酸性蛋白酶酶活测定
1. 定义
1g 固体酶粉在40℃和pH 值3.0条件下，1min 水解酪素产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理
蛋白酶在一定的温度和pH 条件下，水解底物酪素产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等) ，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。
3. 试剂和溶液
3.1 1 mol/L及0.1mol/L盐酸(HCl)溶液
取浓盐酸85ml ，加水稀释并定容至1000ml ，即为1 mol/L盐酸溶液；取100ml 1 mol/L盐酸溶液，定容1000ml ，即为0.1mol/L盐酸溶液。
3.2 100mg/ml L－酪氨酸标准液
精确称取预先于105℃干燥至恒重的L －酪氨酸0.1000g ，精确至0.0001g 。用1 mol/L盐酸60ml 溶解后定容至100ml ，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.0ml ，用0.1mol/L盐酸定容至100ml ，即得到100mg/ml L－酪氨酸标准液。
3.3 0.4mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
3.4 福林 (Folin) 试剂
于2000ml 磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4•2H2O)100g 、钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)25g 、蒸馏水700ml 、85％磷酸50ml 、浓盐酸100ml 。小火沸腾回流10小时，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂(Li2SO4)50g，加蒸馏水50ml 和数滴浓(99％) 溴水，再微沸15min ，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴) ，冷却后加蒸馏水定容至1000ml 。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份原Folin 溶液与2份蒸馏水混匀。
3.5 乳酸缓冲液
甲液：称取80～90％乳酸10.6g ，加水稀释并定容至1000ml 。
乙液：称取70％乳酸钠16g ，加水稀释并定容至1000ml 。
使用液：取甲液8ml ，加乙液1ml ，再准确稀释1倍。用pH 计校正pH 至3.0。
3.6 1.0%酪素溶液
称取酪素1.000g ，精确至0.0001g ，先用少量(3～4ml) 浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液约80ml ，在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入100ml 容量瓶中，用乳酸缓冲液定容至刻度。此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3天。
3.7 0.4mol/L三氯乙酸(CCl3—COOH) 溶液
称取三氯乙酸65.4g ，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
4. 仪器和设备
4.1 恒温水浴锅。
4.2 分光光度计
有10mm 比色皿，可在660nm 处测量吸光度。
5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
分别吸取100mg/ml L －酪氨酸标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml 于10ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每ml 分别含L －酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg 的稀标准液。各取上述溶液1.00ml （须做平行试验）于试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液
5.00ml ，稀福林试剂 1.00ml ，置于40℃水浴中显色20min ，取出用10mm 比色皿，在波长660nm 处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。以吸光度为纵坐标，相应的酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量(mg)即为比色常数K 值。
5.2待测酶液的制备
5.3 比色测定
精确吸取待测酶液1.0ml(每个样品3支平行试管) ， 40℃水浴预热2min 。同时取适量1%酪素溶液在40℃水浴预热3～5min ，然后取其1.0ml ，加入到经预热的上述酶液中，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min ，立即加入2.0ml0.4mol/L三氯乙酸，摇匀，取出静置10min ，过滤，取滤液1.0ml 。加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml ，以后按标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。
同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1.0ml ，40℃水浴2 min后加入2.0ml 0.4mol/L三氯乙酸，40℃水浴10min ，然后加入1%酪素溶液1.0ml ，取出静置10min ，过滤，取滤液1.0ml ，以后步骤同于样品测定。
6. 计算
X=(A×K×4×n)/(1×10)
式中：X －样品的酶活力，u/g；
A －样品平行试验的平均吸光度；
K －比色常数；
4－反应试剂体积(ml)；
n －样品稀释倍数(制备成的酶液ml 数/2g酶粉) ，ml/g；
1－参与反应的酶液量，ml ；
10－反应时间，min 。
酸性蛋白酶酶活测定
1. 定义
1g 固体酶粉在40℃和pH 值3.0条件下，1min 水解酪素产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理
蛋白酶在一定的温度和pH 条件下，水解底物酪素产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等) ，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。
3. 试剂和溶液
3.1 1 mol/L及0.1mol/L盐酸(HCl)溶液
取浓盐酸85ml ，加水稀释并定容至1000ml ，即为1 mol/L盐酸溶液；取100ml 1 mol/L盐酸溶液，定容1000ml ，即为0.1mol/L盐酸溶液。
3.2 100mg/ml L－酪氨酸标准液
精确称取预先于105℃干燥至恒重的L －酪氨酸0.1000g ，精确至0.0001g 。用1 mol/L盐酸60ml 溶解后定容至100ml ，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.0ml ，用0.1mol/L盐酸定容至100ml ，即得到100mg/ml L－酪氨酸标准液。
3.3 0.4mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
3.4 福林 (Folin) 试剂
于2000ml 磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4•2H2O)100g 、钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)25g 、蒸馏水700ml 、85％磷酸50ml 、浓盐酸100ml 。小火沸腾回流10小时，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂(Li2SO4)50g，加蒸馏水50ml 和数滴浓(99％) 溴水，再微沸15min ，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴) ，冷却后加蒸馏水定容至1000ml 。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份原Folin 溶液与2份蒸馏水混匀。
3.5 乳酸缓冲液
甲液：称取80～90％乳酸10.6g ，加水稀释并定容至1000ml 。
乙液：称取70％乳酸钠16g ，加水稀释并定容至1000ml 。
使用液：取甲液8ml ，加乙液1ml ，再准确稀释1倍。用pH 计校正pH 至3.0。
3.6 1.0%酪素溶液
称取酪素1.000g ，精确至0.0001g ，先用少量(3～4ml) 浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液约80ml ，在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入100ml 容量瓶中，用乳酸缓冲液定容至刻度。此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3天。
3.7 0.4mol/L三氯乙酸(CCl3—COOH) 溶液
称取三氯乙酸65.4g ，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
4. 仪器和设备
4.1 恒温水浴锅。
4.2 分光光度计
有10mm 比色皿，可在660nm 处测量吸光度。
5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
分别吸取100mg/ml L －酪氨酸标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml 于10ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每ml 分别含L －酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg 的稀标准液。各取上述溶液1.00ml （须做平行试验）于试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液
5.00ml ，稀福林试剂 1.00ml ，置于40℃水浴中显色20min ，取出用10mm 比色皿，在波长660nm 处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。以吸光度为纵坐标，相应的酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量(mg)即为比色常数K 值。
5.2待测酶液的制备
5.3 比色测定
精确吸取待测酶液1.0ml(每个样品3支平行试管) ， 40℃水浴预热2min 。同时取适量1%酪素溶液在40℃水浴预热3～5min ，然后取其1.0ml ，加入到经预热的上述酶液中，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min ，立即加入2.0ml0.4mol/L三氯乙酸，摇匀，取出静置10min ，过滤，取滤液1.0ml 。加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml ，以后按标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。
同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1.0ml ，40℃水浴2 min后加入2.0ml 0.4mol/L三氯乙酸，40℃水浴10min ，然后加入1%酪素溶液1.0ml ，取出静置10min ，过滤，取滤液1.0ml ，以后步骤同于样品测定。
6. 计算
X=(A×K×4×n)/(1×10)
式中：X －样品的酶活力，u/g；
A －样品平行试验的平均吸光度；
K －比色常数；
4－反应试剂体积(ml)；
n －样品稀释倍数(制备成的酶液ml 数/2g酶粉) ，ml/g；
1－参与反应的酶液量，ml ；
10－反应时间，min 。