摘要：目的研究分离到的黏细菌So ce shu-1及其次级代谢物的生物学特性。方法用烘干法和DNS法测定So ce shu-1利用纤维素的能力，用滤纸片法和溴化四唑蓝（MTT）法测定So ce shu-1利用纤维素次级代谢物抑制细菌和肿瘤细胞的效果。结果So ce shu-1能利用玉米秸秆和滤纸等纤维素，纤维素酶活性为12.30 UFPA/mL, 其次级代谢物有广谱抗菌活性，对 K562等肿瘤细胞有较好的抑制效果。结论So ce shu-1在能源利用方面，其次级代谢物在药物和食品保鲜方面具有良好的开发前景。
关键词：黏细菌；次生代谢物；生物活性
中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0027-04
Preliminary Study on Bioactivity of Myxobacterium So ce shu-1 and Its Secondary Metabolites
LI Yan-li1, ZHANG Yin-lei2, LIU Ying, MA Zhong-liang2*
(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Bioenergy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China)
Abstract：Objective To study the bioactivity of myxobacterium So ce shu-1 and its secondary metabolites which can be separately obtained. Methods The oven-drying method and DNS method were used to determine the cellulose-utilizing capability of So ce shu-1. The antibacterial and antitumor effects of the secondary metabolites of So ce shu-1 were investigated by filter paper method and MTT method, respectively. Results So ce shu-1 could use the cellulose from cornstalk and filter paper, and its cellulase activity was 12.30 UFPA/mL. The secondary metabolites of So ce shu-1 had broad-spectrum antimicrobial activity and could effectively inhibit the growth of tumor cells, especially inhibiting K562 cell line. Conclusion So ce shu-1 can be used in energy development and its secondary metabolites have a bright development perspective in drug and food fresh-keeping.
Key words：myxobacterium; secondary metabolite; bioactivity
目前已从黏细菌中发现约600多种生物活性物质，约占微生物来源总数的5 %。黏细菌产生的生物活性物质种类繁多，结构新颖，作用层次多，作用机制多样等。这些次级代谢物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、抗高血压、抗糖尿病、抗疟疾以及抗高胆固醇症等特性。抗生素产生菌比例高于放线菌，现已成为生物活性物质的新微生物来源[1,2]，如epo系列的抗肿瘤药物，比传统抗肿瘤药物紫杉醇具有更多的优点[3]。某些黏细菌能利用纤维素，为将纤维素（农作物废弃物的主要成分）转化为生物燃料提供了新的选择。因此，黏细菌在能源综合利用及其次级代谢物在食品、医药工业的应用上都值得深入研究。我们现从这两方面对分离到的黏细菌进行了初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和细胞黏细菌：So ce shu-1 按中国药科大学生命科学学院报道的方法分离[4]。测试菌株：大肠杆菌（ Escherichia coli DH 5α）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、耐药金葡菌[Staphyloccocus aureus atcc 29213(耐药菌株)]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、短小杆菌（Corynbacterium parυm）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、伤寒杆菌（Salmonella typhi）、副乙伤寒杆菌（Salmonella paratyphi B）由本校微生物学教研室保存。肿瘤细胞株：HeLa、KB、K562以及SGC7901肿瘤细胞均购自上海生化细胞所。
1.1.2培养基发酵培养基（g/L）：KNO3 1.0；K2HPO4・2H2O 1.0；MgSO4・7H2O 1.0；CaCl2 1.0；FeCl3・6H2O 0.2，酵母提取物10 g；加入放线菌酮（0.1 %），pH 7.2。固体培养基：在发酵培养基中按10 g/L加入琼脂。
1.2方法
1.2.1降解纤维素（1）将培养基分装于试管，新华一号滤纸剪成约0.5 cm×5 cm 的长条，部分露于培养基液面外。接种So ce shu-1至培养基中，以不接种者为空白对照。
（2）从平板上接种菌种至3 mL液体选择培养基上，37 ℃摇床培养1 d，成为种子菌液；取10 ％种子菌液转入25 mL培养基中，37 ℃摇床培养至菌液A600为0.3；再加入2 000 g玉米秸秆粉，配制成半固体状，37 ℃培养1 d。培养后的混合物过滤取不溶物，烘干，称重计算秸秆降解率［5］。
1.2.2黏细菌纤维素酶活性――滤纸酶活性（FPA）的测定[6]以新华滤纸为底物，加入1.0 mL适当稀释的纤维素酶溶液，在特定pH值下，50 ℃反应1 h，用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定反应生成的还原糖[7]。1个滤纸酶活性单位（1 UFPA）定义为上述条件下每1 h由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量，用U/mL表示。
1.2.3次级代谢物的分离及抑菌测定分离次级代谢物的方法按文献[4]，抑菌实验用滤纸法[8]。向培养皿倾倒含菌培养基，铺置滤纸片，在滤纸片上滴加一定量的次级代谢物提取液，培养并测量形成的抑菌圈。以吸取蒸馏水的滤纸片为空白对照。
1.2.4次级代谢物的细胞毒实验用溴化四唑蓝（MTT）法[9]。
2结果
2.1测定黏细菌So ce shu-1对纤维素的水解
2.1.1So ce shu-1对滤纸的利用培养2周后，So ce shu-1使滤纸变薄，纤维素分解反应呈阳性，表明So ce shu-1可利用纤维素作为碳源。
2.1.2So ce shu-1对秸秆的利用So ce shu-1与秸秆共培养后，经烘干称重，玉米秸秆干重减少0.310 g， 降解率为15.50 ％。
2.2纤维素酶活性的测定
培养液中纤维素酶的酶活性为 12.30 UFPA/mL。
2.3次级代谢物的抑菌作用
2.3.1抑菌谱的测定So ce shu-1次级代谢物抑制受试细菌的结果见表1。
由表1可见，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对大部分受试细菌有明显的抑制作用，即具有广谱抗菌作用。
2.3.2抑制大肠杆菌的效果不同浓度的次级代谢物抑制大肠杆菌的结果见表2。
由表2可见，随So ce shu-1次级代谢物量的增加，抑菌圈直径增大，抑菌效果更加明显，在一定范围内呈浓度依赖性。
2.4次级代谢物对K562肿瘤细胞株的细胞毒作用
So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞株作用24，48，72 h后，其对K562肿瘤细胞的抑制率见图1。
由图1可见，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞株有很好的抑制作用。药物浓度小于0.121 mg/mL时，抑制率随药物浓度增加而迅速增加，增幅明显；药物浓度大于0.121 mg/mL时，抑制率随药物浓度增加呈增加趋势，但增幅趋于平缓；药物作用时间越长，抑制效果越明显，72 h的抑制效果明显优于48 h和24 h。肿瘤细胞24 h后的抑制效果见图2。
由图2可见，给药24 h后，细胞形态发生很大变化，细胞萎缩呈球状，黯淡无光泽，数量较稀疏，甚至出现细胞破裂溶出现象（A）；对照组细胞饱满、有光泽（B）。
So ce shu-1次级代谢物作用于其他肿瘤细胞株以及与K562的比较见表3。
由表3可见，黏细菌的次级代谢物对多种肿瘤细胞均有抑制作用，抑制效果随作用时间的延长而增强，与对K562的抑制效果类似。表明，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对不同的肿瘤细胞株也有抑制作用，有明显的时间依赖性。
3讨论
能源问题是目前全世界面临的重大课题，研究表明，黏细菌尤其是嗜纤维素的黏细菌能够利用纤维素，这为木质纤维素转化为能源提供了一大类新的微生物来源。我们初步研究的结果表明，分离所得的黏细菌确能降解玉米秸秆。此菌株降解秸秆的机制有待进一步研究，菌株降解条件也有待优化，以能更好的利用能源。
文献报道黏细菌次级代谢物对大多真菌有一定的抑制作用，对细菌特别是革兰阴性菌基本没有抑制作用[10,11]，而本研究表明So ce shu-1次级代谢物对革兰阳性菌和阴性菌均有很好的抑制效果。我们发现，So ce shu-1次级代谢物对大肠杆菌的抑制效果不仅明显，而且可维持较长时间，出现抑菌圈6 d后仍未消失。尚无文献报道黏细菌代谢物抑制大肠杆菌的效果[12,13]，提示该粗提物中可能存在新活性物质，有潜在的开发利用前景。
黏细菌So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞有较好抑制效果，我们还用其他肿瘤细胞如HeLa、KB和SGC7901做了实验，结果表明次级代谢物对肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用。此外，该菌的次级代谢物对MDA-MB-231和SMMC7721也有一定的抑制作用（数据未显示），表明它具有广谱抗肿瘤细胞活性；此菌的次级代谢物抑菌谱中，抑制菌多数为致病菌。从抑菌和抗肿瘤两个方面的研究表明，此菌的次级代谢物在药物和食品保鲜方面有很好的应用前景。
参考文献
[1]吴斌辉，李越中，胡玮. 纤维堆囊菌活性次级代谢产物的研究进展[J]. 微生物学通报，2002，29（2）：75-78.
[2]Rachid S, Gerth K, Kochems I, et al. Deciphering regulatory mechanisms for secondary metabolite production in the myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56[J]. Mol Microbiol. 2007,63(6): 1783-1796.
[3]Reichenbach H, H�le G. Discovery and development of the epothilones : a novel class of antineoplastic drugs[J]. J Antibiot, 2008, 9(1): 1-10.
[4]刘迎，马中良，王�. 海滨土壤黏细菌次级代谢产物的性质及产量调控的研究[J]. 微生物学通报，2006，33（3）：42-46.
[5]杜甫佑，张晓昱，王宏勋. 木质纤维素的定量测定及降解规律的初步研究[J]. 生物技术，2004，14（5）：46-48.
[6]沈金龙，毛爱军，王远亮，等. 纤维素酶在木质纤维素生物质转化中的应用研究[J]. 微生物学报，2004，44（4）：507-510.
[7]Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Anal Chem, 1959, 31(3): 426-428.
[8]黎晶晶，康银花，王�，等. 抗MRSA链霉菌NJ0510的抑菌活性及发酵影响因素的研究[J]. 药物生物技术，2007，17（1）：39-42.
[9]马中良，刘迎，黎晶晶，等. 黏细菌So ce cpu - 1 的鉴定及其抗肿瘤活性研究[J]. 生物技术，2006，16（6）：32-35.
[10] Khalil M W, Sasse F, Lunsdorf H, et al. Mechanism of action of tubulysin, an antimitotic peptide from myxobacteria[J]. Chembiochem,2006, 7(4): 678-683.
[11] Rachid S, Sasse F, Beyer S, et al. Identification of StiR, the first regulator of secondary metabolite formation in the myxobacterium Cystobacter fuscus Cb f17.1[J]. J Biotechnol, 2006, 121(4): 429-441
[12] Sasse F, Bohlendorf B, Herrmann M, et al. Melithiazols, new beta-methoxyacrylate inhibitors of the respiratory chain isolated from myxobacteria. Producton, isolation, physico-chemical and biological properties[J]. J Antibiot, 1999, 52(8): 721-729.
[13] Gerth K, Bedorf N, Hofle G, et al. Discovery and development of the epothilones: a novel class of antineoplastic drugs. [J]. Drugs R D, 2008, 9(1): 1-10.
摘要：目的研究分离到的黏细菌So ce shu-1及其次级代谢物的生物学特性。方法用烘干法和DNS法测定So ce shu-1利用纤维素的能力，用滤纸片法和溴化四唑蓝（MTT）法测定So ce shu-1利用纤维素次级代谢物抑制细菌和肿瘤细胞的效果。结果So ce shu-1能利用玉米秸秆和滤纸等纤维素，纤维素酶活性为12.30 UFPA/mL, 其次级代谢物有广谱抗菌活性，对 K562等肿瘤细胞有较好的抑制效果。结论So ce shu-1在能源利用方面，其次级代谢物在药物和食品保鲜方面具有良好的开发前景。
关键词：黏细菌；次生代谢物；生物活性
中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0027-04
Preliminary Study on Bioactivity of Myxobacterium So ce shu-1 and Its Secondary Metabolites
LI Yan-li1, ZHANG Yin-lei2, LIU Ying, MA Zhong-liang2*
(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Bioenergy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China)
Abstract：Objective To study the bioactivity of myxobacterium So ce shu-1 and its secondary metabolites which can be separately obtained. Methods The oven-drying method and DNS method were used to determine the cellulose-utilizing capability of So ce shu-1. The antibacterial and antitumor effects of the secondary metabolites of So ce shu-1 were investigated by filter paper method and MTT method, respectively. Results So ce shu-1 could use the cellulose from cornstalk and filter paper, and its cellulase activity was 12.30 UFPA/mL. The secondary metabolites of So ce shu-1 had broad-spectrum antimicrobial activity and could effectively inhibit the growth of tumor cells, especially inhibiting K562 cell line. Conclusion So ce shu-1 can be used in energy development and its secondary metabolites have a bright development perspective in drug and food fresh-keeping.
Key words：myxobacterium; secondary metabolite; bioactivity
目前已从黏细菌中发现约600多种生物活性物质，约占微生物来源总数的5 %。黏细菌产生的生物活性物质种类繁多，结构新颖，作用层次多，作用机制多样等。这些次级代谢物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、抗高血压、抗糖尿病、抗疟疾以及抗高胆固醇症等特性。抗生素产生菌比例高于放线菌，现已成为生物活性物质的新微生物来源[1,2]，如epo系列的抗肿瘤药物，比传统抗肿瘤药物紫杉醇具有更多的优点[3]。某些黏细菌能利用纤维素，为将纤维素（农作物废弃物的主要成分）转化为生物燃料提供了新的选择。因此，黏细菌在能源综合利用及其次级代谢物在食品、医药工业的应用上都值得深入研究。我们现从这两方面对分离到的黏细菌进行了初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和细胞黏细菌：So ce shu-1 按中国药科大学生命科学学院报道的方法分离[4]。测试菌株：大肠杆菌（ Escherichia coli DH 5α）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、耐药金葡菌[Staphyloccocus aureus atcc 29213(耐药菌株)]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、短小杆菌（Corynbacterium parυm）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、伤寒杆菌（Salmonella typhi）、副乙伤寒杆菌（Salmonella paratyphi B）由本校微生物学教研室保存。肿瘤细胞株：HeLa、KB、K562以及SGC7901肿瘤细胞均购自上海生化细胞所。
1.1.2培养基发酵培养基（g/L）：KNO3 1.0；K2HPO4・2H2O 1.0；MgSO4・7H2O 1.0；CaCl2 1.0；FeCl3・6H2O 0.2，酵母提取物10 g；加入放线菌酮（0.1 %），pH 7.2。固体培养基：在发酵培养基中按10 g/L加入琼脂。
1.2方法
1.2.1降解纤维素（1）将培养基分装于试管，新华一号滤纸剪成约0.5 cm×5 cm 的长条，部分露于培养基液面外。接种So ce shu-1至培养基中，以不接种者为空白对照。
（2）从平板上接种菌种至3 mL液体选择培养基上，37 ℃摇床培养1 d，成为种子菌液；取10 ％种子菌液转入25 mL培养基中，37 ℃摇床培养至菌液A600为0.3；再加入2 000 g玉米秸秆粉，配制成半固体状，37 ℃培养1 d。培养后的混合物过滤取不溶物，烘干，称重计算秸秆降解率［5］。
1.2.2黏细菌纤维素酶活性――滤纸酶活性（FPA）的测定[6]以新华滤纸为底物，加入1.0 mL适当稀释的纤维素酶溶液，在特定pH值下，50 ℃反应1 h，用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定反应生成的还原糖[7]。1个滤纸酶活性单位（1 UFPA）定义为上述条件下每1 h由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量，用U/mL表示。
1.2.3次级代谢物的分离及抑菌测定分离次级代谢物的方法按文献[4]，抑菌实验用滤纸法[8]。向培养皿倾倒含菌培养基，铺置滤纸片，在滤纸片上滴加一定量的次级代谢物提取液，培养并测量形成的抑菌圈。以吸取蒸馏水的滤纸片为空白对照。
1.2.4次级代谢物的细胞毒实验用溴化四唑蓝（MTT）法[9]。
2结果
2.1测定黏细菌So ce shu-1对纤维素的水解
2.1.1So ce shu-1对滤纸的利用培养2周后，So ce shu-1使滤纸变薄，纤维素分解反应呈阳性，表明So ce shu-1可利用纤维素作为碳源。
2.1.2So ce shu-1对秸秆的利用So ce shu-1与秸秆共培养后，经烘干称重，玉米秸秆干重减少0.310 g， 降解率为15.50 ％。
2.2纤维素酶活性的测定
培养液中纤维素酶的酶活性为 12.30 UFPA/mL。
2.3次级代谢物的抑菌作用
2.3.1抑菌谱的测定So ce shu-1次级代谢物抑制受试细菌的结果见表1。
由表1可见，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对大部分受试细菌有明显的抑制作用，即具有广谱抗菌作用。
2.3.2抑制大肠杆菌的效果不同浓度的次级代谢物抑制大肠杆菌的结果见表2。
由表2可见，随So ce shu-1次级代谢物量的增加，抑菌圈直径增大，抑菌效果更加明显，在一定范围内呈浓度依赖性。
2.4次级代谢物对K562肿瘤细胞株的细胞毒作用
So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞株作用24，48，72 h后，其对K562肿瘤细胞的抑制率见图1。
由图1可见，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞株有很好的抑制作用。药物浓度小于0.121 mg/mL时，抑制率随药物浓度增加而迅速增加，增幅明显；药物浓度大于0.121 mg/mL时，抑制率随药物浓度增加呈增加趋势，但增幅趋于平缓；药物作用时间越长，抑制效果越明显，72 h的抑制效果明显优于48 h和24 h。肿瘤细胞24 h后的抑制效果见图2。
由图2可见，给药24 h后，细胞形态发生很大变化，细胞萎缩呈球状，黯淡无光泽，数量较稀疏，甚至出现细胞破裂溶出现象（A）；对照组细胞饱满、有光泽（B）。
So ce shu-1次级代谢物作用于其他肿瘤细胞株以及与K562的比较见表3。
由表3可见，黏细菌的次级代谢物对多种肿瘤细胞均有抑制作用，抑制效果随作用时间的延长而增强，与对K562的抑制效果类似。表明，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对不同的肿瘤细胞株也有抑制作用，有明显的时间依赖性。
3讨论
能源问题是目前全世界面临的重大课题，研究表明，黏细菌尤其是嗜纤维素的黏细菌能够利用纤维素，这为木质纤维素转化为能源提供了一大类新的微生物来源。我们初步研究的结果表明，分离所得的黏细菌确能降解玉米秸秆。此菌株降解秸秆的机制有待进一步研究，菌株降解条件也有待优化，以能更好的利用能源。
文献报道黏细菌次级代谢物对大多真菌有一定的抑制作用，对细菌特别是革兰阴性菌基本没有抑制作用[10,11]，而本研究表明So ce shu-1次级代谢物对革兰阳性菌和阴性菌均有很好的抑制效果。我们发现，So ce shu-1次级代谢物对大肠杆菌的抑制效果不仅明显，而且可维持较长时间，出现抑菌圈6 d后仍未消失。尚无文献报道黏细菌代谢物抑制大肠杆菌的效果[12,13]，提示该粗提物中可能存在新活性物质，有潜在的开发利用前景。
黏细菌So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞有较好抑制效果，我们还用其他肿瘤细胞如HeLa、KB和SGC7901做了实验，结果表明次级代谢物对肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用。此外，该菌的次级代谢物对MDA-MB-231和SMMC7721也有一定的抑制作用（数据未显示），表明它具有广谱抗肿瘤细胞活性；此菌的次级代谢物抑菌谱中，抑制菌多数为致病菌。从抑菌和抗肿瘤两个方面的研究表明，此菌的次级代谢物在药物和食品保鲜方面有很好的应用前景。
参考文献
[1]吴斌辉，李越中，胡玮. 纤维堆囊菌活性次级代谢产物的研究进展[J]. 微生物学通报，2002，29（2）：75-78.
[2]Rachid S, Gerth K, Kochems I, et al. Deciphering regulatory mechanisms for secondary metabolite production in the myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56[J]. Mol Microbiol. 2007,63(6): 1783-1796.
[3]Reichenbach H, H�le G. Discovery and development of the epothilones : a novel class of antineoplastic drugs[J]. J Antibiot, 2008, 9(1): 1-10.
[4]刘迎，马中良，王�. 海滨土壤黏细菌次级代谢产物的性质及产量调控的研究[J]. 微生物学通报，2006，33（3）：42-46.
[5]杜甫佑，张晓昱，王宏勋. 木质纤维素的定量测定及降解规律的初步研究[J]. 生物技术，2004，14（5）：46-48.
[6]沈金龙，毛爱军，王远亮，等. 纤维素酶在木质纤维素生物质转化中的应用研究[J]. 微生物学报，2004，44（4）：507-510.
[7]Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Anal Chem, 1959, 31(3): 426-428.
[8]黎晶晶，康银花，王�，等. 抗MRSA链霉菌NJ0510的抑菌活性及发酵影响因素的研究[J]. 药物生物技术，2007，17（1）：39-42.
[9]马中良，刘迎，黎晶晶，等. 黏细菌So ce cpu - 1 的鉴定及其抗肿瘤活性研究[J]. 生物技术，2006，16（6）：32-35.
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[11] Rachid S, Sasse F, Beyer S, et al. Identification of StiR, the first regulator of secondary metabolite formation in the myxobacterium Cystobacter fuscus Cb f17.1[J]. J Biotechnol, 2006, 121(4): 429-441
[12] Sasse F, Bohlendorf B, Herrmann M, et al. Melithiazols, new beta-methoxyacrylate inhibitors of the respiratory chain isolated from myxobacteria. Producton, isolation, physico-chemical and biological properties[J]. J Antibiot, 1999, 52(8): 721-729.
[13] Gerth K, Bedorf N, Hofle G, et al. Discovery and development of the epothilones: a novel class of antineoplastic drugs. [J]. Drugs R D, 2008, 9(1): 1-10.