中国农学通报2009,25(08):62-64
Chinese Agricultural Science
Bulletin
几种真菌DNA 提取方法的比较
吴发红，黄东益，黄小龙，周鑫，程文杰
(海南大学农学院，海南儋州571737)
摘要：通过3种内生真菌DNA 提取方法的比较，即CTAB 法、SDS 法、改良的CTAB 法，结果表明三种方法都能得到目的DNA ，而且得率都较好，但改良的CTAB 法效果最好，不仅DNA 纯度高且质量也好。用改良的CTAB 法所提取的DNA 作为模板，进行PCR 扩增，得到了清晰的、单一的扩增普带，完全可用于酶切、测序等后续实验。
关键词：内生；DNA 提取；CTAB ；SDS 中图分类号：S812
文献标识码：A
Comparing Study on several Methods for DNA
Wu Fahong, Huang Dongyi, Huang Xiaolong, Zhou Xin, Cheng Wenjie
（Academy of Agriculture, Hainan University , Danzhou Hainan 571737）
Extraction from endophytic fungi
Abstract:In this study, three different methods were used to extract DNA from endophytic fungi:CTAB,SDS and the improved CTAB. Quality and quantity of the extracted DNA were compared for the there methods. The results showed that all of the there methods could obtain the DNA, but the improved CTAB could obtain the fragment showed that the extracted DNA could be used for the other biological experiments. Key words:endophytic, DNA extraction, CTAB, SDS 真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法，主要按照真菌的形态、生理生化特点、抗原构造等特征加以区分。但真菌种类众多、个体多态性明显，常会得出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确[1]。近年来，随着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发挥了越来越大的作用，rDNA 序列分析被广泛使用。要进行DNA 序列分析，就需要用PCR 扩增特定的DNA 片段，而DNA 提取则是这项工作的基础。因此找出一种快速且得率高的方法就显得很重要。笔者通过几种DNA 提取方法的比较[2-3]，得到一种较好的提取真菌DNA 的方法。1材料和方法1.1菌株来源
该研究所使用的菌株是由海南大学农学院提供
第一作者简介：吴发红，女，1982年出生，安徽省池州市人，研究生。研究方向：分子生物学。通信地址：571737海南大学（儋州校区）农学院，E-mail ：[email protected]。
通讯作者：黄东益，男，1969年出生，云南宣威人，教授，研究方向：水稻、甘蔗等作物的分子标记育种与分子细胞遗传学，微生物学。通信地址：571737海南大学（儋州校区）农学院，E-mail:[email protected]收稿日期：2009-02-18，修回日期：2009-3-3。
highest quantity of the purest fungal DNA. The purest DNA was amplified by PCR .The clear and singal gel
1.2菌株的培养与收集
将真菌孢子接种到PDA 平板上活化培养2~3天，温度25℃，光照12L ∶12D 。
两种方法收集菌丝：一种是当菌丝长满培养基表面并未产孢时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从平板上挑菌饼到液体PDA 培养基中，28℃180r/min震荡培养5~7天，真空抽滤，收集干燥的菌丝。1.3主要试剂
2×TaqPCR MasterMix 和蛋白酶K 购于上海天根生物公司，CTAB ，SDS ，DNA-marker 、GoldView 购于上海生工生物公司，引物1（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3' ）和引物2（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3' ）由上海英骏生物技术有限公司合成。
吴发红等：几种真菌DNA 提取方法的比较
·
63·
1.4DNA 提取方法
CTAB 法：
参照Guo 等[4]（2000）和Saghai 等[5]的方法。取少许新鲜菌体，加液氮研磨，加入3ml 2%CTAB(加PVP) ，装管；65℃水浴45min ，13000r/min离心10min ；取上清（水相）于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），12000r/min离心10min ；取上清，加等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），12000r/min离心10min ；取上清，加2L 的无水乙醇和NaCl 溶液，-20℃沉淀30min ，12000r/min离心20min ；收集沉淀，75%酒精冲洗，超净台真空干燥；100μl TE 溶解DNA ，-20℃保存备用。加入1μl 的RNA 酶，37℃水浴1h ；加入400μl 氯仿/异戊醇（24∶1），12000r/min离心10min ，重复2次。
SDS 法：
参照傅骏华等[6]和杨潇远等[7]方法。取200mg 菌体，液氮研磨，加入400μl SDS 提取缓冲液；65℃水浴45min ，13000r/min离心5min ；取上清转到离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）；摇匀，离心5min ，取上清，加等体积的氯仿/异戊醇；摇匀，离心3min ，取上清，加入2倍体积的无水乙醇和2mol/LNaCl ，-20℃沉淀30min ，12000r/min离心20min ；去上清，70%酒精冲洗，超净工作台倒置进行真空干燥；加500μl TE ，加2μl 的RNA 酶，37℃水浴1h ；加入800μl 氯仿/异戊醇（24∶1），12000r/min离心10min ，重复2次，余下的步骤和CTAB 相同。
改良的CTAB 法：
取200mg 菌体，液氮研磨，加入3ml 3%CTAB 提取缓冲液；65℃水浴45min ，40℃4000r/min离心20min ；取上清转到离心管中，加入4μl 10mg/ml蛋白酶，37℃水浴1h ；加入800μl Tris 饱和酚，摇匀，13000r/min离心10min ；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，摇匀，
M
13000r/min离心10min ；取上清，加10mg/ml的RNA 酶，37℃水浴过夜处理；加入800μl 氯仿/异戊醇，摇匀，13000r/min离心10min ；取上清，加600μl 异戊醇，-20℃沉淀30min ，余下步骤同上。1.5DNA 样品的检测
质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE ，电压为90V 的条件下电泳40min ，用GoldView 染色，在凝胶成像仪上观察DNA 分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。1.6PCR 扩增
模板DNA 0.8μl ，引物1和引物2各0.6μl ，2×TaqPCR MasterMix 7.5μl ，加ddH2O 至15μl 的体系。扩增程序[8]为：94℃预变性4min ，94℃变性40s ，37℃退火1min ，72℃延伸1min ，72℃后延伸10min ，40个循环。质量分数为2%的琼脂糖凝胶于5V/cm的电场中进行电泳，经GoldView 染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。2结果与分析
2.1对6株菌株进行DNA 提取的结果见图1-A 、B 、C ：
各样品吸取5μl 进行电泳，结果显示，三种方法都可以获得目的DNA ，而且得率都挺高，分子量在23kb 左右。CTAB 法提取的DNA 条带很亮，得率高，但有降解现象。在提取DNA 时，已经加入了RNase 处理，但是在琼脂糖凝胶的最前端具有明显的亮带，可能是杂蛋白、DNA 碎片或未消化掉的RNA 。SDS 法提取的DNA 条带也比较亮，而且也存在杂蛋白，但是完全可以用于PCR 扩增。改良的CTAB 法提取的DNA 条带很亮，得率很高，而且凝胶前端的DNA 碎片或RNA 带几乎没有，而且将提取与纯化合二为一，简化了步骤，但同时也耗费最多。进一步用紫外分光光度计检测经改良的CTAB 法所提取的DNA 质量，其A 260/A 280比值在1.80左右，说明DNA 纯度很高。
M
M
A
B
图1三种方法提取的内生真菌DNA
A:CTAB法；B:SDS法；C:改良的CTAB
法
C
2.2PCR 扩增的结果
以改良的CTAB 法所提取出的DNA 为模板，采用真菌内转录间隔区通用引物ITS1/ITS4做PCR ，marker
为100bp ladder ，产物经电泳后GoldView 染色，在紫外光下见DNA 条带清晰，且无非特异性扩增条带，分子量在500~700bp （图2）。
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M
700bp 500bp
图2提取物DNA 的扩增产物电泳图
3讨论
实验发现直接从平板上刮菌丝的方法简单方便，但是得率偏低，尤其是对于那些菌丝不发达的菌株，而发酵虽然耗费点时间，但过滤得到的菌体既丰富又易于研磨，DNA 产量很高。对于沉淀DNA ，异戊醇明显优于无水乙醇，可以减少DNA 的损耗。加PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响[9]。DNA 提取过程中，最常见的问题是多糖和蛋白的污染，CTAB 既能裂解细胞，又能有效地沉淀多糖，而适量加点蛋白酶K 则可去除蛋白质污染。如果想得到漂亮的DNA 条带，可以在检测前向DNA 中加入适量的蛋白酶K ，水浴一段时间，再检测，蛋白就会被消灭的干干净净。CTAB 浓度以3%为最佳，既能有效除去多糖等杂质，又易于提纯时与DNA 分开，不造成额外污染。SDS 法操作简单、温和，也可提取到高分子量的DNA ，但所得到的产物含糖类杂质较多。
一般认为所提取DNA 经紫外分光光度计检测时，其A 260/A 280比值在1.80左右说明DNA 纯度最高，若该值小于1.80说明所提取的DNA 含蛋白质较高，大于2.0则说明RNA 未抽提干净。由此可见改良的CTAB 法所提取的各菌株DNA ，其质量是很高的。
真菌DNA 的提取方法很多，其区别主要在于破壁方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的不同，但均包括真菌细胞壁的裂解，真菌细胞膜的破坏，达到DNA 的释放以及真菌的纯化步骤。传统的破壁包括机械破壁、超声波破壁、玻璃珠破壁[10]。核酸分离方法包括经典的酚、氯仿抽提，以及商品化的纯化柱、纯化膜分离
法等。目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的，
如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法, 操作简单、高效，DNA 质量较高，但价格昂贵，提取量少，实际应用的比较少。目前，氯化苄[11]、酶解法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基磺酸钠（SDS ）法，尤其是后两种方法，因为无需昂贵仪器和药品，提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要[1]，在真菌DNA 提取中应用较广泛。
参考文献
[1]裴杰萍, 端青.DNA 提取方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展, 2004,32(3):76-78.
[2]李绍兰, 周斌, 杨丽源, 等. 真菌DNA 提取方法的改良[J].云南大学学报,2002,24(6):471-472.
[3]何月秋. 真菌菌丝培养和提取DNA 方法的改进[J].菌物系统,2000, 19(3):434.
[4]
Guo L D, Hyde K D and Liew E C Y . Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences[J].New Phytologist, 2000, 147:617-630.[5]
Saghai M A, Solman K M, Jorgensen R A, et al .Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley:Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics [J].Pnas, 1984, 81(24):8014-8018.[6]傅骏华, 李连成. 玉米RAPD 程序优化研究及其初步探讨[J].作物学报,1997,23(1):56-61.
[7]杨潇远，王丽娅, 李振勇, 等. 角膜炎常见致真菌快速提取方法的探索[J].中华检验医学杂志,2005,28(9):961.
[8]
Oscar F, Cubero. DNA extraction and PCR amplification method suitable for fresh, herbarium-stored, lichenized, and other fungi[J].Pl. Syst Evol. 216:243-249.[9]
易庆平, 罗正荣, 张青林.DNA 提取纯化方法综述[J].安徽农业科学,2007,5(25):7789-7791.
[10]刘颖慧, 甄莉. 一种有效念珠菌基因组DNA 提取方法的研究[J].山
西医药杂,2008,37(2):132.
[11]周礼红. 一种制备富含多糖丝状真菌基因组DNA 的方法[J].湖北
农业科学,2008,47(4):381.
中国农学通报2009,25(08):62-64
Chinese Agricultural Science
Bulletin
几种真菌DNA 提取方法的比较
吴发红，黄东益，黄小龙，周鑫，程文杰
(海南大学农学院，海南儋州571737)
摘要：通过3种内生真菌DNA 提取方法的比较，即CTAB 法、SDS 法、改良的CTAB 法，结果表明三种方法都能得到目的DNA ，而且得率都较好，但改良的CTAB 法效果最好，不仅DNA 纯度高且质量也好。用改良的CTAB 法所提取的DNA 作为模板，进行PCR 扩增，得到了清晰的、单一的扩增普带，完全可用于酶切、测序等后续实验。
关键词：内生；DNA 提取；CTAB ；SDS 中图分类号：S812
文献标识码：A
Comparing Study on several Methods for DNA
Wu Fahong, Huang Dongyi, Huang Xiaolong, Zhou Xin, Cheng Wenjie
（Academy of Agriculture, Hainan University , Danzhou Hainan 571737）
Extraction from endophytic fungi
Abstract:In this study, three different methods were used to extract DNA from endophytic fungi:CTAB,SDS and the improved CTAB. Quality and quantity of the extracted DNA were compared for the there methods. The results showed that all of the there methods could obtain the DNA, but the improved CTAB could obtain the fragment showed that the extracted DNA could be used for the other biological experiments. Key words:endophytic, DNA extraction, CTAB, SDS 真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法，主要按照真菌的形态、生理生化特点、抗原构造等特征加以区分。但真菌种类众多、个体多态性明显，常会得出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确[1]。近年来，随着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发挥了越来越大的作用，rDNA 序列分析被广泛使用。要进行DNA 序列分析，就需要用PCR 扩增特定的DNA 片段，而DNA 提取则是这项工作的基础。因此找出一种快速且得率高的方法就显得很重要。笔者通过几种DNA 提取方法的比较[2-3]，得到一种较好的提取真菌DNA 的方法。1材料和方法1.1菌株来源
该研究所使用的菌株是由海南大学农学院提供
第一作者简介：吴发红，女，1982年出生，安徽省池州市人，研究生。研究方向：分子生物学。通信地址：571737海南大学（儋州校区）农学院，E-mail ：[email protected]。
通讯作者：黄东益，男，1969年出生，云南宣威人，教授，研究方向：水稻、甘蔗等作物的分子标记育种与分子细胞遗传学，微生物学。通信地址：571737海南大学（儋州校区）农学院，E-mail:[email protected]收稿日期：2009-02-18，修回日期：2009-3-3。
highest quantity of the purest fungal DNA. The purest DNA was amplified by PCR .The clear and singal gel
1.2菌株的培养与收集
将真菌孢子接种到PDA 平板上活化培养2~3天，温度25℃，光照12L ∶12D 。
两种方法收集菌丝：一种是当菌丝长满培养基表面并未产孢时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从平板上挑菌饼到液体PDA 培养基中，28℃180r/min震荡培养5~7天，真空抽滤，收集干燥的菌丝。1.3主要试剂
2×TaqPCR MasterMix 和蛋白酶K 购于上海天根生物公司，CTAB ，SDS ，DNA-marker 、GoldView 购于上海生工生物公司，引物1（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3' ）和引物2（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3' ）由上海英骏生物技术有限公司合成。
吴发红等：几种真菌DNA 提取方法的比较
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63·
1.4DNA 提取方法
CTAB 法：
参照Guo 等[4]（2000）和Saghai 等[5]的方法。取少许新鲜菌体，加液氮研磨，加入3ml 2%CTAB(加PVP) ，装管；65℃水浴45min ，13000r/min离心10min ；取上清（水相）于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），12000r/min离心10min ；取上清，加等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），12000r/min离心10min ；取上清，加2L 的无水乙醇和NaCl 溶液，-20℃沉淀30min ，12000r/min离心20min ；收集沉淀，75%酒精冲洗，超净台真空干燥；100μl TE 溶解DNA ，-20℃保存备用。加入1μl 的RNA 酶，37℃水浴1h ；加入400μl 氯仿/异戊醇（24∶1），12000r/min离心10min ，重复2次。
SDS 法：
参照傅骏华等[6]和杨潇远等[7]方法。取200mg 菌体，液氮研磨，加入400μl SDS 提取缓冲液；65℃水浴45min ，13000r/min离心5min ；取上清转到离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）；摇匀，离心5min ，取上清，加等体积的氯仿/异戊醇；摇匀，离心3min ，取上清，加入2倍体积的无水乙醇和2mol/LNaCl ，-20℃沉淀30min ，12000r/min离心20min ；去上清，70%酒精冲洗，超净工作台倒置进行真空干燥；加500μl TE ，加2μl 的RNA 酶，37℃水浴1h ；加入800μl 氯仿/异戊醇（24∶1），12000r/min离心10min ，重复2次，余下的步骤和CTAB 相同。
改良的CTAB 法：
取200mg 菌体，液氮研磨，加入3ml 3%CTAB 提取缓冲液；65℃水浴45min ，40℃4000r/min离心20min ；取上清转到离心管中，加入4μl 10mg/ml蛋白酶，37℃水浴1h ；加入800μl Tris 饱和酚，摇匀，13000r/min离心10min ；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，摇匀，
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13000r/min离心10min ；取上清，加10mg/ml的RNA 酶，37℃水浴过夜处理；加入800μl 氯仿/异戊醇，摇匀，13000r/min离心10min ；取上清，加600μl 异戊醇，-20℃沉淀30min ，余下步骤同上。1.5DNA 样品的检测
质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE ，电压为90V 的条件下电泳40min ，用GoldView 染色，在凝胶成像仪上观察DNA 分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。1.6PCR 扩增
模板DNA 0.8μl ，引物1和引物2各0.6μl ，2×TaqPCR MasterMix 7.5μl ，加ddH2O 至15μl 的体系。扩增程序[8]为：94℃预变性4min ，94℃变性40s ，37℃退火1min ，72℃延伸1min ，72℃后延伸10min ，40个循环。质量分数为2%的琼脂糖凝胶于5V/cm的电场中进行电泳，经GoldView 染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。2结果与分析
2.1对6株菌株进行DNA 提取的结果见图1-A 、B 、C ：
各样品吸取5μl 进行电泳，结果显示，三种方法都可以获得目的DNA ，而且得率都挺高，分子量在23kb 左右。CTAB 法提取的DNA 条带很亮，得率高，但有降解现象。在提取DNA 时，已经加入了RNase 处理，但是在琼脂糖凝胶的最前端具有明显的亮带，可能是杂蛋白、DNA 碎片或未消化掉的RNA 。SDS 法提取的DNA 条带也比较亮，而且也存在杂蛋白，但是完全可以用于PCR 扩增。改良的CTAB 法提取的DNA 条带很亮，得率很高，而且凝胶前端的DNA 碎片或RNA 带几乎没有，而且将提取与纯化合二为一，简化了步骤，但同时也耗费最多。进一步用紫外分光光度计检测经改良的CTAB 法所提取的DNA 质量，其A 260/A 280比值在1.80左右，说明DNA 纯度很高。
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图1三种方法提取的内生真菌DNA
A:CTAB法；B:SDS法；C:改良的CTAB
法
C
2.2PCR 扩增的结果
以改良的CTAB 法所提取出的DNA 为模板，采用真菌内转录间隔区通用引物ITS1/ITS4做PCR ，marker
为100bp ladder ，产物经电泳后GoldView 染色，在紫外光下见DNA 条带清晰，且无非特异性扩增条带，分子量在500~700bp （图2）。
中国农学通报http://www.casb.org.cn
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700bp 500bp
图2提取物DNA 的扩增产物电泳图
3讨论
实验发现直接从平板上刮菌丝的方法简单方便，但是得率偏低，尤其是对于那些菌丝不发达的菌株，而发酵虽然耗费点时间，但过滤得到的菌体既丰富又易于研磨，DNA 产量很高。对于沉淀DNA ，异戊醇明显优于无水乙醇，可以减少DNA 的损耗。加PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响[9]。DNA 提取过程中，最常见的问题是多糖和蛋白的污染，CTAB 既能裂解细胞，又能有效地沉淀多糖，而适量加点蛋白酶K 则可去除蛋白质污染。如果想得到漂亮的DNA 条带，可以在检测前向DNA 中加入适量的蛋白酶K ，水浴一段时间，再检测，蛋白就会被消灭的干干净净。CTAB 浓度以3%为最佳，既能有效除去多糖等杂质，又易于提纯时与DNA 分开，不造成额外污染。SDS 法操作简单、温和，也可提取到高分子量的DNA ，但所得到的产物含糖类杂质较多。
一般认为所提取DNA 经紫外分光光度计检测时，其A 260/A 280比值在1.80左右说明DNA 纯度最高，若该值小于1.80说明所提取的DNA 含蛋白质较高，大于2.0则说明RNA 未抽提干净。由此可见改良的CTAB 法所提取的各菌株DNA ，其质量是很高的。
真菌DNA 的提取方法很多，其区别主要在于破壁方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的不同，但均包括真菌细胞壁的裂解，真菌细胞膜的破坏，达到DNA 的释放以及真菌的纯化步骤。传统的破壁包括机械破壁、超声波破壁、玻璃珠破壁[10]。核酸分离方法包括经典的酚、氯仿抽提，以及商品化的纯化柱、纯化膜分离
法等。目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的，
如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法, 操作简单、高效，DNA 质量较高，但价格昂贵，提取量少，实际应用的比较少。目前，氯化苄[11]、酶解法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基磺酸钠（SDS ）法，尤其是后两种方法，因为无需昂贵仪器和药品，提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要[1]，在真菌DNA 提取中应用较广泛。
参考文献
[1]裴杰萍, 端青.DNA 提取方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展, 2004,32(3):76-78.
[2]李绍兰, 周斌, 杨丽源, 等. 真菌DNA 提取方法的改良[J].云南大学学报,2002,24(6):471-472.
[3]何月秋. 真菌菌丝培养和提取DNA 方法的改进[J].菌物系统,2000, 19(3):434.
[4]
Guo L D, Hyde K D and Liew E C Y . Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences[J].New Phytologist, 2000, 147:617-630.[5]
Saghai M A, Solman K M, Jorgensen R A, et al .Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley:Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics [J].Pnas, 1984, 81(24):8014-8018.[6]傅骏华, 李连成. 玉米RAPD 程序优化研究及其初步探讨[J].作物学报,1997,23(1):56-61.
[7]杨潇远，王丽娅, 李振勇, 等. 角膜炎常见致真菌快速提取方法的探索[J].中华检验医学杂志,2005,28(9):961.
[8]
Oscar F, Cubero. DNA extraction and PCR amplification method suitable for fresh, herbarium-stored, lichenized, and other fungi[J].Pl. Syst Evol. 216:243-249.[9]
易庆平, 罗正荣, 张青林.DNA 提取纯化方法综述[J].安徽农业科学,2007,5(25):7789-7791.
[10]刘颖慧, 甄莉. 一种有效念珠菌基因组DNA 提取方法的研究[J].山
西医药杂,2008,37(2):132.
[11]周礼红. 一种制备富含多糖丝状真菌基因组DNA 的方法[J].湖北
农业科学,2008,47(4):381.