量测定的色谱条件。
Agilent C 18色谱柱（4.6mm ×150mm ，5μm ），流动相甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59) ，流速1mL ·min -1，检测波长286nm, 柱温为室温，进样量10μL 。
（2）丹酚酸Ｂ含量测定的方法学考察。丹酚酸B 的标准曲线为Y =5066.1X －1276（R 2=0.9999），丹酚酸B 在4.04~404mg ·L -1线性关
日间差RSD 2.0%；低中系良好；精密度RSD 1.7%；高各浓度的回收率分别为97.4%，98.3%，98.7%；测
表1
水平123
A 溶剂种类纯水
·L -1盐酸0.1mol
0.05mol ·L -1盐酸
表2
No. 123456789均值1均值2均值3极差
所用溶剂
[1**********]2.105168.659254.221193.446
定重复性RSD 1.6%（n =6）。
2. （1）正交试验考察水提工艺的影响因素。先醇提取丹参酮类，药渣平均分成9等份，采用煎煮法进行水提正交试验的考察。根据文献[4]和预实验，确定正交试验的考察因素为溶剂种类（A ），溶剂用量（B ），提取时间（C ），提取次数（D ），各因素选取3个水平，见表1。
按正交表进行实验，以HPLC 测定提取液中丹酚酸B 的含量，计算提取率，从影响效果来看，各因素的影响大小顺序为A >D >C >B ，故可选的最佳提取条件
即用8倍量的纯水提取1.5h ，提取3次。为A 1D 3C 2B 2，
（2）单因素考察提取时间对水溶性成份的影响。将丹参醇提后的药渣采用水煎煮法提取，提取时间分别为0.5，1，1.5h ，将提取液稀释过滤后，
HPLC 测定丹酚酸B 的含量，计算提取率，当提取时间为0.5h 时，提取效果较好，与丹酚酸B 的热不稳定性研究结果一致[5]。
3. （1）树脂的选择。
静态饱和吸附法：称取丹参水提物40.3g ，加水
丹参水溶性成份提取工艺影响因素水平考察
B 溶剂用量/倍
6810
C 提取时间/h
11.52
D 提取次数/次
123
丹参水溶性成分提取工艺结果直观分析溶剂用量
[1**********]1.039293.112280.83482.073
提取时间
[1**********]8.120322.579234.28694.459
提取次数
[1**********]1.023280.468303.493102.470
300
丹酚酸B 量/mg
217.302473.279395.733220.785112.096173.097195.029293.961273.672
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
2013第十五卷第二期★Vol.15No.2
表3
因素溶剂种类溶剂用量提取时间提取次数误差
偏差平方和56380.79611758.17016756.05417341.676102236.70
丹参水溶性成分正交试验结果方差分析
自由度22228
F 比2.2060.4600.6560.678
F 临界值4.4604.4604.4604.460
至300mL 超声，配成水溶液。选择处理好的大孔吸附树脂HPD100，HPD450，HPD600，
浓度/m g ·L -1
[1**********]0
浓度/m g ·L -1
[***********]00
50
100
150
流出液体积/mL
-500
50
100
150
流出液体积/mL
A
[***********]00500
B
HPD700，HP70，HP2MGL ，SP700，SP825，X-5，S-8，D4020，H103，AB-8适量，用纯水冲洗并抽干，各称量5g ，置于锥形瓶中，分别加入丹参水溶液20mL ，水浴恒温振摇24h ；吸附后的溶液过滤，采用丹酚酸B HPLC 色谱条件测定，根据各树脂对丹酚酸B 的静态吸附量选择适合纯化丹参水溶性成份的树
S-8，HPD4503脂。结果AB-8，
种树脂吸附量较大，故选择此
3种树脂。
[**************]0浓度/m g ·L -1
[***********]00-5000图1
50
100
C
吸附曲线法选择树脂取5g
处理好的AB -8，S -8，HPD4503种树脂分别装柱。丹参水提液采用丹酚酸B HPLC 色谱条件测定，结果丹酚酸B 质量浓度为4.2g ·L -1。将溶液上样，每10mL 取样1次，25倍量稀释，然后测定流出液中丹酚酸B 含量，根据流出液体积和丹酚酸B 的质量浓度绘制吸附曲线，
150
流出液体积/mL
不同型号大孔吸附树脂的吸附曲线注：A. AB-8；B. S-8；C. HPD450。
结果见图1。
根据吸附曲线可知，HPD450，AB-8树脂对丹参水溶性成分的吸附较好，最佳吸附量约为25mg ·g -1，故选择HPD450，AB -8树脂考察解吸附曲线及洗脱剂。
（2）洗脱溶剂和方法的考察。选用处理好的HPD450，AB-8树脂分别装柱，柱床体积为10cm 3。丹参水提液上样量30mL ，用
301
水冲洗，每5mL 取样1次，共取10个点，5倍量稀释，HPLC 测定。分别用10%，20%，30%，40%乙醇溶
液洗脱，每0.5BV 取样1次，5倍量稀释后，进行丹酚酸B 的含量测定。绘制30%，40%醇洗脱时的解吸附曲线图，见图2。选择合适的杂质冲洗溶剂种类及用量、确定洗脱剂种类及其用量。
AB -8树脂用30%，40%乙醇洗脱效果相当，
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
世界科学技术—中医药现代化★技术应用研究
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
[***********]40002000
00
2
4
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
A
系列1
9
87654321
[***********]0000000000
5流出液体积/倍
B
系列1
610
流出液体积/倍
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
9
[***********][***********]
2
4
流出液体积/倍
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
[***********]0000000000
C
D
系列1系列1
6246
流出液体积/倍
图2不同体积分数乙醇的洗脱曲线
注：A. 30%乙醇（AB-8）；B. 40%乙醇（AB-8）；C. 30%乙醇（HPD450）；D. 40%乙醇（HPD450）。
HPD450用40%乙醇洗脱效果较好。最终选用HPD450树脂纯化丹参水提物，洗脱时先用2BV 水
冲洗，再用2BV 40%乙醇洗脱，收集40%醇的洗脱液，减压回收乙醇，干燥后即得纯化好的丹参总酚酸类有效部位。
4. 按上述所得结果提取丹参药材1kg ，醇提后的药渣用8倍量纯水煎煮提取0.5h ，提取3次，平行提取3份，然后分别对丹参水溶性成分进行HPD450大孔树脂纯化，上样后先用2BV 纯水除杂，再用2BV 40%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，喷雾干燥，所得粉末即为丹参水溶性纯化物，HPLC 测定丹酚酸B 含量，结果分别为71.6%，70%，72.35%，显示此种方法提取纯化丹酚酸B 的效果较好。
5. （1）丹参水溶性成分指纹图谱的色谱条件。Kromasil C 18色谱柱（4.6mm ×250mm ，5μm ），检测波长286nm ，柱温30℃，进样量10μL ，流速1.0mL ·min -1，流动相乙腈-1.5%甲酸梯度洗脱，见表4。
（2）丹参药材水溶性供试液的制备。
精密称取丹参药材粗粉2.0000g ，20%甲醇40mL 浸泡20min ，称定质量，加热超声提取40min ，加热温度控制在55℃~60℃，放置室温后补足溶剂损失，用0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液即为样品供试液，按上述的色谱条件测定，色谱图见图3。
（2）丹参水溶性成分提取物供试液的考察。精密称定水溶性纯化物粉末14.38mg ，用75%甲醇溶解并定容至5mL 量瓶中, 用0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液备用为供试液，按上述的色谱条件测定，色谱图见图4。
HPLC 指纹图谱经对照品比对和质谱鉴定，峰1
表4
[1**********]0
丹参水溶性成分指纹图谱流动相梯度洗脱
乙腈/%[1**********]100
1.5%甲酸/%
[1**********]50
302
t /min
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
2013第十五卷第二期★Vol.15No.2
7
取率可知，较短的加热时间不仅可以有效地提取丹酚酸B ，而且可以减缓加热对丹酚酸B 提取率的影响。
在丹参水溶性成分的纯化中，重点考察了吸附树脂、洗脱剂
6
1
23
4
5
及其用量，并优化了各项工艺参数。HPD450大孔吸附树脂对丹参总酚酸有较高的吸附能力，采用40%乙醇洗脱时，洗脱能力较强，能快速有效地洗脱丹参总酚酸类成分，与文献[8~10]中关于丹参大孔树脂的纯化方案相比更为经济，
7
10
图3
20
30
t /min
4050min
丹参药材水溶性成分HPLC 图
纯化后丹酚酸B 的纯度>65%。采用网格法优化HPLC 指纹图谱的色谱条件，重点考察了流动相和梯度洗脱条件。流动相选用1.5%甲酸水溶液可有效地改善峰形；在优化后的梯度洗脱条件下，特征峰均有较好的分离度和重现性，主要峰的保留时间和峰面积的精密度和稳定性良好，可有效评价丹参药材及其水溶性提取物的质量。
6
1
32
4
5
10
图4
20
30t /min
4050min
在水溶性成分的HPLC 指纹图谱试验中，通过正交设计的方法对供试品溶液的制备方法进行
丹参总酚酸纯化物HPLC 图
为丹参素，峰2为原儿茶醛，峰3为咖啡酸，峰4为迷迭香酸，峰6，7分别为丹酚酸A ，B 。
三、讨论
在丹参提取工艺中，采用醇提和水提相结合的方法分别提取丹参脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类成分，同时用单因素试验考察醇提对水溶性成分的影响，通过指纹图谱加以分析。有文献认为丹酚酸B 的pH 稳定性主要是由丹酚酸B 的pKa 决定的[6]，在pH 1～7，降解速率在高pH 明显比低pH 高[7]，因此提取溶剂重点考察了纯水和不同浓度的酸性水溶液，结果显示提取溶剂对提取影响较大，纯水的提取效果优于酸水。由于丹酚酸B 受热不稳定[5]，故采用单因素试验进一步考察提取时间对丹酚酸B 的影响，通过比较丹酚酸B 的提
303
了考察，对丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B 等特征峰进行分析，筛选出20%甲醇浸泡，加热（55℃
~60℃）超声提取40min 的样品制备方法，以此方法为基础测得的丹参HPLC 指纹图谱图形较好，主要峰特征性强，重现性好，多数峰分离度好，可以有效控制丹参及其提取物和总酚酸的质量。
参考文献
1杜冠华，张均田. 丹参现代研究概况与进展（续一）. 医药导报,2004，23（6）∶355~360.
2吴杲, 何招兵，吴汉斌. 丹参酮的药理作用研究进展. 现代中西医结合杂志,2005，14（10）∶1382~1385.
3周立运，朱晓新. 丹参及其化学成分药代动力学研究的进展. 中国实验方剂学杂志，2005,11（3）∶66~69.
4韦英杰，刘媛，陈宁，等. 正交试验法优选丹参的提取新工艺. 中药研究与信息，2005，7（11）∶13~15.
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
世界科学技术—中医药现代化★技术应用研究
5张军，王凤云，詹丽玲，等. 丹参药材提取液中丹酚酸B 稳定性影响因素的考察. 中国中药杂志，2005，30（10）∶789~790.
潘桂湘，张艳斌. 丹酚酸B 在模拟消化道体液中的稳定6柴世伟，
2006，23(4)∶3322~3331.性研究. 天津中医药，
崔翰明，张秋燕，等. 丹参提取物中的丹酚酸B 在不同pH 7张春光，
条件下的稳定性研究. 中国实验方剂学杂志，2009，15(1)∶3~5.
8房信胜，谭晓梅. 大孔吸附树脂纯化丹参总酚酸的定性定量分析. 中国中药杂志，2005，30（17）∶1331~1334.
贺英菊，罗巍伟. 大孔吸附树脂吸附纯化丹参提取液的影9王凌，
医学版，2004，35（5）∶736~737.响因素. 四川大学学报：
刘玉强，范晋勇，等. 大孔吸附树脂富集丹参中水溶性成10王志平，
份的研究. 中草药，2003，34（10）∶908~909.
Study on Extraction and Purification of Salvia Miltiorrhiza Total Phenolic
Acids Process and Quality Analysis
Zhang Qiuyan, Zhang Yingying, Cui Hanming
(Guang'anmenHospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)
Abstract:This study was aimed to extract and purify active components of Salvia miltiorrhiza and to determinate the relevant quality analysis. The high-performance liquid chromatography (HPLC)method of salvianolic acid B was established. Factors influencing the extraction were investigated with a single -factor and orthogonal design. The water-soluble components of S. miltiorrhiza were purified with macroporous resin. The HPLC fingerprint of S. miltiorrhiza and its purified extract were studied, and the quality specification was established. The results showed that the transfer rate of salvianolic acid B was up to 85%, contents of salvianolic acid B were 65%, and other salvianolic acid is about 12%.The HPLC fingerprint analysis method can effectively analyze and identify the main characteristic peaks of water -soluble components. It was concluded that the method can quickly and effi -ciently purify S. miltiorrhiza water -soluble components. The high -purity salvianolic acid components were ob -tained. The HPLC fingerprint method has good precision and reproducibility. Keywords:Salvianolic acid, column chromatography, HPLC, fingerprint
（责任编辑：鲍
雷
张志华，责任译审：王
晶）
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕304
2013第十五卷第二期★Vol.15No.2
丹参总酚酸类成分的提取纯化工艺
和质量研究＊
□张秋燕
张盈颖
崔翰明＊＊
北京
100053）
（中国中医科学院广安门医院
摘要：目的：提取纯化丹参中水溶性酚酸类有效成分，并对其进行质量分析。方法：以HPLC 检
采用单因素和正交试验优化丹参的提取工艺；采用大孔吸附树脂法纯化丹参水测丹酚酸B 的含量，
制定相应质量标准。结果：溶性成分，并对丹参及其提取物的水溶性成分进行HPLC 指纹图谱研究，
丹参总酚酸提取物中主要水溶性成分丹酚酸B 的提取转移率达85%，提取纯化物中含丹酚酸B>65%，其他丹酚酸12%；相应HPLC 指纹图谱分析方法可有效分析和鉴别主要水溶性成分的特征峰。结论：该方法能够快速高效分离纯化丹参水溶性成分，得到较高纯度的丹参总酚酸；HPLC 指纹图谱分析方法的精密度、重复性良好。
关键词：丹酚酸柱色谱高效液相色谱指纹图谱doi:10.11842/wst.2013.02.029中图分类号：R284文献标识码：A
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia milti －orrhiza Bunge 的干燥根及根茎，性苦，微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，普遍用于心血管疾病的治疗。丹参的有效成分主要为丹酚酸类和丹参酮类。丹酚酸类化合物以抗氧
化、抗凝血和细胞保护作用为主[1]；丹参酮类化合物以改善血液循环、抗菌和抗炎作用为主[2]，具有显著的抗菌和温和的性激素样作用[3]。丹酚酸类是由不同个数的丹参素（β-3,4-二羟苯乳酸，β-3,4-di －hydroxybenyllactic acid ）和咖啡酸缩合而成，主要有丹酚酸A ，B ，C ，迷迭香酸(rosmarinicacid) 和丹参素、原儿茶醛等。
本研究以HPLC 检测丹酚酸B 的含量，采用醇
收稿日期：2012-08-06修回日期：2012-08-31
＊＊＊
提和水提相结合的方法，分别提取丹参脂溶性和水溶性成分，单因素和正交试验优化丹参的提取工艺；采用大孔吸附树脂柱色谱法纯化丹参水溶性成
分，并对丹参及其总酚酸提取物进行HPLC 指纹图谱研究，制定相应质量标准。
一、材料
1. Agilent 1200型液相色谱仪，岛津CLASS-LC10型液相色谱仪；Agilent TC C 18（4.6mm ×150mm ，5μm ）色谱柱和保护柱；Kromasil 100-5C 18（4.6mm ×250mm ，5μm ）色谱柱；FA2104型1/万级电子天平；高纯水机（Millipore ）；SY7200DH 型超声仪；DRT-TW 型调温电热套；玻璃色谱柱（30mm ×410mm ）。
国家重大新药创制科技重大专项（2009ZX09103-355）：活血安心方治疗冠心病组分配伍优化研究，负责人：王阶。通讯作者：崔翰明，副研究员，主要研究方向：中药药效物质和新药开发。
299〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
世界科学技术—中医药现代化★技术应用研究
2. 甲醇和乙腈（Fisher ，色谱级），98%甲酸（北京化学试剂公司），药用乙醇（北京市远弘药用酒精有限责任公司），高纯水（自制）；丹参素钠、丹酚酸B 、原儿茶醛对照品均购自中国药品生物制品检定所（批111562-200605,110810-号分别为110855-200508，
200506）；迷迭香酸（批号：09092931）购自上海同田生物技术有限公司；丹参来自天士力商洛GAP 种植基地。
二、方法与结果
1. （1）丹酚酸Ｂ含量测定的色谱条件。
Agilent C 18色谱柱（4.6mm ×150mm ，5μm ），流动相甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59) ，流速1mL ·min -1，检测波长286nm, 柱温为室温，进样量10μL 。
（2）丹酚酸Ｂ含量测定的方法学考察。丹酚酸B 的标准曲线为Y =5066.1X －1276（R 2=0.9999），丹酚酸B 在4.04~404mg ·L -1线性关
日间差RSD 2.0%；低中系良好；精密度RSD 1.7%；高各浓度的回收率分别为97.4%，98.3%，98.7%；测
表1
水平123
A 溶剂种类纯水
·L -1盐酸0.1mol
0.05mol ·L -1盐酸
表2
No. 123456789均值1均值2均值3极差
所用溶剂
[1**********]2.105168.659254.221193.446
定重复性RSD 1.6%（n =6）。
2. （1）正交试验考察水提工艺的影响因素。先醇提取丹参酮类，药渣平均分成9等份，采用煎煮法进行水提正交试验的考察。根据文献[4]和预实验，确定正交试验的考察因素为溶剂种类（A ），溶剂用量（B ），提取时间（C ），提取次数（D ），各因素选取3个水平，见表1。
按正交表进行实验，以HPLC 测定提取液中丹酚酸B 的含量，计算提取率，从影响效果来看，各因素的影响大小顺序为A >D >C >B ，故可选的最佳提取条件
即用8倍量的纯水提取1.5h ，提取3次。为A 1D 3C 2B 2，
（2）单因素考察提取时间对水溶性成份的影响。将丹参醇提后的药渣采用水煎煮法提取，提取时间分别为0.5，1，1.5h ，将提取液稀释过滤后，
HPLC 测定丹酚酸B 的含量，计算提取率，当提取时间为0.5h 时，提取效果较好，与丹酚酸B 的热不稳定性研究结果一致[5]。
3. （1）树脂的选择。
静态饱和吸附法：称取丹参水提物40.3g ，加水
丹参水溶性成份提取工艺影响因素水平考察
B 溶剂用量/倍
6810
C 提取时间/h
11.52
D 提取次数/次
123
丹参水溶性成分提取工艺结果直观分析溶剂用量
[1**********]1.039293.112280.83482.073
提取时间
[1**********]8.120322.579234.28694.459
提取次数
[1**********]1.023280.468303.493102.470
300
丹酚酸B 量/mg
217.302473.279395.733220.785112.096173.097195.029293.961273.672
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
2013第十五卷第二期★Vol.15No.2
表3
因素溶剂种类溶剂用量提取时间提取次数误差
偏差平方和56380.79611758.17016756.05417341.676102236.70
丹参水溶性成分正交试验结果方差分析
自由度22228
F 比2.2060.4600.6560.678
F 临界值4.4604.4604.4604.460
至300mL 超声，配成水溶液。选择处理好的大孔吸附树脂HPD100，HPD450，HPD600，
浓度/m g ·L -1
[1**********]0
浓度/m g ·L -1
[***********]00
50
100
150
流出液体积/mL
-500
50
100
150
流出液体积/mL
A
[***********]00500
B
HPD700，HP70，HP2MGL ，SP700，SP825，X-5，S-8，D4020，H103，AB-8适量，用纯水冲洗并抽干，各称量5g ，置于锥形瓶中，分别加入丹参水溶液20mL ，水浴恒温振摇24h ；吸附后的溶液过滤，采用丹酚酸B HPLC 色谱条件测定，根据各树脂对丹酚酸B 的静态吸附量选择适合纯化丹参水溶性成份的树
S-8，HPD4503脂。结果AB-8，
种树脂吸附量较大，故选择此
3种树脂。
[**************]0浓度/m g ·L -1
[***********]00-5000图1
50
100
C
吸附曲线法选择树脂取5g
处理好的AB -8，S -8，HPD4503种树脂分别装柱。丹参水提液采用丹酚酸B HPLC 色谱条件测定，结果丹酚酸B 质量浓度为4.2g ·L -1。将溶液上样，每10mL 取样1次，25倍量稀释，然后测定流出液中丹酚酸B 含量，根据流出液体积和丹酚酸B 的质量浓度绘制吸附曲线，
150
流出液体积/mL
不同型号大孔吸附树脂的吸附曲线注：A. AB-8；B. S-8；C. HPD450。
结果见图1。
根据吸附曲线可知，HPD450，AB-8树脂对丹参水溶性成分的吸附较好，最佳吸附量约为25mg ·g -1，故选择HPD450，AB -8树脂考察解吸附曲线及洗脱剂。
（2）洗脱溶剂和方法的考察。选用处理好的HPD450，AB-8树脂分别装柱，柱床体积为10cm 3。丹参水提液上样量30mL ，用
301
水冲洗，每5mL 取样1次，共取10个点，5倍量稀释，HPLC 测定。分别用10%，20%，30%，40%乙醇溶
液洗脱，每0.5BV 取样1次，5倍量稀释后，进行丹酚酸B 的含量测定。绘制30%，40%醇洗脱时的解吸附曲线图，见图2。选择合适的杂质冲洗溶剂种类及用量、确定洗脱剂种类及其用量。
AB -8树脂用30%，40%乙醇洗脱效果相当，
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
世界科学技术—中医药现代化★技术应用研究
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
[***********]40002000
00
2
4
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
A
系列1
9
87654321
[***********]0000000000
5流出液体积/倍
B
系列1
610
流出液体积/倍
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
9
[***********][***********]
2
4
流出液体积/倍
流出液丹酚酸B 浓度/m g ·L -1
[***********]0000000000
C
D
系列1系列1
6246
流出液体积/倍
图2不同体积分数乙醇的洗脱曲线
注：A. 30%乙醇（AB-8）；B. 40%乙醇（AB-8）；C. 30%乙醇（HPD450）；D. 40%乙醇（HPD450）。
HPD450用40%乙醇洗脱效果较好。最终选用HPD450树脂纯化丹参水提物，洗脱时先用2BV 水
冲洗，再用2BV 40%乙醇洗脱，收集40%醇的洗脱液，减压回收乙醇，干燥后即得纯化好的丹参总酚酸类有效部位。
4. 按上述所得结果提取丹参药材1kg ，醇提后的药渣用8倍量纯水煎煮提取0.5h ，提取3次，平行提取3份，然后分别对丹参水溶性成分进行HPD450大孔树脂纯化，上样后先用2BV 纯水除杂，再用2BV 40%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，喷雾干燥，所得粉末即为丹参水溶性纯化物，HPLC 测定丹酚酸B 含量，结果分别为71.6%，70%，72.35%，显示此种方法提取纯化丹酚酸B 的效果较好。
5. （1）丹参水溶性成分指纹图谱的色谱条件。Kromasil C 18色谱柱（4.6mm ×250mm ，5μm ），检测波长286nm ，柱温30℃，进样量10μL ，流速1.0mL ·min -1，流动相乙腈-1.5%甲酸梯度洗脱，见表4。
（2）丹参药材水溶性供试液的制备。
精密称取丹参药材粗粉2.0000g ，20%甲醇40mL 浸泡20min ，称定质量，加热超声提取40min ，加热温度控制在55℃~60℃，放置室温后补足溶剂损失，用0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液即为样品供试液，按上述的色谱条件测定，色谱图见图3。
（2）丹参水溶性成分提取物供试液的考察。精密称定水溶性纯化物粉末14.38mg ，用75%甲醇溶解并定容至5mL 量瓶中, 用0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液备用为供试液，按上述的色谱条件测定，色谱图见图4。
HPLC 指纹图谱经对照品比对和质谱鉴定，峰1
表4
[1**********]0
丹参水溶性成分指纹图谱流动相梯度洗脱
乙腈/%[1**********]100
1.5%甲酸/%
[1**********]50
302
t /min
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
2013第十五卷第二期★Vol.15No.2
7
取率可知，较短的加热时间不仅可以有效地提取丹酚酸B ，而且可以减缓加热对丹酚酸B 提取率的影响。
在丹参水溶性成分的纯化中，重点考察了吸附树脂、洗脱剂
6
1
23
4
5
及其用量，并优化了各项工艺参数。HPD450大孔吸附树脂对丹参总酚酸有较高的吸附能力，采用40%乙醇洗脱时，洗脱能力较强，能快速有效地洗脱丹参总酚酸类成分，与文献[8~10]中关于丹参大孔树脂的纯化方案相比更为经济，
7
10
图3
20
30
t /min
4050min
丹参药材水溶性成分HPLC 图
纯化后丹酚酸B 的纯度>65%。采用网格法优化HPLC 指纹图谱的色谱条件，重点考察了流动相和梯度洗脱条件。流动相选用1.5%甲酸水溶液可有效地改善峰形；在优化后的梯度洗脱条件下，特征峰均有较好的分离度和重现性，主要峰的保留时间和峰面积的精密度和稳定性良好，可有效评价丹参药材及其水溶性提取物的质量。
6
1
32
4
5
10
图4
20
30t /min
4050min
在水溶性成分的HPLC 指纹图谱试验中，通过正交设计的方法对供试品溶液的制备方法进行
丹参总酚酸纯化物HPLC 图
为丹参素，峰2为原儿茶醛，峰3为咖啡酸，峰4为迷迭香酸，峰6，7分别为丹酚酸A ，B 。
三、讨论
在丹参提取工艺中，采用醇提和水提相结合的方法分别提取丹参脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类成分，同时用单因素试验考察醇提对水溶性成分的影响，通过指纹图谱加以分析。有文献认为丹酚酸B 的pH 稳定性主要是由丹酚酸B 的pKa 决定的[6]，在pH 1～7，降解速率在高pH 明显比低pH 高[7]，因此提取溶剂重点考察了纯水和不同浓度的酸性水溶液，结果显示提取溶剂对提取影响较大，纯水的提取效果优于酸水。由于丹酚酸B 受热不稳定[5]，故采用单因素试验进一步考察提取时间对丹酚酸B 的影响，通过比较丹酚酸B 的提
303
了考察，对丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B 等特征峰进行分析，筛选出20%甲醇浸泡，加热（55℃
~60℃）超声提取40min 的样品制备方法，以此方法为基础测得的丹参HPLC 指纹图谱图形较好，主要峰特征性强，重现性好，多数峰分离度好，可以有效控制丹参及其提取物和总酚酸的质量。
参考文献
1杜冠华，张均田. 丹参现代研究概况与进展（续一）. 医药导报,2004，23（6）∶355~360.
2吴杲, 何招兵，吴汉斌. 丹参酮的药理作用研究进展. 现代中西医结合杂志,2005，14（10）∶1382~1385.
3周立运，朱晓新. 丹参及其化学成分药代动力学研究的进展. 中国实验方剂学杂志，2005,11（3）∶66~69.
4韦英杰，刘媛，陈宁，等. 正交试验法优选丹参的提取新工艺. 中药研究与信息，2005，7（11）∶13~15.
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕
世界科学技术—中医药现代化★技术应用研究
5张军，王凤云，詹丽玲，等. 丹参药材提取液中丹酚酸B 稳定性影响因素的考察. 中国中药杂志，2005，30（10）∶789~790.
潘桂湘，张艳斌. 丹酚酸B 在模拟消化道体液中的稳定6柴世伟，
2006，23(4)∶3322~3331.性研究. 天津中医药，
崔翰明，张秋燕，等. 丹参提取物中的丹酚酸B 在不同pH 7张春光，
条件下的稳定性研究. 中国实验方剂学杂志，2009，15(1)∶3~5.
8房信胜，谭晓梅. 大孔吸附树脂纯化丹参总酚酸的定性定量分析. 中国中药杂志，2005，30（17）∶1331~1334.
贺英菊，罗巍伟. 大孔吸附树脂吸附纯化丹参提取液的影9王凌，
医学版，2004，35（5）∶736~737.响因素. 四川大学学报：
刘玉强，范晋勇，等. 大孔吸附树脂富集丹参中水溶性成10王志平，
份的研究. 中草药，2003，34（10）∶908~909.
Study on Extraction and Purification of Salvia Miltiorrhiza Total Phenolic
Acids Process and Quality Analysis
Zhang Qiuyan, Zhang Yingying, Cui Hanming
(Guang'anmenHospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)
Abstract:This study was aimed to extract and purify active components of Salvia miltiorrhiza and to determinate the relevant quality analysis. The high-performance liquid chromatography (HPLC)method of salvianolic acid B was established. Factors influencing the extraction were investigated with a single -factor and orthogonal design. The water-soluble components of S. miltiorrhiza were purified with macroporous resin. The HPLC fingerprint of S. miltiorrhiza and its purified extract were studied, and the quality specification was established. The results showed that the transfer rate of salvianolic acid B was up to 85%, contents of salvianolic acid B were 65%, and other salvianolic acid is about 12%.The HPLC fingerprint analysis method can effectively analyze and identify the main characteristic peaks of water -soluble components. It was concluded that the method can quickly and effi -ciently purify S. miltiorrhiza water -soluble components. The high -purity salvianolic acid components were ob -tained. The HPLC fingerprint method has good precision and reproducibility. Keywords:Salvianolic acid, column chromatography, HPLC, fingerprint
（责任编辑：鲍
雷
张志华，责任译审：王
晶）
〔World Science and Technology/Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 〕304