大连海洋大学
发育生物学期末论文
题 目： 细胞凋亡的检测方法
学生姓名： 王英
学 院： 水产与生命学院
专 业： 海洋生物学
学 号： [1**********]31
指导教师： 李霞
二 〇 一 五 年 十一月
1
摘 要
细胞凋亡（apoptosis）即程序性死亡（programmed cell death,PCD），是生理性细胞死亡过程。细胞凋亡过程涉及一系列基因的激活、表达以及调控。凋亡在维持动物机体内环境稳态中扮演者重要的角色。细胞凋亡的准确检测是研究细胞凋亡相关机制，以及细胞凋亡在疾病中的应用很关键的步骤。本文综述了细胞凋亡的检测方法。分别从体外细胞凋亡检测方法和体内细胞凋亡检测方法进行了总结概括。并且分析了每种方法的优劣势，并在文章结尾对未来细胞凋亡的检测方法进行了展望。
关键词：细胞凋亡；检测方法； 研究进展
2
Abstract
Apoptosis (programmed cell death, PCD), is a physiological cell death process.Cell apoptosis process involves a series of activation, expression and regulation of genes.Apoptosis in maintaining body homeostasis plays a important role.Apoptosis of accurate detection mechanism is the study of cell apoptosis, and cell apoptosis in the application of disease is the key steps.This paper summarizes the measuring method of cell apoptosis.Respectively from in vitro cell apoptosis detection method and cell apoptosis in vivo detection methods are summarized.And the advantages and disadvantages of each method are analyzed, as well as apoptosis detection method in the future was prospected.
Key words:Apoptosis; detection method; research progress
3
目 录
引 言 ............................................................ 1 1细胞凋亡的体外检测 .................................................. 2
1.1细胞凋亡的形态学检测 ............................................... 2
1.2细胞凋亡的DNA片段化检测 .......................................... 2
1.2.1DNA ladder ..................................................... 2
1.2.2TUNEL检测法 ................................................... 2
1.2.3ELISA检测法 ................................................... 3
1.3细胞凋亡的线粒体膜电位的检测 .................................... 3
1.4细胞凋亡的相关基因的检测 ........................................ 3
1.4.1凋亡促进基因的表达检测 ........................................ 3
1.4.2凋亡抑制基因的表达检测 ........................................ 3
1.5细胞凋亡的流式细胞术检测 ........................................ 4
1.6细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测 .................................. 4
2细胞凋亡的体内检测 ................................................ 5
2.1AnnexinV ......................................................... 5
2.2Synaptotagmin I-C2A .............................................. 5
2.3ApoSese .......................................................... 6
3细胞凋亡检测技术的展望 ............................................ 6
参考文献 ............................................................ 7
致 谢 ............................................................ 8
4
引 言
细胞凋亡这个概念最初由英国阿伯丁大学病理学教授JF Kerr通过对肝脏细
[1]胞的研究提出的，又称为细胞程序性死亡。它是一个主动的，受基因控制的生
理病理反应。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为了适应更好的生存环境而采取的一种主动性死亡的过程。细胞凋亡发生了明显的生态学改变，包括细胞皱缩，线粒体膜电位下降，染色体凝聚和DNA的片段化等。过量或过少的细胞凋亡均对机体有害。人类和动物的好多疾病的发生都与细胞凋亡有密切关系，若能恰当的加速或阻断细胞凋亡，可为有效防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径[2]。因此细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的关键步骤。
5
1细胞凋亡的体外检测
1.1细胞凋亡的形态学检测
1972年Kerr等就是根据形态学的变化将凋亡细胞和坏死细胞区分开来的。由于在电镜下能够观察到细胞结构在细胞不同凋亡时期的变化，因此电镜用来区别凋亡与坏死[3]。细胞发生凋亡时细胞核表现缩小，染色质边缘化、凝集。凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。DNA特异性燃料（Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等）与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合，从而使细胞核着色，在紫外光激发时会出现明显的荧光。（Strasser A，唐炳华等人已在文章中阐述了此点）通过荧光显微镜可观察到细胞染色质的形态学变化及膜结构与通透性的改变。从而鉴别细胞凋亡和细胞坏死及正常细胞。此法简便易行，可用于细胞涂片或滴片定性观察细胞凋亡现象，但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力，所以不使用大量凋亡样本的检测。
1.2细胞凋亡的DNA片段化检测
1.2.1 DNA ladder
细胞凋亡时，由于核酸内切酶被激活，DNA被切成50-300kb大小的片段，然后进一步分解成约180bp的整数倍的寡核酸片段。用琼脂糖凝胶电泳检测显示梯形条带，而坏死细胞DNA则被降解成弥散的条带。张广智、李帅等在《细胞凋亡的主要检测方法研究进展》中简洁总结。刘江红等人抽提细胞的DNA，确定样品中DNA的量和纯度运用到了此法。DNA ladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶电泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。
1.2.2 TUNEL检测法
TUNEL法最早由Gavrieli[4]于1992年引入，TUNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180 bp～200 bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色[5]。但TUNEL法也有局限性。如:组织固定、处理的过程本1
身会改变检测结果,对细胞凋亡不是特异性的,坏死细胞也会被标记。朱汉化等人用此法检测了细胞凋亡在《检测心肌细胞的凋亡与探讨》课题中。
1.2.3 ELISA检测法
应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度[6]。此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。ELISA可用于贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、血清、血浆等的检测。该方法可检测早期细胞凋亡,灵敏度高,适用于多样本。FRANKFURTOS,KRISHANA运用酶联免疫法快速的检测到凋亡细胞并对凋亡细胞作用的药物进行了筛选。
1.3细胞凋亡的线粒体膜电位的检测
线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度,在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调节细胞凋亡
[7,8]。线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件。而且一旦线粒体膜电位耗散,凋亡就不可逆转。线粒体膜电位变化的检测属于电化学的方法,使用时需始终保持平衡染液pH的一致性。
1.4细胞凋亡的相关基因的检测
1.4.1凋亡促进基因的表达检测
caspases家族基因表达产物是促进细胞发生凋亡的主要酶类,细胞凋亡机制的执行基本都是由一个进化上保守的caspase完成的。在凋亡中根据其作用及扮演的角色不同,caspase可以分为2类,启动caspase和执行caspase。启动caspase包括caspase 8、9、10,执行caspase包括caspase 3、6、7。其中caspase 8和10外源性细胞凋亡的启动者,caspase 9是内源性细胞凋亡的启动者[9]。不同的细胞系与不同的凋亡刺激因素会引起不同种类的caspases活化。因此,不同的细胞凋亡,也需要选取不同的caspase来检测,最终确定凋亡促进基因的表达情况[10]。李超等人在《细胞凋亡与研究进展》中通过此法进行了细胞凋亡的检测。
1.4.2凋亡抑制基因的表达检测通过
通常在检测细胞凋亡试验中,除检测凋亡促进基因的表达外,还会同时检测抑制凋亡基因的表达情况来反映细胞凋亡,如核因子-κB(NF-κB),环氧合酶(COX)和BCL-2家族成员等基因。NF-κB是调节细胞基因转录的关键因子,它参与了多种凋亡相关基因的表达,目前已发现NF-κB可促使某些抗凋亡基因表达
2
上调。COX定位于内质网附近并普遍存在于多种组织细胞内,促使生理性前列腺素的合成,以维护细胞自身稳定和调节正常组织细胞的一些生理活动[11]。Bcl-xL和Bcl-2是BCL-2家族中的成员,它们在抗凋亡中均发挥了重要的作用,但在不同的细胞类型和不同的死亡信号作用过程中,两者发挥的作用并不相同。而且当细胞内BCL-2抗凋亡成员的表达量增加时,线粒体通透性的改变和促凋亡蛋白的释放所带来的促凋亡作用可以被其抵消掉[12]。Beevi S等用RT-PCR检测促凋亡基因p53、Bax和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表达,进而确定了胡萝卜提取物对人类癌细胞增殖和凋亡的影响。
1.5细胞凋亡的流式细胞术检测
流式细胞分析法可对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选，是定量检测细胞凋亡的重要方法之一.。流式细胞术主要包括多种方法，其中AnnexinV/PI法是目前较为流行的检测细胞凋亡的方法。细胞凋亡时磷脂酞丝氨酸(phosphatidy卫-serine,PS)由细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧。An-nexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，对PS具有较高亲和性。它可以较为敏感地检测细胞膜表面的翻转的PS，可特异结合异硫氰酸荧光素(FITC)而保持细胞膜的完整性。另外,变性染色质的荧光染料碘化丙咙(PI)不进入细胞质，因而，在流式细胞仪得到的双变量散点图上，正常活细胞均低染，凋亡细胞Annexin高染PI低染，坏死细胞均高染。Feng Qian等用多种方法检测京尼平引起的人白血病细胞系K562细胞凋亡,并用PI染色观察细胞周期的分布。武发菊等[13]通过对比发现吖啶橙和溴化乙锭双重荧光染色法是定性测定细胞凋亡的较为可靠的方法,而FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞仪是较为理想的凋亡定量检测方法。
1.6细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测
Ca2+是细胞中一种非常重要的第二信使分子，许多细胞的生命活动均有其参与。关于Ca2+在细胞凋亡中的调控还有很多争议，就目前所得的结论为：内质网Ca2+丢失会引发内质网压力途径的细胞凋亡发生，压力诱导的Ca2+过多会导致细胞的更多坏死，因此调节Ca2+浓度的增加在内源性细胞凋亡途径中提供了重要的信号事件。目前有多种方法可以用来测定胞浆内Ca2+的变化,应用Ca2+特异性荧光探针,如Rhod-2、Indo-1、Fura-2、Fura-3和Quin-2对细胞进行标记后,通过流式细胞术分析,不仅能检测出细胞群体异质性,并能对多项生化指标进行测定,故该法具有较高的优越性。Jae Kyoo Lee等通过Fluo-4荧光标探针检测在特定压力条件下细胞凋亡中Ca2+浓度的动态变化。
2细胞凋亡的体内检测
尽管细胞凋亡在维持多细胞生物机体稳态、生长发育等生命活动中发挥重3
要作用。但是不正常的细胞凋亡会导致组织功能紊乱,包括自身免疫疾病、神经退行性疾病、肿瘤等。肿瘤的治疗方法很多，有效的肿瘤治疗包括通过化疗药物诱导体内细胞凋亡。临床上迫切需要非损伤性的方法来检测癌症病人使用药物的效果,以及对新药药效作出评价。因此,体内细胞凋亡检测试剂备受瞩目,目前只有处于临床阶段的体内细胞凋亡检测试剂,常规检测试剂尚未出现。
2.1 AnnexinV
在1994年,99mTc一AnllexinV就被用于心房颤动病人心房内血栓的检测。尽管结果是让人失望的,但这项研究表明99mTc一rhArmexinV可以以安全剂量用于临床放射影像。Kemerink等用gmTc标记Annex-inV与BTAP的络合物,然而过程复杂,而且反应条件苛刻,以及较低的标记纯度(30%礴O%),因而效果并不理想。Tokita等[14]用gmTc标记AnnexinV与脱基尼克酞胺(HYNIC)络合物,gmTc一HYNIC一劫nexinv表现出更好的肾、肝、膀耽吸收情况,尤其在腹部有较好的影像。
2.2 Synaptotagmin I-C2A
突触结合蛋白(synaptotagmin,syt)是1951年被发现的一类跨膜蛋白,广泛存在于神经和内分泌细胞内的分泌囊泡上,作为钙离子依赖性神经递质和激素释放过程中的钙离子感受器。Jung等[15]制备了生物素标记的CZA一GsT融合蛋白,并分别与抗生物素蛋白和抗生物素蛋白链菌素(二者与生物素有高结合力)连接,用于细胞凋亡的检测。Fang等[16]用gmTc一标记的CZA检测急性心脏细胞死亡。
2.3 ApoSese
Damianovieh等开发了一类小分子化合物一APosense家族,它们可以在凋亡或坏死细胞内积累。Damianovich等分别用荧光和放射标记了APosense家族的一个成员—丹磺酞半肤氨酸(DDC),在三种急性肾小管坏死动物模型做了体内 肾小管损伤检测:肾热缺血/再灌注、远端肾小管坏死以及盲肠结扎/穿孔术诱导的脓毒症。Aloya等用Aposense家族的另一个成员NS不732分别进行了细胞死亡的体内和体外实验。
3细胞凋亡检测技术的展望
目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多,但每种方法都有自身的局限性。进行细胞凋亡检测时,可以根据样本的特点,选择合适的方法或多种方法同时进行检测。用于体内细胞凋亡检测的试剂处在研究阶段,有意思的是它们的检测原理大都通过与凋亡细胞表面结合,这和示踪剂在体内滞留时间较短的要求相一致,
4
进入细胞就又多了一层屏障。Allnexinv及其变体、Sytl一CZA和APosense家族的某些分子的临床应用取决于它们研究的进展。相信随着对细胞凋亡认识的不断深入和检测技术的发展,特异性更强、灵感度更高的体内细胞凋亡检测试剂将会面世。
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参考文献
[1]张文根等.细胞生物学杂志.2004,26:257
[2] Otsuki Y et al. Prog Histochem Cytochem,2003,38:275
[3]HuertaS,GouletEJ,HuertYePezS,LivingstonEH.SereeninganddetectionofaPoPtosis.JSurgRes2007:139(l):143一56.
[4]GavrieliY,ShermanY,BenSassonSA.IdentifieationofPro-grammedeelldeathinsituviasPecifielabelingofnuelearDNAfragmentation.JCellBiol1992:119(3):493一501.
[5] 朱汉华,李浪,汪熠,等.TUNEL检测心肌细胞凋亡的影响因素探讨[J].广西医科大学学报,2009,26(1):24-26.
[6]Salgame P,Varadhachary A S,Primiano L I,et al.An ELISAfor detection of apoptosis[J].Nucleic Acids Res,1997,25:680-682.
[7]刘杜先,张慧.细胞凋亡及其研究进展[J].高血压专业杂志,2002,8(11):627 628.
[8]徐静.细胞凋亡与线粒体[J].中国血液流变学杂志,2004,14(2):274 276.
[9]Andrew H.Wyllie.“Where,O Death,Is Thy Sting?”ABrief Review of Apoptosis Biology[J].Mol Neurobiol,2010,42:4-9.
[10]Vermes I,Haanen C,Steffens-Nakken H.A novel assay forapoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine ex-pression on early apoptotic cells
usingfluorescein labeled An-nexin V[J].J Immunol Methods,1995,184:39-51.
[11] 宿连政,靳祥云.NF-κB与cox-2在胃癌细胞增殖与凋亡的研究进展[J].临床与医疗,2009,29:776-777.
[12]郑}民,王自正,杨翔,华子春,王峰,方纬。Tc一Armex-inV衍生物的制备及其生物分布和凋亡显像。中华核医学杂志2007:27(5):288一引.
[13]武发菊,刘学荣,尚勇良,等.动物细胞大规模培养中细胞凋亡检测方法的研究[J].中国畜牧兽医,2010,37:237-241.弓明钦,陈羽.黑孢块菌的苗木菌根化合成效果研究[J],林业科学研究，2003，16（1）：52-57.
[14]TaitJF,BrownDS,GibsonDF,BlankenbelgFG,SussHWDevel-oPmentandeharacterizationofannexinVmutantswithendogenousehelationsitesfor(99m)Tc.BioeonjugChem2000;11(
6):918一25
[15]JungHl,KettunenMl,DavletovB,BrindleKM.DeteetionofaPoProsisusingtheCZAdomainofsynaPtotagmin1.BioconjugChern2004:15(5):983一7.
[16]WangF,FangW,ZhaoM,WangZ,JIS,LiY,elal.ImagingPaclitaxel(ehemotheraPy)一indueedtumoraPoPtosiswith99mTc-CZA,adomainofsynaPtotagminl:aPrelimina卿study.NuelMedBiol2008;35(3):359一64.
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致 谢
感谢我的导师李霞老师，本设计在她的悉心指导和严格要求下业已完成，在此，谨向老师表示崇高的敬意和衷心的感谢。
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大连海洋大学
发育生物学期末论文
题 目： 细胞凋亡的检测方法
学生姓名： 王英
学 院： 水产与生命学院
专 业： 海洋生物学
学 号： [1**********]31
指导教师： 李霞
二 〇 一 五 年 十一月
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摘 要
细胞凋亡（apoptosis）即程序性死亡（programmed cell death,PCD），是生理性细胞死亡过程。细胞凋亡过程涉及一系列基因的激活、表达以及调控。凋亡在维持动物机体内环境稳态中扮演者重要的角色。细胞凋亡的准确检测是研究细胞凋亡相关机制，以及细胞凋亡在疾病中的应用很关键的步骤。本文综述了细胞凋亡的检测方法。分别从体外细胞凋亡检测方法和体内细胞凋亡检测方法进行了总结概括。并且分析了每种方法的优劣势，并在文章结尾对未来细胞凋亡的检测方法进行了展望。
关键词：细胞凋亡；检测方法； 研究进展
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Abstract
Apoptosis (programmed cell death, PCD), is a physiological cell death process.Cell apoptosis process involves a series of activation, expression and regulation of genes.Apoptosis in maintaining body homeostasis plays a important role.Apoptosis of accurate detection mechanism is the study of cell apoptosis, and cell apoptosis in the application of disease is the key steps.This paper summarizes the measuring method of cell apoptosis.Respectively from in vitro cell apoptosis detection method and cell apoptosis in vivo detection methods are summarized.And the advantages and disadvantages of each method are analyzed, as well as apoptosis detection method in the future was prospected.
Key words:Apoptosis; detection method; research progress
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目 录
引 言 ............................................................ 1 1细胞凋亡的体外检测 .................................................. 2
1.1细胞凋亡的形态学检测 ............................................... 2
1.2细胞凋亡的DNA片段化检测 .......................................... 2
1.2.1DNA ladder ..................................................... 2
1.2.2TUNEL检测法 ................................................... 2
1.2.3ELISA检测法 ................................................... 3
1.3细胞凋亡的线粒体膜电位的检测 .................................... 3
1.4细胞凋亡的相关基因的检测 ........................................ 3
1.4.1凋亡促进基因的表达检测 ........................................ 3
1.4.2凋亡抑制基因的表达检测 ........................................ 3
1.5细胞凋亡的流式细胞术检测 ........................................ 4
1.6细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测 .................................. 4
2细胞凋亡的体内检测 ................................................ 5
2.1AnnexinV ......................................................... 5
2.2Synaptotagmin I-C2A .............................................. 5
2.3ApoSese .......................................................... 6
3细胞凋亡检测技术的展望 ............................................ 6
参考文献 ............................................................ 7
致 谢 ............................................................ 8
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引 言
细胞凋亡这个概念最初由英国阿伯丁大学病理学教授JF Kerr通过对肝脏细
[1]胞的研究提出的，又称为细胞程序性死亡。它是一个主动的，受基因控制的生
理病理反应。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为了适应更好的生存环境而采取的一种主动性死亡的过程。细胞凋亡发生了明显的生态学改变，包括细胞皱缩，线粒体膜电位下降，染色体凝聚和DNA的片段化等。过量或过少的细胞凋亡均对机体有害。人类和动物的好多疾病的发生都与细胞凋亡有密切关系，若能恰当的加速或阻断细胞凋亡，可为有效防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径[2]。因此细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的关键步骤。
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1细胞凋亡的体外检测
1.1细胞凋亡的形态学检测
1972年Kerr等就是根据形态学的变化将凋亡细胞和坏死细胞区分开来的。由于在电镜下能够观察到细胞结构在细胞不同凋亡时期的变化，因此电镜用来区别凋亡与坏死[3]。细胞发生凋亡时细胞核表现缩小，染色质边缘化、凝集。凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。DNA特异性燃料（Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等）与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合，从而使细胞核着色，在紫外光激发时会出现明显的荧光。（Strasser A，唐炳华等人已在文章中阐述了此点）通过荧光显微镜可观察到细胞染色质的形态学变化及膜结构与通透性的改变。从而鉴别细胞凋亡和细胞坏死及正常细胞。此法简便易行，可用于细胞涂片或滴片定性观察细胞凋亡现象，但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力，所以不使用大量凋亡样本的检测。
1.2细胞凋亡的DNA片段化检测
1.2.1 DNA ladder
细胞凋亡时，由于核酸内切酶被激活，DNA被切成50-300kb大小的片段，然后进一步分解成约180bp的整数倍的寡核酸片段。用琼脂糖凝胶电泳检测显示梯形条带，而坏死细胞DNA则被降解成弥散的条带。张广智、李帅等在《细胞凋亡的主要检测方法研究进展》中简洁总结。刘江红等人抽提细胞的DNA，确定样品中DNA的量和纯度运用到了此法。DNA ladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶电泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。
1.2.2 TUNEL检测法
TUNEL法最早由Gavrieli[4]于1992年引入，TUNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180 bp～200 bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色[5]。但TUNEL法也有局限性。如:组织固定、处理的过程本1
身会改变检测结果,对细胞凋亡不是特异性的,坏死细胞也会被标记。朱汉化等人用此法检测了细胞凋亡在《检测心肌细胞的凋亡与探讨》课题中。
1.2.3 ELISA检测法
应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度[6]。此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。ELISA可用于贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、血清、血浆等的检测。该方法可检测早期细胞凋亡,灵敏度高,适用于多样本。FRANKFURTOS,KRISHANA运用酶联免疫法快速的检测到凋亡细胞并对凋亡细胞作用的药物进行了筛选。
1.3细胞凋亡的线粒体膜电位的检测
线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度,在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调节细胞凋亡
[7,8]。线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件。而且一旦线粒体膜电位耗散,凋亡就不可逆转。线粒体膜电位变化的检测属于电化学的方法,使用时需始终保持平衡染液pH的一致性。
1.4细胞凋亡的相关基因的检测
1.4.1凋亡促进基因的表达检测
caspases家族基因表达产物是促进细胞发生凋亡的主要酶类,细胞凋亡机制的执行基本都是由一个进化上保守的caspase完成的。在凋亡中根据其作用及扮演的角色不同,caspase可以分为2类,启动caspase和执行caspase。启动caspase包括caspase 8、9、10,执行caspase包括caspase 3、6、7。其中caspase 8和10外源性细胞凋亡的启动者,caspase 9是内源性细胞凋亡的启动者[9]。不同的细胞系与不同的凋亡刺激因素会引起不同种类的caspases活化。因此,不同的细胞凋亡,也需要选取不同的caspase来检测,最终确定凋亡促进基因的表达情况[10]。李超等人在《细胞凋亡与研究进展》中通过此法进行了细胞凋亡的检测。
1.4.2凋亡抑制基因的表达检测通过
通常在检测细胞凋亡试验中,除检测凋亡促进基因的表达外,还会同时检测抑制凋亡基因的表达情况来反映细胞凋亡,如核因子-κB(NF-κB),环氧合酶(COX)和BCL-2家族成员等基因。NF-κB是调节细胞基因转录的关键因子,它参与了多种凋亡相关基因的表达,目前已发现NF-κB可促使某些抗凋亡基因表达
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上调。COX定位于内质网附近并普遍存在于多种组织细胞内,促使生理性前列腺素的合成,以维护细胞自身稳定和调节正常组织细胞的一些生理活动[11]。Bcl-xL和Bcl-2是BCL-2家族中的成员,它们在抗凋亡中均发挥了重要的作用,但在不同的细胞类型和不同的死亡信号作用过程中,两者发挥的作用并不相同。而且当细胞内BCL-2抗凋亡成员的表达量增加时,线粒体通透性的改变和促凋亡蛋白的释放所带来的促凋亡作用可以被其抵消掉[12]。Beevi S等用RT-PCR检测促凋亡基因p53、Bax和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表达,进而确定了胡萝卜提取物对人类癌细胞增殖和凋亡的影响。
1.5细胞凋亡的流式细胞术检测
流式细胞分析法可对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选，是定量检测细胞凋亡的重要方法之一.。流式细胞术主要包括多种方法，其中AnnexinV/PI法是目前较为流行的检测细胞凋亡的方法。细胞凋亡时磷脂酞丝氨酸(phosphatidy卫-serine,PS)由细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧。An-nexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，对PS具有较高亲和性。它可以较为敏感地检测细胞膜表面的翻转的PS，可特异结合异硫氰酸荧光素(FITC)而保持细胞膜的完整性。另外,变性染色质的荧光染料碘化丙咙(PI)不进入细胞质，因而，在流式细胞仪得到的双变量散点图上，正常活细胞均低染，凋亡细胞Annexin高染PI低染，坏死细胞均高染。Feng Qian等用多种方法检测京尼平引起的人白血病细胞系K562细胞凋亡,并用PI染色观察细胞周期的分布。武发菊等[13]通过对比发现吖啶橙和溴化乙锭双重荧光染色法是定性测定细胞凋亡的较为可靠的方法,而FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞仪是较为理想的凋亡定量检测方法。
1.6细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测
Ca2+是细胞中一种非常重要的第二信使分子，许多细胞的生命活动均有其参与。关于Ca2+在细胞凋亡中的调控还有很多争议，就目前所得的结论为：内质网Ca2+丢失会引发内质网压力途径的细胞凋亡发生，压力诱导的Ca2+过多会导致细胞的更多坏死，因此调节Ca2+浓度的增加在内源性细胞凋亡途径中提供了重要的信号事件。目前有多种方法可以用来测定胞浆内Ca2+的变化,应用Ca2+特异性荧光探针,如Rhod-2、Indo-1、Fura-2、Fura-3和Quin-2对细胞进行标记后,通过流式细胞术分析,不仅能检测出细胞群体异质性,并能对多项生化指标进行测定,故该法具有较高的优越性。Jae Kyoo Lee等通过Fluo-4荧光标探针检测在特定压力条件下细胞凋亡中Ca2+浓度的动态变化。
2细胞凋亡的体内检测
尽管细胞凋亡在维持多细胞生物机体稳态、生长发育等生命活动中发挥重3
要作用。但是不正常的细胞凋亡会导致组织功能紊乱,包括自身免疫疾病、神经退行性疾病、肿瘤等。肿瘤的治疗方法很多，有效的肿瘤治疗包括通过化疗药物诱导体内细胞凋亡。临床上迫切需要非损伤性的方法来检测癌症病人使用药物的效果,以及对新药药效作出评价。因此,体内细胞凋亡检测试剂备受瞩目,目前只有处于临床阶段的体内细胞凋亡检测试剂,常规检测试剂尚未出现。
2.1 AnnexinV
在1994年,99mTc一AnllexinV就被用于心房颤动病人心房内血栓的检测。尽管结果是让人失望的,但这项研究表明99mTc一rhArmexinV可以以安全剂量用于临床放射影像。Kemerink等用gmTc标记Annex-inV与BTAP的络合物,然而过程复杂,而且反应条件苛刻,以及较低的标记纯度(30%礴O%),因而效果并不理想。Tokita等[14]用gmTc标记AnnexinV与脱基尼克酞胺(HYNIC)络合物,gmTc一HYNIC一劫nexinv表现出更好的肾、肝、膀耽吸收情况,尤其在腹部有较好的影像。
2.2 Synaptotagmin I-C2A
突触结合蛋白(synaptotagmin,syt)是1951年被发现的一类跨膜蛋白,广泛存在于神经和内分泌细胞内的分泌囊泡上,作为钙离子依赖性神经递质和激素释放过程中的钙离子感受器。Jung等[15]制备了生物素标记的CZA一GsT融合蛋白,并分别与抗生物素蛋白和抗生物素蛋白链菌素(二者与生物素有高结合力)连接,用于细胞凋亡的检测。Fang等[16]用gmTc一标记的CZA检测急性心脏细胞死亡。
2.3 ApoSese
Damianovieh等开发了一类小分子化合物一APosense家族,它们可以在凋亡或坏死细胞内积累。Damianovich等分别用荧光和放射标记了APosense家族的一个成员—丹磺酞半肤氨酸(DDC),在三种急性肾小管坏死动物模型做了体内 肾小管损伤检测:肾热缺血/再灌注、远端肾小管坏死以及盲肠结扎/穿孔术诱导的脓毒症。Aloya等用Aposense家族的另一个成员NS不732分别进行了细胞死亡的体内和体外实验。
3细胞凋亡检测技术的展望
目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多,但每种方法都有自身的局限性。进行细胞凋亡检测时,可以根据样本的特点,选择合适的方法或多种方法同时进行检测。用于体内细胞凋亡检测的试剂处在研究阶段,有意思的是它们的检测原理大都通过与凋亡细胞表面结合,这和示踪剂在体内滞留时间较短的要求相一致,
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进入细胞就又多了一层屏障。Allnexinv及其变体、Sytl一CZA和APosense家族的某些分子的临床应用取决于它们研究的进展。相信随着对细胞凋亡认识的不断深入和检测技术的发展,特异性更强、灵感度更高的体内细胞凋亡检测试剂将会面世。
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致 谢
感谢我的导师李霞老师，本设计在她的悉心指导和严格要求下业已完成，在此，谨向老师表示崇高的敬意和衷心的感谢。
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