现代色谱技术与药物分析
1.概述
色谱法是一种高效能的物理分离技术，它利用混合物中的各组分在互不相容的两相（固定相和流动相）之间的分配差异而使混合物得到分离的一种方法。
从1903年Tswet发表了吸附色谱分离植物色素的论文至今，色谱技术已近百年的发展历史。特别是60年度现代液相色谱技术的问世，使其在生命科学、药物化学、食品卫生、环境化学等诸多领域得到了广泛的应用。经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。
近年来多种高新技术的引用，各类色谱仪器在性能、结构和技术参数等各方面都有了极大的提高。目前比较成熟的色谱仪器主要是气相色谱和高效液相色谱两大类。下面将对应用于药物分析中的几种液相色谱进行逐一的介绍。
2.高效液相色谱
高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，简称HPLC)是在20世纪70年代在经典液相柱色谱的基础上结合气相色谱的理论与技术而发展起来的一种重要的分离分析方法。它具有高效、快速、高灵敏度、色谱柱可以反复使用、分离出的组分易收集、适用范围广等优点，在药物的分析中发挥着重要的作用。HPLC在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定。
在HPLC法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，可用于药物的鉴别。如在中国药典收载的药物利福平的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致
由于HPLC分离效能及灵敏度高，在药物的杂质检查中被广泛应用，主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料，中间体，副
产物，降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。用HPLC检测药物杂质主要有以下几种方法：
（1）峰面积归一化法
此法主要用于没有杂质对照品时杂质的限量检查。当选用紫外一可见检测器时，因各组分的最大吸收波长、吸收系数难以完全相同，要确定的检测波长下也很难保证所有物质都被检出，故此法只用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不用于微量杂质的检查。
（2）不加校正因子的主成分自身对照法
此法用于没有杂质对照品时杂质的限量检查，不能给出所含杂质的真实限度。采用这种方法时，应先确定杂质的最大吸收波长，而且杂质与主成分的最大吸收波长、吸收系数尽可能一致，如不一致应选用杂质的最大吸收波长作为检测波长。
（3）加校正因子的主成分自身对照法
此法用于有杂质对照品时杂质的限量检查，通过得到杂质校正因子，能准确反应杂质限量。
（4）内标法加校正因子测定杂质含量
用于有杂质对照品时杂质的限量检查。此法能准确反应杂质限量，且可以消除系统误差和进样量不准确的影响，但需要有内标物质。此外，各国药典中均收载了多种药物采用HPLC法进行杂质项目的检查，并且可以采用HPLC法进行杂质检查的药物的种类在逐年颁布的药典中均有所增加。
HPLC是现代分离测定的重要手段。由于它具有专属性强、简便快速、灵敏度高等特点，既可用于分离也可用于定量分析，适用于各种各样的有机化合物，因此目前在药物成分的分离与测定方面得到了广泛的应用嘲。相信随着检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些相关问题的解决，HPLC在医药研究中将会发挥越来越重要的作用。
3.超高效液相色谱
HPLC是上世纪6O年代末70年代初发展起来的一种新型分离技术，很快在药学及相关领域得到广泛的应用。但是随着科学技术的进步和工业的发展，各个领域对液相色谱的要求日益提高。首先，大批量的样品需要在很短的时间内完成分析，
例如代谢组学分析、天然产物和生化样品等复杂样品的分析等，由于其组分种类多、含量差别大、已知信息少等特点，对色谱的分离能力提出了更高的要求；色质联用技术要求真空系统和“接口”技术等条件，对色谱技术提出了更为苛刻的要求。针对上述出现的新情况新要求，美国Waters公司于2004年推出了最新研制的ACOUITY超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，
UPI13)，采用小粒径填料色谱柱(小于2pro)和超高压系统(大于105kPa)，可显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。UPLC采用1．7 m细粒径的新型固定相，可获得高达2万块·米。理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步，并形成分离科学的一个新兴领域。问世几年来，UPI C与质谱(MS)等设备的联用技术发展很快，已在多个领域得到成功应用。
UPLC保持了HPLC的基本原理，其理论依据于范迪姆特(Van Deemter)经验方程。在HETP—Adp+B／v+C (dp) v式中，HETP为理论塔板高度，A为涡流扩散系数，dp为填料粒径，B为分子径向扩散系数，C为传质因子，v为流动相线速度。由该方程可以得出结论：颗粒度越小柱效越高，每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围。因此，降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。随色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的理论塔板高度H也越小，色谱柱的柱效越高，并可获得更宽的线速度范围，达到分离分析的高速、高效和高灵敏度。UPLC采用了1．7 m颗粒度的色谱柱填料，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，弥补传统HPI C的不足。
UPLC是分离复杂化合物的理想工具，其快速、灵敏、分离度好的特点特别适合于与MS联用于药物代谢动力学方面的研究。UPLC-ESI(电喷雾离子源)一MS／MS在多反应监测(MSM)模式下检测人血浆中氨氯地平的含量。线性校正曲线范围在0．15～16．0ng·mL- ，定量限为0．15ng·m 。日内日间精密度均低于15 。该方法能成功应用于口服氨氯地平片剂的药代动力学研究。Pedlraglio等 利用UPLC-MS／MS方法探讨了体外代谢以及药代动力学中临床前期高通量药物筛选研究的新方法，并与HPLC-MS／MS进行了对比，结果也显示，UPLC在药代动力学中
有良好的应用，能大大缩短应用时间，提高灵敏度，同时降低生物样品不纯带来的分析干扰。
这些新方法使得现代液相色谱技术更加高效、灵敏和快捷，成为体内药物研究不可或缺的基础。从上述分析不难看出，现代液相色谱技术正在朝着微量化、自动化、联用化、智能化方向发展。随着各学科间各种技术的相互渗透，更多新颖的色谱技术还将不断涌现，它们对体内药物分析领域将产生不可估量的影响。
现代色谱技术与药物分析
1.概述
色谱法是一种高效能的物理分离技术，它利用混合物中的各组分在互不相容的两相（固定相和流动相）之间的分配差异而使混合物得到分离的一种方法。
从1903年Tswet发表了吸附色谱分离植物色素的论文至今，色谱技术已近百年的发展历史。特别是60年度现代液相色谱技术的问世，使其在生命科学、药物化学、食品卫生、环境化学等诸多领域得到了广泛的应用。经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。
近年来多种高新技术的引用，各类色谱仪器在性能、结构和技术参数等各方面都有了极大的提高。目前比较成熟的色谱仪器主要是气相色谱和高效液相色谱两大类。下面将对应用于药物分析中的几种液相色谱进行逐一的介绍。
2.高效液相色谱
高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，简称HPLC)是在20世纪70年代在经典液相柱色谱的基础上结合气相色谱的理论与技术而发展起来的一种重要的分离分析方法。它具有高效、快速、高灵敏度、色谱柱可以反复使用、分离出的组分易收集、适用范围广等优点，在药物的分析中发挥着重要的作用。HPLC在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定。
在HPLC法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，可用于药物的鉴别。如在中国药典收载的药物利福平的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致
由于HPLC分离效能及灵敏度高，在药物的杂质检查中被广泛应用，主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料，中间体，副
产物，降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。用HPLC检测药物杂质主要有以下几种方法：
（1）峰面积归一化法
此法主要用于没有杂质对照品时杂质的限量检查。当选用紫外一可见检测器时，因各组分的最大吸收波长、吸收系数难以完全相同，要确定的检测波长下也很难保证所有物质都被检出，故此法只用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不用于微量杂质的检查。
（2）不加校正因子的主成分自身对照法
此法用于没有杂质对照品时杂质的限量检查，不能给出所含杂质的真实限度。采用这种方法时，应先确定杂质的最大吸收波长，而且杂质与主成分的最大吸收波长、吸收系数尽可能一致，如不一致应选用杂质的最大吸收波长作为检测波长。
（3）加校正因子的主成分自身对照法
此法用于有杂质对照品时杂质的限量检查，通过得到杂质校正因子，能准确反应杂质限量。
（4）内标法加校正因子测定杂质含量
用于有杂质对照品时杂质的限量检查。此法能准确反应杂质限量，且可以消除系统误差和进样量不准确的影响，但需要有内标物质。此外，各国药典中均收载了多种药物采用HPLC法进行杂质项目的检查，并且可以采用HPLC法进行杂质检查的药物的种类在逐年颁布的药典中均有所增加。
HPLC是现代分离测定的重要手段。由于它具有专属性强、简便快速、灵敏度高等特点，既可用于分离也可用于定量分析，适用于各种各样的有机化合物，因此目前在药物成分的分离与测定方面得到了广泛的应用嘲。相信随着检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些相关问题的解决，HPLC在医药研究中将会发挥越来越重要的作用。
3.超高效液相色谱
HPLC是上世纪6O年代末70年代初发展起来的一种新型分离技术，很快在药学及相关领域得到广泛的应用。但是随着科学技术的进步和工业的发展，各个领域对液相色谱的要求日益提高。首先，大批量的样品需要在很短的时间内完成分析，
例如代谢组学分析、天然产物和生化样品等复杂样品的分析等，由于其组分种类多、含量差别大、已知信息少等特点，对色谱的分离能力提出了更高的要求；色质联用技术要求真空系统和“接口”技术等条件，对色谱技术提出了更为苛刻的要求。针对上述出现的新情况新要求，美国Waters公司于2004年推出了最新研制的ACOUITY超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，
UPI13)，采用小粒径填料色谱柱(小于2pro)和超高压系统(大于105kPa)，可显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。UPLC采用1．7 m细粒径的新型固定相，可获得高达2万块·米。理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步，并形成分离科学的一个新兴领域。问世几年来，UPI C与质谱(MS)等设备的联用技术发展很快，已在多个领域得到成功应用。
UPLC保持了HPLC的基本原理，其理论依据于范迪姆特(Van Deemter)经验方程。在HETP—Adp+B／v+C (dp) v式中，HETP为理论塔板高度，A为涡流扩散系数，dp为填料粒径，B为分子径向扩散系数，C为传质因子，v为流动相线速度。由该方程可以得出结论：颗粒度越小柱效越高，每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围。因此，降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。随色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的理论塔板高度H也越小，色谱柱的柱效越高，并可获得更宽的线速度范围，达到分离分析的高速、高效和高灵敏度。UPLC采用了1．7 m颗粒度的色谱柱填料，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，弥补传统HPI C的不足。
UPLC是分离复杂化合物的理想工具，其快速、灵敏、分离度好的特点特别适合于与MS联用于药物代谢动力学方面的研究。UPLC-ESI(电喷雾离子源)一MS／MS在多反应监测(MSM)模式下检测人血浆中氨氯地平的含量。线性校正曲线范围在0．15～16．0ng·mL- ，定量限为0．15ng·m 。日内日间精密度均低于15 。该方法能成功应用于口服氨氯地平片剂的药代动力学研究。Pedlraglio等 利用UPLC-MS／MS方法探讨了体外代谢以及药代动力学中临床前期高通量药物筛选研究的新方法，并与HPLC-MS／MS进行了对比，结果也显示，UPLC在药代动力学中
有良好的应用，能大大缩短应用时间，提高灵敏度，同时降低生物样品不纯带来的分析干扰。
这些新方法使得现代液相色谱技术更加高效、灵敏和快捷，成为体内药物研究不可或缺的基础。从上述分析不难看出，现代液相色谱技术正在朝着微量化、自动化、联用化、智能化方向发展。随着各学科间各种技术的相互渗透，更多新颖的色谱技术还将不断涌现，它们对体内药物分析领域将产生不可估量的影响。