综合实验报告书
（2012~2013学年）
实 验 题 目 粒毛盘菌胞外多糖的提取及其脱蛋白前后抗氧化活性
学院名称 生物与食品工程学院
专 业 （班 级） 生物工程10-1班
姓 名 （学 号） 郑沛 20106274
起 讫 日 期 2013年2月25日—2013年3月1日
指 导 教 师 叶 明
2013年 3 月1日
粒毛盘菌胞外多糖的提取及其脱蛋白前后抗氧化活
生物工程10-1 学号：20106274 姓名：郑沛
同组人员：许云龙
摘要：对粒毛盘菌(Lachnum hyalopus)DP5胞外多糖的提取工艺, 及其胞外多糖的体外抗氧化活性进行研究。结果表明，粒毛盘菌的胞外多糖具有一定体外抗氧化活性，对O 2-、•OH 均有较好的清除作用，并且其抗氧化性能力随浓度升高而增强，而且较Vc 要强。实验中使用乙醇沉淀法提取的胞外多糖，并用分光光度法进行试验，测得粒毛盘菌对各氧化离子及基团的清除率，证明其抗氧化活性。 关键词：粒毛盘菌 多糖 抗氧化活性
Study on extraction technology and autioxidative activity of polysaccharides produced by Lachnum hyalopus．
Abstract ： Extract Lachnum DP5 extracellular polysaccharide , and use the Vc as the positive control group to determine the antioxidant capacity. The results show that the grain of extracellular polysaccharide Mao Pan bacteria have certain antioxidant activity in vitro, the O2 - and • OH were better removal effect, and its oxidation resistance ability increased with concentration, and the Vc is better. Experiments using ethanol precipitation method to extract extracellular polysaccharides, using spectrophotometry to test and measured grain Mao Pan bacterium clearance rate of the groups for each oxide ion and, to prove its antioxidant activity.
Key words:Lachnum hyalopus polysaccharide A ntioxidative activity
粒毛盘菌属隶属于盘菌纲(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(HyaloscyPhaceae)，是广泛分布于世界的一类腐生性真菌．长期以来，国内外对粒毛盘菌分类和系统发育已经进行了许多研究，在其发酵条件及代谢产物方面也有一些报道。研究表明，粒毛盘菌胞外多糖具有一定的生物活性，比如降血糖、降血脂和抗肿瘤等。本实验对粒毛盘菌DP5胞外多糖的抗氧化活性进行研究。
大量研究表明，机体的许多疾病与自由基氧化损伤有关，抗氧化多糖为自由基氧化损伤相关疾病的治疗带来新的希望。本研究对粒毛盘菌多糖的提取工艺及其多糖的体外抗氧化活性进行研究，并且对其多糖脱蛋白前后的抗氧化活性进行比较，以期为粒毛盘菌多糖的研发和工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器
DSX-280A 灭菌锅，HH-S 恒温水浴锅，TDL-50B 离心机，AR1140型电子分析天平，722分光光度计，RE-85旋转蒸发仪，培养皿，烧杯，锥形瓶，试管，玻璃棒，移液管，酒精灯，量筒，接种针，容量瓶等实验室常用仪器。
1.1.2试剂
1%K3[Fe(CN)6]，三氯乙酸，三氯化铁，邻苯三酚，Vc 溶液，过氧化氢，水杨酸，硫酸亚铁溶液，乙醇，Tris-HCL 溶液（PH8.2）（配置：称取12.114gTris 溶解至1L ，然后取50mL 再取22.9mL 的0.1moL/LHCL溶液混合，混匀稀释至100mL ）
0.2moL/LPBS(PH6.6)(配置：62.5mL 的0.2moL/L磷酸二氢钠溶液与37.5mL 的0.2moL/L磷酸氢二钠溶液）
1.1.3材料
粒毛盘菌(Lachnum hyalopus )DP5由合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离保藏．
1.2胞外多糖的提取
1.2.1粒毛盘菌胞外多糖发酵的提取
胞外多糖的提取：在150mL 的锥形瓶中，装入50mL 基本发酵培养基，用打孔器接入直径为3mm 的已活化的菌块，25℃，150r/ min摇床培养十天。抽滤除去菌丝体，滤液浓缩后，加入3倍体积的乙醇，4℃静止24h 。离心弃去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥得胞外多糖粗品。
1.2.2胞外多糖的脱蛋白
采用Sevage 法脱蛋白，取粒毛盘菌胞外多糖溶液加入1/3体积的Sevage （体积比氯仿：正丁醇=5:1），将混合物剧烈振摇20min ，分液漏斗分液再静止20min ，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白，重复至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质。
1.2.3胞外多糖脱色，透析及冷冻干燥
向粗多糖溶解液中加入其体积1/10的30%的过氧化氢，50℃恒温脱色。将脱蛋白及脱色后的多糖水溶液置于透析袋（直径25mm ，截留分子量3500Da ）中，自来水逆向透析12h ，再用蒸馏水浸泡，将透析后的多糖溶液冷冻干燥即可得粒毛盘菌胞外多糖。
1.3胞外多糖抗氧化活性测定
1.3.1多糖还原能力测定
取1mL 样品溶液加入0.5mL1%K3[Fe(CN)6]和0.2mL 0.2moL/LPBS(PH6.6)于试管中50摄氏度水浴反应20min ，取出后用流水进行冷却，加入1mL 10%三氯乙酸，3000r/min离心10min ，取1.5mL 上清液，加入3mL 蒸馏水和0.2mL 1%三氯化铁摇匀，放置5min ，以蒸馏水作为空白对照调零，700nm 处测定吸光值。吸光度越大，表示多糖的还原能力越强。
1.3.2对超氧阴离子自由基(O2-) 的清除作用
应用邻苯三酚自氧化体外模拟化学反应。将0.5mI ，3.0 mmoL/L的邻苯三酚加入到含不同浓度脱蛋白前后多糖溶液的pH8.2Tris —HCL 缓冲液中，在两液混合后10min 内每隔30s 测425nm 处的吸光值，以不加多糖的反应液为空白对照，维生素C 为阳性对照，计算多糖对超氧阴离子自由基(O2-) 的清除率．
清除率,=（A0-A ）/A×100％
其中：A0为邻苯三酚自氧化速率，即自氧化曲线的斜率；
A 为加入不同浓度多糖后氧化曲线的斜率。
1.3.3对•OH 的清除作用测定
利用过氧化氢与亚铁离子的混合产生•OH ，在体系内加入水杨酸捕捉•OH 并产生有色物质，该物质在510nm 下有最大吸收。反应体系中含8.8mmoL/L 过氧化氢1mL ，9mmoL/LFeSO4 1mL ，9mmoL/L水杨酸/乙醇1mL ，不同浓度（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0g/L）的胞内脱蛋白前后多糖溶液1mL ，最后加入过氧化氢启动反应，37摄氏度反应半小时，，以蒸馏水为参比，在510nm 下测量吸光度，考虑到多糖本身的吸光值，以9mmoL/LFeSO4 1mL,9mmoL/L水杨酸/乙醇1mL ，不同浓度的多糖溶液1mL 和1mL 蒸馏水做对比，相同浓度的Vc 作为阳性对照。清除率计算公式：
清除率（%）=（A 0—（A X —A X0））/A0
其中A 0为空白对照的吸光度，A X 为加入多糖的吸光度，A X0为不加显色剂过氧化氢多糖溶液本底的吸光度。
1.3.4对DPPH 自由基的清除作用测定
取不同浓度的多糖溶液2mL 与2mL 2×10-4moL/L DPPH 溶液均匀混合，30min 后在525 nm 处测定其吸光度Ai ，同时用同法测定2mL 2×10-4moL/L DPPH 溶液与2mL 蒸馏水混合后的吸光度A ，以及2mL 不同浓度多糖溶液与2mL 蒸馏水混合后的吸光度Aj ，则清除率=[1一(Ai一Aj) ／A]×100％．
2 结果与分析
2.1 对•OH 基的清除作用测定
由图可知，脱蛋白前后多糖溶液对•OH 的清除作用都随浓度的增大而增大，且相同浓度的Vc 对•OH 的清除能力比脱蛋白前后的多糖都弱。但是当浓度较低时，两者相差不大。
2.4 对O 2-的清除作用测定
多糖对O 2-的清除效果较好，随着多糖浓度的增加，其对O 2-的清除作用也逐渐增加，增加趋势符合二项式y=—1.4279x2+23.902x+5.332，R 2=0.8807。如下图所示，当浓度为1.2mg/l时，清除率最大，约为76%。
3 讨论与心得
3.1讨论
本次试验是研究粒毛盘菌的胞外多糖，我国对多糖的研究起步较晚，但是发展很快。多糖有着复杂的理化特性，其中许多对生物化学产品的生产及应用有着大大的帮助。当然多糖的结构相当复杂，在各种不同的生物体中存在着各种不同的多糖，如甘蔗各种瓜果和微生物等，都能提取出多糖。
本次试验测得粒毛盘菌的胞外多糖具有抗氧化活性，对O2-、·OH 、DPPH 自由基的清除作用都明显，以维生素C 作为阳性对照组，通过比较，发现Vc 的抗氧化性比同浓度的此类多糖要弱，无论是脱蛋白前还是脱蛋白后的多糖。
3.2心得
在实验过程中，我们深深体会到了团结的重要性，实验中队友的重要性不言而喻。当然在实验过程中就体现出了我们的各种经验的不足，也明白了严谨的态度对于实验的完成度有着重要的作用，在这种综合实验中，每一步只要稍有差错，就能造成整个实验的失败，从而需要耗费更多的时间进行不必要的步骤，甚至重头再来。
在这种为期综合实验中，合理安排时间是很重要的，将那些略显复杂的操作尽快在白天完成，将等待的时间就放到晚上。然后在实验中，我们也学会了一些以前没用过的实验仪器的使用。
3.3致谢
感谢叶明老师对我们实验的计划和支持，也感谢研究生杜湛学姐对我们实验的全程悉心指导，对我们的问题更是不厌其烦。
参考文献
[1] 叶明, 李世艳等, 禾本科粒毛盘菌多糖提取及其抗氧化活性研究[J] .浙江大学学报 （农业与生命科学版）,2009,35。
[2] 蒋长兴，鸡内金多糖对高脂血症大鼠血脂、血液流变学及氧化应激指标的影响[J].中药药理与临床, 2012,05.
[3] 乔德亮, 双孢蘑菇多糖超声波辅助提取及体外抗氧化活性[J]. 中药材.
[4] 罗玲, 周斌星, 郭威, 柴洁, 李扬. 普洱茶茶多糖的提取工艺的响应面分析研究
[J]. 中国农学通报,2012,30.
[5] 郭巧玲, 杨学敏, 谢建华, 郑宝东. 菠萝多糖脱色工艺的研究[J]; 漳州师范学院学报(自然科学版) , 2012, 03 .
[6] 侯秀娟, 沈勇根. 化橘红多糖的提取纯化及抗氧化活性研究[J].
Zhuang W Y，Hyde KD．New species of Lachnum and Perrotia from HongKong
[J].Mycologia,2001,93．
[8] 李南薇, 杨振立. 木瓜叶多糖的提取及抗氧化活性研究[J]. 食品科学与技术, 2012,11.
合肥工业大学
综合实验报
告成绩评定
综合实验报告书
（2012~2013学年）
实 验 题 目 粒毛盘菌胞外多糖的提取及其脱蛋白前后抗氧化活性
学院名称 生物与食品工程学院
专 业 （班 级） 生物工程10-1班
姓 名 （学 号） 郑沛 20106274
起 讫 日 期 2013年2月25日—2013年3月1日
指 导 教 师 叶 明
2013年 3 月1日
粒毛盘菌胞外多糖的提取及其脱蛋白前后抗氧化活
生物工程10-1 学号：20106274 姓名：郑沛
同组人员：许云龙
摘要：对粒毛盘菌(Lachnum hyalopus)DP5胞外多糖的提取工艺, 及其胞外多糖的体外抗氧化活性进行研究。结果表明，粒毛盘菌的胞外多糖具有一定体外抗氧化活性，对O 2-、•OH 均有较好的清除作用，并且其抗氧化性能力随浓度升高而增强，而且较Vc 要强。实验中使用乙醇沉淀法提取的胞外多糖，并用分光光度法进行试验，测得粒毛盘菌对各氧化离子及基团的清除率，证明其抗氧化活性。 关键词：粒毛盘菌 多糖 抗氧化活性
Study on extraction technology and autioxidative activity of polysaccharides produced by Lachnum hyalopus．
Abstract ： Extract Lachnum DP5 extracellular polysaccharide , and use the Vc as the positive control group to determine the antioxidant capacity. The results show that the grain of extracellular polysaccharide Mao Pan bacteria have certain antioxidant activity in vitro, the O2 - and • OH were better removal effect, and its oxidation resistance ability increased with concentration, and the Vc is better. Experiments using ethanol precipitation method to extract extracellular polysaccharides, using spectrophotometry to test and measured grain Mao Pan bacterium clearance rate of the groups for each oxide ion and, to prove its antioxidant activity.
Key words:Lachnum hyalopus polysaccharide A ntioxidative activity
粒毛盘菌属隶属于盘菌纲(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(HyaloscyPhaceae)，是广泛分布于世界的一类腐生性真菌．长期以来，国内外对粒毛盘菌分类和系统发育已经进行了许多研究，在其发酵条件及代谢产物方面也有一些报道。研究表明，粒毛盘菌胞外多糖具有一定的生物活性，比如降血糖、降血脂和抗肿瘤等。本实验对粒毛盘菌DP5胞外多糖的抗氧化活性进行研究。
大量研究表明，机体的许多疾病与自由基氧化损伤有关，抗氧化多糖为自由基氧化损伤相关疾病的治疗带来新的希望。本研究对粒毛盘菌多糖的提取工艺及其多糖的体外抗氧化活性进行研究，并且对其多糖脱蛋白前后的抗氧化活性进行比较，以期为粒毛盘菌多糖的研发和工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器
DSX-280A 灭菌锅，HH-S 恒温水浴锅，TDL-50B 离心机，AR1140型电子分析天平，722分光光度计，RE-85旋转蒸发仪，培养皿，烧杯，锥形瓶，试管，玻璃棒，移液管，酒精灯，量筒，接种针，容量瓶等实验室常用仪器。
1.1.2试剂
1%K3[Fe(CN)6]，三氯乙酸，三氯化铁，邻苯三酚，Vc 溶液，过氧化氢，水杨酸，硫酸亚铁溶液，乙醇，Tris-HCL 溶液（PH8.2）（配置：称取12.114gTris 溶解至1L ，然后取50mL 再取22.9mL 的0.1moL/LHCL溶液混合，混匀稀释至100mL ）
0.2moL/LPBS(PH6.6)(配置：62.5mL 的0.2moL/L磷酸二氢钠溶液与37.5mL 的0.2moL/L磷酸氢二钠溶液）
1.1.3材料
粒毛盘菌(Lachnum hyalopus )DP5由合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离保藏．
1.2胞外多糖的提取
1.2.1粒毛盘菌胞外多糖发酵的提取
胞外多糖的提取：在150mL 的锥形瓶中，装入50mL 基本发酵培养基，用打孔器接入直径为3mm 的已活化的菌块，25℃，150r/ min摇床培养十天。抽滤除去菌丝体，滤液浓缩后，加入3倍体积的乙醇，4℃静止24h 。离心弃去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥得胞外多糖粗品。
1.2.2胞外多糖的脱蛋白
采用Sevage 法脱蛋白，取粒毛盘菌胞外多糖溶液加入1/3体积的Sevage （体积比氯仿：正丁醇=5:1），将混合物剧烈振摇20min ，分液漏斗分液再静止20min ，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白，重复至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质。
1.2.3胞外多糖脱色，透析及冷冻干燥
向粗多糖溶解液中加入其体积1/10的30%的过氧化氢，50℃恒温脱色。将脱蛋白及脱色后的多糖水溶液置于透析袋（直径25mm ，截留分子量3500Da ）中，自来水逆向透析12h ，再用蒸馏水浸泡，将透析后的多糖溶液冷冻干燥即可得粒毛盘菌胞外多糖。
1.3胞外多糖抗氧化活性测定
1.3.1多糖还原能力测定
取1mL 样品溶液加入0.5mL1%K3[Fe(CN)6]和0.2mL 0.2moL/LPBS(PH6.6)于试管中50摄氏度水浴反应20min ，取出后用流水进行冷却，加入1mL 10%三氯乙酸，3000r/min离心10min ，取1.5mL 上清液，加入3mL 蒸馏水和0.2mL 1%三氯化铁摇匀，放置5min ，以蒸馏水作为空白对照调零，700nm 处测定吸光值。吸光度越大，表示多糖的还原能力越强。
1.3.2对超氧阴离子自由基(O2-) 的清除作用
应用邻苯三酚自氧化体外模拟化学反应。将0.5mI ，3.0 mmoL/L的邻苯三酚加入到含不同浓度脱蛋白前后多糖溶液的pH8.2Tris —HCL 缓冲液中，在两液混合后10min 内每隔30s 测425nm 处的吸光值，以不加多糖的反应液为空白对照，维生素C 为阳性对照，计算多糖对超氧阴离子自由基(O2-) 的清除率．
清除率,=（A0-A ）/A×100％
其中：A0为邻苯三酚自氧化速率，即自氧化曲线的斜率；
A 为加入不同浓度多糖后氧化曲线的斜率。
1.3.3对•OH 的清除作用测定
利用过氧化氢与亚铁离子的混合产生•OH ，在体系内加入水杨酸捕捉•OH 并产生有色物质，该物质在510nm 下有最大吸收。反应体系中含8.8mmoL/L 过氧化氢1mL ，9mmoL/LFeSO4 1mL ，9mmoL/L水杨酸/乙醇1mL ，不同浓度（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0g/L）的胞内脱蛋白前后多糖溶液1mL ，最后加入过氧化氢启动反应，37摄氏度反应半小时，，以蒸馏水为参比，在510nm 下测量吸光度，考虑到多糖本身的吸光值，以9mmoL/LFeSO4 1mL,9mmoL/L水杨酸/乙醇1mL ，不同浓度的多糖溶液1mL 和1mL 蒸馏水做对比，相同浓度的Vc 作为阳性对照。清除率计算公式：
清除率（%）=（A 0—（A X —A X0））/A0
其中A 0为空白对照的吸光度，A X 为加入多糖的吸光度，A X0为不加显色剂过氧化氢多糖溶液本底的吸光度。
1.3.4对DPPH 自由基的清除作用测定
取不同浓度的多糖溶液2mL 与2mL 2×10-4moL/L DPPH 溶液均匀混合，30min 后在525 nm 处测定其吸光度Ai ，同时用同法测定2mL 2×10-4moL/L DPPH 溶液与2mL 蒸馏水混合后的吸光度A ，以及2mL 不同浓度多糖溶液与2mL 蒸馏水混合后的吸光度Aj ，则清除率=[1一(Ai一Aj) ／A]×100％．
2 结果与分析
2.1 对•OH 基的清除作用测定
由图可知，脱蛋白前后多糖溶液对•OH 的清除作用都随浓度的增大而增大，且相同浓度的Vc 对•OH 的清除能力比脱蛋白前后的多糖都弱。但是当浓度较低时，两者相差不大。
2.4 对O 2-的清除作用测定
多糖对O 2-的清除效果较好，随着多糖浓度的增加，其对O 2-的清除作用也逐渐增加，增加趋势符合二项式y=—1.4279x2+23.902x+5.332，R 2=0.8807。如下图所示，当浓度为1.2mg/l时，清除率最大，约为76%。
3 讨论与心得
3.1讨论
本次试验是研究粒毛盘菌的胞外多糖，我国对多糖的研究起步较晚，但是发展很快。多糖有着复杂的理化特性，其中许多对生物化学产品的生产及应用有着大大的帮助。当然多糖的结构相当复杂，在各种不同的生物体中存在着各种不同的多糖，如甘蔗各种瓜果和微生物等，都能提取出多糖。
本次试验测得粒毛盘菌的胞外多糖具有抗氧化活性，对O2-、·OH 、DPPH 自由基的清除作用都明显，以维生素C 作为阳性对照组，通过比较，发现Vc 的抗氧化性比同浓度的此类多糖要弱，无论是脱蛋白前还是脱蛋白后的多糖。
3.2心得
在实验过程中，我们深深体会到了团结的重要性，实验中队友的重要性不言而喻。当然在实验过程中就体现出了我们的各种经验的不足，也明白了严谨的态度对于实验的完成度有着重要的作用，在这种综合实验中，每一步只要稍有差错，就能造成整个实验的失败，从而需要耗费更多的时间进行不必要的步骤，甚至重头再来。
在这种为期综合实验中，合理安排时间是很重要的，将那些略显复杂的操作尽快在白天完成，将等待的时间就放到晚上。然后在实验中，我们也学会了一些以前没用过的实验仪器的使用。
3.3致谢
感谢叶明老师对我们实验的计划和支持，也感谢研究生杜湛学姐对我们实验的全程悉心指导，对我们的问题更是不厌其烦。
参考文献
[1] 叶明, 李世艳等, 禾本科粒毛盘菌多糖提取及其抗氧化活性研究[J] .浙江大学学报 （农业与生命科学版）,2009,35。
[2] 蒋长兴，鸡内金多糖对高脂血症大鼠血脂、血液流变学及氧化应激指标的影响[J].中药药理与临床, 2012,05.
[3] 乔德亮, 双孢蘑菇多糖超声波辅助提取及体外抗氧化活性[J]. 中药材.
[4] 罗玲, 周斌星, 郭威, 柴洁, 李扬. 普洱茶茶多糖的提取工艺的响应面分析研究
[J]. 中国农学通报,2012,30.
[5] 郭巧玲, 杨学敏, 谢建华, 郑宝东. 菠萝多糖脱色工艺的研究[J]; 漳州师范学院学报(自然科学版) , 2012, 03 .
[6] 侯秀娟, 沈勇根. 化橘红多糖的提取纯化及抗氧化活性研究[J].
Zhuang W Y，Hyde KD．New species of Lachnum and Perrotia from HongKong
[J].Mycologia,2001,93．
[8] 李南薇, 杨振立. 木瓜叶多糖的提取及抗氧化活性研究[J]. 食品科学与技术, 2012,11.
合肥工业大学
综合实验报
告成绩评定