实践与探索ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＥＸＰＬＯＲＥ 研究与探索
编辑｜姜菁｜Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｉｙｅｚａｚｈｉ＠１６３．ｃｏｍ
运用薄层色谱法对氨基酸分析实验的改进
薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）是20
世纪50年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的
一种色谱技术，是快速分离和定性分析少量物质的一种很
重要的实验技术，属固-液吸附色谱。薄层色谱法操作简
便、快速、灵敏、分离效果好、显色容易，在生物化学与
分析实验中广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、生
物碱等多种物质的分离和鉴定。但在氨基酸分析实验中，
常出现显色效果不好及拖尾的现象，为改变以上现状，我
们经过多次实验，提出以下方案。
一、氨基酸薄层色谱茚三酮显色的改良
薄层色谱是将固相支持物(也叫吸附剂)均匀铺在玻璃板
上使之成为薄层，将待分析的样品点到薄层板的一端，然
后将点样端浸入适宜的扩剂中，在密闭的层析缸中展层。
由于各种氨基酸的理化性质(分子极性、分子大小和形状、
分子亲和力等）不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。
当展开剂在薄层板的毛细管中移动时，点在薄板上样品的
组分就不同程度地随着展开剂移动，使不同的氨基酸得以
分离。
由于吸附剂在喷雾显色时，常见层析表面破坏，造
成分析困难，经过多次实验发现，若不采用喷雾法，而
直接将展开剂与喷雾剂同时使用，不但便于操作，氨基
酸斑点清晰，边缘整齐，薄层面光滑完整，而且比移值
也保持不变。
1.仪器
硅胶G薄层板、毛细管、层析缸、电吹风、喷雾器、
烘箱。
2.试剂
硅胶G；黏合剂：0.5%的柠檬酸与1%的羧甲基纤维
素钠混合，煮沸至无气泡，冷却静置分层后用；氨基酸溶
液：0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及混合溶
液；展开剂：V（正丁醇）:V（冰乙酸）:V（水）=4:1:2；
展开显色剂：V（展开剂）:V（0.1%茚三酮无水丙酮溶
液）=10:1。
3.操作
（1）薄层板的制备。①调浆：称取硅胶14g，加黏合
剂25 mL，置于研钵中充分研磨成均匀的膏状；②涂布：
取两块洁净的干燥玻璃板（20×20）置于涂布器上均匀涂
层。（请询问作者20×20的单位是否是20 cm×20 cm，没
有单位的数值没有意义）③干燥：将玻璃板水平放置，室
温下自然晾干。④活化：晾干的薄层板置于烘箱内，105℃
172OCCUPATION
2010 5文/林 珊活化30 min，切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。(2)点样。活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边2 cm水平线上均匀确定5个点。用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不超过3 mm，干后再点一次。(3)展层。在层析缸中加入展开显色剂1 cm厚，加盖平衡0.5 h。将薄层板点样端浸入展开显色剂，展开显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层显色剂前沿离薄板顶端2 cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干,即可出现氨基酸显色斑点。二、改善氨基酸薄层色谱的拖尾拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不像标准图谱那样完整地显示在某一位置上，而是前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴，其图所呈颜色也是由浓渐淡。1.拖尾现象原因分析氨基酸薄层色谱拖尾的出现，原认为是对影响Rf的主要因素［如物质结构、极性、层析溶剂、溶剂和样品的pH、温度、薄层的质地是否均匀、薄厚是否适当、硅胶的松紧度是否适中、展层的方式(上行、下行)等］掌握不够所致。然而多次实验证明，无论操作如何严格都仍不可避免地出现拖尾现象。经分析，样品的处理是为纯化，实现层析分配某氨基酸的清晰显色图像；展层使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图像上区分不同样品的氨基酸；显色剂含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。2.拖尾改善方法（1）点样位置。为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，点在以硅胶为惰性支持物的层析板上设计好的多点位置中去。（2）风干样品。点样后要自然风干，或冷风吹干。因为一旦控制不好温，势必要使样品破坏，样品点太干燥，样品物的分子牢固吸附在层析板上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子不能在层析板上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，致使在显色后，实验结果的图像上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。（作者单位：海南省高级技工学校）
实践与探索ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＥＸＰＬＯＲＥ 研究与探索
编辑｜姜菁｜Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｉｙｅｚａｚｈｉ＠１６３．ｃｏｍ
运用薄层色谱法对氨基酸分析实验的改进
薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）是20
世纪50年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的
一种色谱技术，是快速分离和定性分析少量物质的一种很
重要的实验技术，属固-液吸附色谱。薄层色谱法操作简
便、快速、灵敏、分离效果好、显色容易，在生物化学与
分析实验中广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、生
物碱等多种物质的分离和鉴定。但在氨基酸分析实验中，
常出现显色效果不好及拖尾的现象，为改变以上现状，我
们经过多次实验，提出以下方案。
一、氨基酸薄层色谱茚三酮显色的改良
薄层色谱是将固相支持物(也叫吸附剂)均匀铺在玻璃板
上使之成为薄层，将待分析的样品点到薄层板的一端，然
后将点样端浸入适宜的扩剂中，在密闭的层析缸中展层。
由于各种氨基酸的理化性质(分子极性、分子大小和形状、
分子亲和力等）不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。
当展开剂在薄层板的毛细管中移动时，点在薄板上样品的
组分就不同程度地随着展开剂移动，使不同的氨基酸得以
分离。
由于吸附剂在喷雾显色时，常见层析表面破坏，造
成分析困难，经过多次实验发现，若不采用喷雾法，而
直接将展开剂与喷雾剂同时使用，不但便于操作，氨基
酸斑点清晰，边缘整齐，薄层面光滑完整，而且比移值
也保持不变。
1.仪器
硅胶G薄层板、毛细管、层析缸、电吹风、喷雾器、
烘箱。
2.试剂
硅胶G；黏合剂：0.5%的柠檬酸与1%的羧甲基纤维
素钠混合，煮沸至无气泡，冷却静置分层后用；氨基酸溶
液：0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及混合溶
液；展开剂：V（正丁醇）:V（冰乙酸）:V（水）=4:1:2；
展开显色剂：V（展开剂）:V（0.1%茚三酮无水丙酮溶
液）=10:1。
3.操作
（1）薄层板的制备。①调浆：称取硅胶14g，加黏合
剂25 mL，置于研钵中充分研磨成均匀的膏状；②涂布：
取两块洁净的干燥玻璃板（20×20）置于涂布器上均匀涂
层。（请询问作者20×20的单位是否是20 cm×20 cm，没
有单位的数值没有意义）③干燥：将玻璃板水平放置，室
温下自然晾干。④活化：晾干的薄层板置于烘箱内，105℃
172OCCUPATION
2010 5文/林 珊活化30 min，切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。(2)点样。活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边2 cm水平线上均匀确定5个点。用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不超过3 mm，干后再点一次。(3)展层。在层析缸中加入展开显色剂1 cm厚，加盖平衡0.5 h。将薄层板点样端浸入展开显色剂，展开显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层显色剂前沿离薄板顶端2 cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干,即可出现氨基酸显色斑点。二、改善氨基酸薄层色谱的拖尾拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不像标准图谱那样完整地显示在某一位置上，而是前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴，其图所呈颜色也是由浓渐淡。1.拖尾现象原因分析氨基酸薄层色谱拖尾的出现，原认为是对影响Rf的主要因素［如物质结构、极性、层析溶剂、溶剂和样品的pH、温度、薄层的质地是否均匀、薄厚是否适当、硅胶的松紧度是否适中、展层的方式(上行、下行)等］掌握不够所致。然而多次实验证明，无论操作如何严格都仍不可避免地出现拖尾现象。经分析，样品的处理是为纯化，实现层析分配某氨基酸的清晰显色图像；展层使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图像上区分不同样品的氨基酸；显色剂含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。2.拖尾改善方法（1）点样位置。为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，点在以硅胶为惰性支持物的层析板上设计好的多点位置中去。（2）风干样品。点样后要自然风干，或冷风吹干。因为一旦控制不好温，势必要使样品破坏，样品点太干燥，样品物的分子牢固吸附在层析板上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子不能在层析板上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，致使在显色后，实验结果的图像上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。（作者单位：海南省高级技工学校）