_葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究

安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2008,36(1) :30-32　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　马君叶

β2葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究

伍毅1, 王洪新1,23

(1. 食品科学与技术国家重点实验室, 江南大学食品学院, 江苏无锡214012;2. 石河子大学食品学院, 新疆石河子832003)

摘要　采用β2葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE ) , 使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。通过正交试验得出水解的最佳工艺参数, 即温度

-3

40℃, 酶浓度5×10m g/m l ,pH 值5. 0下水解6h 。由HP LC 图谱可得该条件下水解的苷元得率9. 08%, 纯度68. 24%。酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分, 有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。

β关键词　银杏叶提取物; 黄酮苷元; 2葡萄糖苷酶; 水解

中图分类号　Q946　　文献标识码　A 　　文章编号　0517-6611(2008) 01-00030-03Study on H ydrolyzing G inkgo F lavone G lycoside w ith β2glycosid ase

ey Lab oratory of F ood Science and T echn ology , Sch ool of F ood Science &T echn ology , S outhern Y angtze University , W uxi , Jiangsu WU Yi et al 　(S tate K

) 214012

βAbstract 　2glycosidase was used to hydrolyze the extract from ginkg o leaves to trans form flav one glycoside into flav one aglycone. T he optimum techn o 2

-3

logical param eters of hydrolysis were obtained through orth og onal ex perim ent , which were enzym e concentration of 5×10m g/m l and pH value of 5. 0, hydrolysis tem perature of 40℃and tim e of 6h. It was kn own from HP LC spectrogram that the aglycone yield of under this condition was 9. 08%w ith purity of 68. 24%.In the enzym olysis products , the active ingredients such as ginkg o lactone were als o , which was in fav or of reserving the synthesized bioactivity of ginkg o leaves extract. K ey w ords 　G inkg o leaves extract ; Flav one aglycone ; β2glycosidase ; H ydrolysis

　　银杏(G inkgo biloba L. ) 属银杏科银杏属多年生落叶乔木, 是冰川时期存活的孑遗植物之一, 属我国特产植物, 南、湖北等地, 其种子、根、叶均可药用。黄酮类物质, , , 用, , 银杏黄酮被水解成, 黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍

[1-2]

[5]:

(1) [(A 1+A 2+A 3) ×K +B ]×100%

式中, A 1为槲皮素峰面积(m Au ) ; A 2为异鼠李素峰面积

(m Au ) ; A 3为山奈酚峰面积(m Au ) ; K 为槲皮素标准曲线斜率(mg/m l ) ; B 为槲皮素标准曲线截距; V 为样品溶液体积(m l ) ; W 为样品重量(mg ) 。

1. 3. 3　槲皮素标准曲线的制作[6]。准确称取对照品槲皮素0. 02g , 置于100m l 容量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 得槲皮素

。因此, 改善黄酮的

构型是提高银杏黄酮在人体内吸收率的重要途径。笔者采用生物酶法水解银杏黄酮, 生成了具有更高生物活性的苷元型黄酮, 而且具有环保、反应条件温和等优点。

1　材料与方法

1. 1　材料　银杏叶提取物(G BE ) , 黄酮含量≥24%, 由上海

标准储备液(0. 20mg/m l ) 。用移液管分别取槲皮素标准储备液2. 5、5、10、20、40m l , 用无水甲醇定容至50m l 容量瓶, 得

0. 01、0. 02、0. 04、0. 08、0. 16mg/m l 的标准溶液。分别取标准

溶液和储备液进样10μl , 测定峰面积。根据标准品的浓度和峰面积可得回归方程:

y =7×10

-5

β宝丰生物有限公司提供。2葡萄糖苷酶由西格玛奥德里奇

(上海) 贸易有限公司提供。槲皮素标准品, 纯度≥99. 0%,

x -0. 0058(2)

由上海康九化工有限公司提供。

1. 2　GBE 的酶解工艺[3]　称取5mg β2葡萄糖苷酶, 用柠檬

r =0. 99(n =5) , 线性范围为0. 01～0. 10mg/m l 。

1. 4　单因素试验　影响酶解工艺效果的因素主要有时间、

酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 值5. 0) 定容至100m l 。然后, 称取一定量的银杏叶提取物, 适量甲醇溶解, 加入缓冲溶液和酶, 置于水浴锅中恒温水解, 将水解液高速离心、过滤后, 沉淀用无水甲醇溶解, 再上旋转蒸发器以除去多余的溶剂,

恒重后用10m l 无水甲醇充分溶解得样液,0. 45μm 滤膜过滤后待测定。

1. 3　总黄酮苷元的测定方法

1. 3. 1　分析条件。色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(15m m ×6. 0m m ,5μm ) ; 柱温:30℃; 流动相:甲醇∶水(0. 5%磷酸) 梯度洗脱; 流速:1m l/m in ; 检测波长:368nm; 进样量:10μl 。1. 3. 2　计算方法。由文献可知, 对照品溶液、换算因子的选

[4]

温度、酶浓度及pH 值等[7]。该试验分别研究了不同因素对

G BE 酶解效率的影响。

1. 5　最佳工艺参数的确定　在单因素试验的基础上, 为了

进一步确定反应的最优条件以及影响因素的主次, 采用正交试验设计方法进行优化[8]。表1为酶解试验正交试验因素水平表。

表1　酶解正交试验因素与水平

T ab le 1　F actors and levels o f orthogonal test for enzymolysis

水平

Level 1

2A (温度) T em perature

B (时间) T im e ∥h 5

6C (pH 值) pH value

45D (酶浓度) Enzym e concentration

m g/m l 0. 0250. 005℃

3040用不同对测定结果的影响较小。同时, 受对照品来源的限制,3种苷元的定量分析都可以用槲皮素标准物的标准工作

2　结果与分析

作者简介　伍毅(1983-) , 女, 四川通江人, 硕士研究生, 研究方向:食品

功能性成分。3通讯作者。

收稿日期　2007208221

2. 1　酶解单因素试验结果

2. 1. 1　酶解时间的选择。图1是固定酶解温度40℃,pH 值

β36卷1期　　　　　　　　　　　　　　　　伍毅等　2葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究31

5. 0, 酶液用量为1m l 即酶浓度为0. 005mg/m l 时, 水解3、4、5、6、7、8h 对酶解效率的影响。从图1可以看出, 当水解时间

素的主次顺序为B >C >A >D 。所以, 优化后的酶解条件为

A 2B 2C 2D 2, 即当温度40℃, 酶浓度5×10-3mg/m l , 在pH 值5

达到6h 时, 水解效率最高; 当水解时间超过6h , 水解基本趋于平衡, 苷元含量不再增加。所以, 选择水解时间为6h

。

的水解液中水解6h , 生成的苷元含量可达到18. 35%

。

图3　pH 值对酶解效率的影响

图1　酶解时间对酶解效率的影响

Fig. 1　E ffects o f enzymolysis tim e on the efficiency o f enzym atic hy 2

drolysis

Fig. 3　E

ffects o f pH value on efficiency

2. 1. 2　酶解温度的选择。图2是固定酶解时间6h ,pH 值5,

酶液用量为1m l 时, 温度对酶解效率的影响。如果温度低于酶的最适温度, 则酶的活力大为降低; 最适温度, 则酶可能变性失活, 图2可以看出, , , 40℃, 降。, 2葡萄糖苷酶的活力下降所致。所以, 40℃

。

图4　酶浓度对酶解效率的影响

Fig. 4　E ffects o f enzym e concentration on enzymolysis efficiency

表2　酶解正交试验结果

T ab le 2　R esu lts o f orthogonal test for enzymolysis

序号N o. 　　1

345678k 1k 2k 3

水平Level

A 　　1

112223312. 5212. 5410. 062. 48

B 　　1

231231210. 8313. 9210. 373. 55

C 　　1

23231319. 8513. 3012. 003. 45

苷元含量

D 　　1　　9. 34

216. 52311. 71313. 45114. 5929. 5829. 72310. 6411. 2511. 9411. 930. 69

图2　酶解温度对酶解效率的影响

Fig. 2　E ffects o f temperature on enzymolysis efficiency

2. 1. 3　pH 值的选择。图3是固定酶解时间6h , 温度为40℃, 酶液用量为1m l 时,pH 值对酶解效率的影响。从图3

可以看出, 苷元含量随着pH 值的增加而不断提高, 并且在

pH 值为5时达到最大值, 此后苷元含量急剧下降, 说明β2葡

萄糖苷酶在pH 值5左右酶解活力最高。所以, 选择水解液的pH 值为5。

2. 1. 4　酶浓度的选择。图4是固定酶解时间6h , 温度为40℃,pH 值5时, 不同酶浓度对酶解效率的影响。从图4可

2. 3　酶解前后银杏叶提取物及其产物的H P LC 图谱分析　

从图5、6可以看出,G BE 经β2葡萄糖苷酶水解后产生了一系列新物质。对比槲皮素标准品的HP LC 图谱(图7) 以及参考文献中的数据[6], 可以初步确定水解后生成了黄酮苷元, 即槲皮素、山奈酚、异鼠李素(保留时间分别为16. 265、17. 929、

18.217m in 的组分) 。此外, 从酶解后的HP LC 图谱可以看

以看出, 苷元含量随着酶浓度的增大而增加, 但是酶浓度达到5×10-3mg/m l 时, 黄酮苷元基本不再增加。这可能是由于在该酶浓度下酶与底物的结合已趋饱和。所以, 采用酶浓度为5×10-3mg/m l 。

2. 2　酶解条件的优化　从表2可以看出, 影响酶解效率因

出, 除了新生成的黄酮苷元外, 银杏叶提取物中的其他活性物质, 如银杏萜内酯、聚异丙烯醇、酚酸类等都部分保留了下来。这可能是由于条件较温和, 酶作用专一。经计算, 酶解

32　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年

产物中苷元纯度为68. 24%, 得率为9. 08%

。

图7　槲皮素标准品的H P LC 图谱

图5　水解前G BE 的H P LC 图谱

Fig. 5　H P LC m apping o f G BE before

hydrolysis

Fig. 7　H P LC m apping o f reference stand ard o f quercetin

酶浓度5×10-3mg/m l ,pH 值5下水解6h 。在该条件下生成的苷元纯度为68. 24%, 得率为9. 08%。酶解后的产物中还保留了大量的其他功能性成分, 留十分有利, 参考文献

[1. [J].海峡医学,2005,17

:35. , A LFTH A N G,et al. Pharam acokinetics o f quercetin

ag lycone and rutin in healthy v olunteers [J].Euro J C linical acology ,2000,56(8) :545-553.

[3]吴超, 苏红利, 张晓鸣. 银杏叶提取物制取黄酮苷元的酶解工艺研究

[J].食品与机械,2005,21(6) :28-35.

[4]杜安全, 王先荣, 周正华. 银杏叶总黄酮苷的HP LC 法分析水解方法

[J].安徽医药,2001,5(3) :164-165.

[5]鞠兴荣, 汪海峰. 银杏叶提取物中黄酮类化合物的高效液相色谱测定

[J].食品科学,2001,22(12) :66-68.

[6]孙震, 刘泽勇, 田永竹. 高效液相色谱法测定银杏叶总黄酮[J].河北林

业科技,2004,8(4) :1-2.

[7]无锡轻工大学, 天津轻工业学院. 食品分析[M].北京:中国轻工业出

版社,1994:79-80.

[8]吴有炜. 实验设计与数据处理[M].苏州:苏州大学出版社,2002:85-100.

图G BE 的H P LC 图谱

Fig. 6　H P LC m apping o f G BE after enzymolysis

3　结论

该试验采用β2葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物, 得到了具有更高生理活性的黄酮苷元。最佳工艺参数为温度40℃

(上接第19页) 粉和麸皮之比、蛋白胨、C aC l 2、NaC l 和吐温80对酶活呈正效应; 而C aC O 3、麦芽糖和FeS O 4・7H 2O 对酶活呈负效应。并且筛选出了对酶活影响较大的因子, 即大麦粉和麸皮之比、

C aC l 2和NaC l 。

　　Y 1=437. 4317+59. 8050A +32. 7450F +33. 50167G 　(1) 式中, A =(大麦/麸皮-1. 25) /0. 25, F =(NaC l 含量-0. 125) /0. 025, G =(C aC l 2含量-0. 125) /0. 025。

回归方差分析结果表明, 所得到的回归方程P 为

0. 020321, 表明该回归模型在被研究的整个回归区域拟合的

参考文献

β[1]A NT O NI P. Bacterial 1,321,422g lucanases :structure , function and protein

eng ineering[J].Biochim ica et Biophysica Acta ,2000,1543:361-382. [2]邹东恢, 江洁. β2葡聚糖酶的开发与应用研究[J].农产品加工,2005,42

(8) :7-9.

[3]孙玉英, 王瑞明, 刘庆军, 等. β2葡聚糖酶高产菌株的分离筛选及其新

菌种初步鉴定[J].酿酒科技,2004(2) :25-27.

[4]诸葛健, 王正祥. 工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业出版

社,1994.

[5]连喜军, 张平平, 罗庆丰. 西藏青稞β2葡聚糖提取研究[J].粮食与油

脂,2006(1) :27-28.

[6]LAZ ARI D O U A , BI LI A DERIS C G . A com parative study on structure 2function

relations o f m ixed 2linkage (1→3) , (1→4) linear β2D 2g lucans[J].F ood H y 2drocolloids ,2004,18:837-855.

[7]刘永举, 王清洁, 王江青, 等. D NS 法测定饲用β2葡聚糖酶活力[J].中国

饲料,1999(18) :26.

[8]孙建义, 李卫芬, 顾赛红, 等. 木霉G X C 产β2葡聚糖酶条件和酶学性质

[J].微生物学学报,2001,41(4) :457-460.

[9]邓卫东, 席冬梅, 毛华明. 吐温80作为新型饲料添加剂对反刍动物瘤

胃生态和生产性能的影响[J].饲料工业,2005,26(10) :7-12. [10]顾赛红, 孙建义, 李卫芬, 等. 里氏木霉(T richoderma r eesei ) 产β2葡聚糖

酶和木聚糖酶的条件研究[J].浙江大学学报, 2003,29(5) :545-549.

较好; 决定系数R 为0. 9782, 表明97. 82%试验数据的变异性可用该模型来解释。

对于其他非显著的影响因子, 在P B 设计的二水平范围之内, 由于蛋白胨和吐温80对酶活呈正效应, 因此取较高值为好, 即蛋白胨30. 0mg/m l 、吐温801. 5mg/m l ; 由于C aC O 3、麦芽糖和FeS O 4・7H 2O 对酶活呈负效应, 则取低水平较好, 即

C aC O 35. 0mg/m l 、麦芽糖5. 0mg/m l 、FeS O 4・7H 2O 0. 2mg/m l 。3　结论

该试验用宇佐美曲霉M 122925摇瓶发酵产β2葡聚糖酶, 通过比较找出对酶活可能影响较大的碳氮源(大麦粉、麸皮、麦芽糖和蛋白胨) 、无机盐((NH 4) 2S O 4和K H 2PO 4) 和金属离子(Fe 2+、C a 2+和Na +) 。在此基础上, 用P B 试验对部分培养基因子进行了评价, 发现在P B 设计的二水平范围之内, 大麦