现代检验医学杂志 第23卷 第2期 2008年3月 JModLabMed,Vol.23,No.2,Mar.2008
83
追加方式是一种有益的尝试,储存在数据库的短信内容可作为临床医生追加申请项目的证据。此外这种短信方式还可解决其它需要临床与检验沟通的问题。
经过多方努力后,目前全院已实现了临床科室与检验科室的联网,我们开发的LIS可以通过网络有效地实现临床与检验的沟通。经过数月试运行后,临床反应良好,主要表现在以下几个方面:检验结果及时,对检测项目了解程度高,标本采集正确率提高,标本流转效率提高,检验结果与临床吻合程度高,临床对检验的满意度提高,医院整体医疗效率提高,由检验引起的医患矛盾减少等,提高了检验在临床诊疗工作中的地位。
参考文献:
[1] 张 渝,王 放,李初民.LIS系统的设计与应用[J].
医疗设备信息,2004,11:70.
[2] 万海英,金骑兵,李 冬,等.适用于我国临床实验室
的条形码标本信息管理系统[J].中华检验医学杂志,2004,8:531-533.
[3] 张 峰,张华欣.检验医学与临床的沟通[J].实用医
技杂志,2004,10:2200.
[4] 顾可梁.加强医学检验与临床的沟通[J].临床检验
杂志,2003,4:246.
[5] 张万胜,陈亚君.检验医疗纠纷的分析及对策[J].实
用医技杂志,2005,8:2082-2084.
[6] 吴均竹,周作华,王元元.检验人员与临床医护人员
沟通的必要性[J].中国误诊学杂志,2005,12:2383-2384.收稿日期:2007-09-30
噬菌体抗体库技术在农兽药快速检测技术中的进展
马巍娜,贾雷立(综述) 刘雪林,宋宏彬(审阅)
(中国人民解放军疾病预防控制所,北京 100039)
X
摘 要:综述了噬菌体抗体库技术及其在农兽药快速检测技术中应用的最新进展,指出以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程技术在农兽药残留快速检测方面有很好的前景。
关键词:抗体;噬菌体抗体库技术;农药;兽药;检测
中图分类号:S854.43 文献标志码:A 文章编号:1671-7414(2008)02-083-02
噬菌体抗体库技术(phageantibodylibrary)是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术,与多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体抗体库技术的筛选范围广、时间周期短、操作简便、规模生产成本低廉。
1 噬菌体抗体库技术 以噬菌体为载体,将抗体基因与噬菌体编码的外壳蛋白Ⅲ(cpm)或Ⅷ(cpV1)相连,在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合蛋白的形成表达。经辅助病毒感染后,借助cpm的信号肽穿膜作用,进入宿主外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾部,随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒。此抗体可以特异性识别抗原,又能够感染宿主菌进行再扩增,将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装成噬菌体抗体的群体,则成为噬菌体抗体库技术。噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项技术的发展:一是PCR技术使人们可以用一组引物克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因;二是成功地采用大肠埃希菌分泌表达具有生物活性的抗体功能片段;三是噬菌体表面展示技术的建立。
噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物,提供了不经免疫制备抗体的可能;DNA操作是在细菌中进行,比杂交瘤技术简单快速,适应于大规模工业化生产,因而使人们随心所欲地制造抗体的愿望成为现实;能够模拟抗体亲和力成熟过程,可通过链置换、PCR错配或随机致突变技术改变抗体亲和力,噬菌体抗体库技术对提高
抗体亲和力具有巨大的潜力。尽管提高抗体亲和力的新技术不断出现,然而如何有效获得高亲和力抗体仍是抗体库研究的核心课题之一,也是基因工程抗体能否应用的关键。因此,噬菌体抗体库技术的研究与应用必将成为研究者的研究重心,成为备受瞩目的焦点。
2 噬菌体抗体库的构建
2.1 噬菌体抗体表达的抗体分子片段 噬菌体可有效地表达Fab段、单链抗体(ScFv)、二硫键固定的Fv段(dsFv)及双链抗体(diabody)等。在表达Fab段时,一般将轻链基因和重链Fc段基因组合在同一个表达载体内,也可以分别将携有轻链基因和重链Fc段基因的表达载体导入到同一个大肠埃希菌细胞内。噬菌体外壳蛋白基因(基因Ⅲ和基因Ⅷ)可以和轻链基因融合,也可以和Fc段基因融合,融合的链固定在细菌内膜上,与分泌到周质腔内的另一条链通过链间二硫键连接起来,最终都可形成有结合性的噬菌体抗体。表达ScFv较表达Fab段有一定的优越性,Sheets等[1]通过重叠延伸剪接法(solid-overlapextensionSOE),用
PCR直接将轻链和重链可变区基因组合在一起构建ScFv,减少一次重组过程,操作较为简便。Bfinkmann等[2]分别在HH和VL的适当位置,通过突变各引入一个半胱氨酸残基,所形成的Fv段由共价键连接VH和VL,比ScFv更为稳定,将一个可变区与基因Ⅲ融合,可在噬菌体表面表达出dsFv。McGuinness等[3]通过将ScFv的接头缩短,使同一分子内的VH和VL难以配对形成Fv段,强迫不同分子的
X基金项目:国家:0209。
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现代检验医学杂志 第23卷 第2期 2008年3月 JModLabMed,Vol.23,No.2,Mar.2008
VH,VL配对,形成由非共价键结合的双价或双特异性小分子抗体diabody。通过与基因Ⅲ的融合,diabody也成功地表达在噬菌体表面。
2.2 抗体基因的扩增 从经抗原接种或被免疫的小鼠脾细胞或人外周血淋巴细胞、脾、扁桃腺、淋巴结组织或骨髓细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得全套抗体可变区基因。抗体基因扩增的5’端引物的设计通常是根据成熟抗体v区外显子的框架1区(FRI)或前导区的保守序列,3’端主要依据抗体绞链区(J区)的保守序列。依据各种抗体基因家族序列而设计一组引物,分别对抗体cDNA扩增后,再将扩增产物予以混合。Larrick等[4]还采用简并引物扩增,以获得引物与模板间的最大互补性。
2.3 抗体基因的克隆噬菌体 抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的,这些载体除含有LacZ启动子、核糖体结合位点、PelB前导序列及供外源基因插入的多克隆位点外,还含有丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因。pComb3和pCANTAB5E是其常用载体。使用这些载体构建抗体基因库时,获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后,克隆进相应酶切位点。所克隆进载体中的重、轻链基因间的配对存在着很大的随机性,因而增加了抗体库的多样性。
2.4 抗体基因的表达 免疫球蛋白分子在体内有膜型和可溶性两种表达方式。噬菌体抗体的抗体分子以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒外膜上,相当于体内B细胞的膜型表达,使我们能在体外模拟体内的抗原对特异性抗体的克隆选择过程。而在完成生物学效应时一般需要可溶性抗体分子,可通过两种方法解决这个问题:一是Lemer等[5]在表达载体中基因Ⅲ或基因Ⅷ的两端设计2个适当的限制性内切酶位点,通过内切酶的消化,除去外壳蛋白的基因,即可得到可溶性抗体分子的表达载体;另一个方法是Hoogenboom等[6]在抗体基因和外壳蛋白基因相接处,设计一个琥珀(amber)密码子(TAG),在含有琥珀抑制子(ambersuppressor)的宿主菌中,TAG可翻译为某种氨基酸而不起终止密码子的作用,抗体融合基因表达为抗体-外壳蛋白融合分子。在无琥珀抑制基因的宿主菌中TAG则成为终止密码子,抗体表达为可溶性蛋白质分子。
2.5 特异性抗体片段的筛选 噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用,展示在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选,同时由于噬菌体对大肠埃希菌的感染性,噬菌体抗体库技术能够以淘选的方式,为快速选择特异性抗体提供了简便而高效的操作系统。包括:¹靶抗原吸附噬菌体抗体;º洗涤去除非特异性结合,收集与抗原结合的噬菌体抗体;»感染大肠埃希菌,使特异的噬菌体抗体扩增富集。经过4轮这样的“吸附-洗脱-扩增”的淘选,可使特异性噬菌体抗体的富集率达1以上,筛选出占库容量仅为1的噬菌体,噬菌体抗体库技术借助这种高效筛选系统,能够方便地对库容量在1以上的抗体进行筛选。Marks等[7]报道了用红细胞筛选抗血型抗原的抗体。Hoogenboom等[8]则将复合抗原经SDS-PAGE分离后用蛋白质印迹(western-blotting)从噬菌体抗体库中获得富集
效果。除此之外,也有用组织器官淘选等方式进行筛选的报
道,为噬菌体抗体的淘选增添了新的途径。
3 噬菌体抗体库筛选技术在农兽药快速检测技术中的应
用 近年来噬菌体抗体库技术已在生物学医学研究和疾病诊断方面取得了长足的发展。但是,该技术目前还处于基础研究和不断完善的阶段,其在许多方面的应用,如在农药和兽药快速检测方面的应用还有待深入开展。
Kramer等[9]应用基因工程方法成功地制备了针对除草剂Triazine的单链抗体,间接竞争ELISA检测结果表明,所获得的单链抗体对Triazine有较高的特异性和亲和力,IC50值可达15.6ng/ml,最低检测限(LOD)可达5.2ng/ml。Kramer等在进行抗体文库的构建之前,通过免疫磁性细胞分离技术(immunomagneticseparation,IMS)使针对半抗原的B细胞含量显著增加,提高了文库中针对半抗原的抗体基因的比例,有利于“半抗原基因”的优先克隆。该方法利用B细胞表达的半抗原特异性表面免疫球蛋白(surfaceimmunoglobulin,sIg)和包被在磁性微粒上的Tri-azine衍生物的特异结合,在磁场作用下实现Triazine特异性B细胞和载体特异性B细胞的分离,然后通过IMS技术分离获得的B细胞,并以它作为抗体基因的来源进行噬菌体文库的构建,从而降低了文库构建和筛选的难度。
4 展望 基因工程抗体的研究已使抗体制备技术进入了一个全新的时代,尤其是噬菌体抗体库技术的建立,使得可以不经过免疫,利用抗原直接从库中筛选特异性抗体成为可能,使抗体的制备变得简单易行,稳定有效,使人源抗体的制备有了突破,这是抗体工程领域的重大进展。这极大地推动了各种性能优良抗体及多功能抗体融合蛋白的开发和应用。随着分子生物学、分子免疫学的发展及噬菌体抗体库技术的成熟,人们可以根据需要改造和制备各种人和动物用抗体。可以预见,一个随意定向地制造抗体的时代即将到来,届时噬菌体抗体库筛选技术在农兽药快速检测方面将会发挥更大的作用。
参考文献:
[1] SheetsM,Amersdorfer,FinnermR,etal.[J].Proc
NatlAcadSci,1998,95(11):6157-6162.
[2] BfinkmannU,DChowdhury,etal.[J].JImmunol
Methods,1995,182:4150.
[3] McGuinnessBT,GWalter,etal.[J].NatBiotech-no1,1996,14:1149.
[4] LarrickJW.Acompositionmethodsinenzymology
[J].Methods,1990,2(2):106.
[5] BarbasCF,LemerRA.Acompositionmethodsin
Enzymology[J].Methods,1991,2:119.
[6] HoogenboomHR,GritlithsAD,SmithHE,etal.
Multi-subunitproteinsonthesurfacesoffilamen-tousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchains[J].NuclAcidsRes,1991,19:4133.
[7] MarksJO,OuwehandWH,etal[J].BioTechnolo-gy,1993,11:l145.
[8] HoogenboomHR,BruineAP,FendlyB,etal[J].Im-munotechnology,1998,4:120.
[9] KramerK.Synthesisofagroup-selectiveantibodyli-braryagainsthaptens[J].JImmunolMethods,2002,266(1-2):209-220.收稿日期:2007-07-17
现代检验医学杂志 第23卷 第2期 2008年3月 JModLabMed,Vol.23,No.2,Mar.2008
83
追加方式是一种有益的尝试,储存在数据库的短信内容可作为临床医生追加申请项目的证据。此外这种短信方式还可解决其它需要临床与检验沟通的问题。
经过多方努力后,目前全院已实现了临床科室与检验科室的联网,我们开发的LIS可以通过网络有效地实现临床与检验的沟通。经过数月试运行后,临床反应良好,主要表现在以下几个方面:检验结果及时,对检测项目了解程度高,标本采集正确率提高,标本流转效率提高,检验结果与临床吻合程度高,临床对检验的满意度提高,医院整体医疗效率提高,由检验引起的医患矛盾减少等,提高了检验在临床诊疗工作中的地位。
参考文献:
[1] 张 渝,王 放,李初民.LIS系统的设计与应用[J].
医疗设备信息,2004,11:70.
[2] 万海英,金骑兵,李 冬,等.适用于我国临床实验室
的条形码标本信息管理系统[J].中华检验医学杂志,2004,8:531-533.
[3] 张 峰,张华欣.检验医学与临床的沟通[J].实用医
技杂志,2004,10:2200.
[4] 顾可梁.加强医学检验与临床的沟通[J].临床检验
杂志,2003,4:246.
[5] 张万胜,陈亚君.检验医疗纠纷的分析及对策[J].实
用医技杂志,2005,8:2082-2084.
[6] 吴均竹,周作华,王元元.检验人员与临床医护人员
沟通的必要性[J].中国误诊学杂志,2005,12:2383-2384.收稿日期:2007-09-30
噬菌体抗体库技术在农兽药快速检测技术中的进展
马巍娜,贾雷立(综述) 刘雪林,宋宏彬(审阅)
(中国人民解放军疾病预防控制所,北京 100039)
X
摘 要:综述了噬菌体抗体库技术及其在农兽药快速检测技术中应用的最新进展,指出以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程技术在农兽药残留快速检测方面有很好的前景。
关键词:抗体;噬菌体抗体库技术;农药;兽药;检测
中图分类号:S854.43 文献标志码:A 文章编号:1671-7414(2008)02-083-02
噬菌体抗体库技术(phageantibodylibrary)是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术,与多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体抗体库技术的筛选范围广、时间周期短、操作简便、规模生产成本低廉。
1 噬菌体抗体库技术 以噬菌体为载体,将抗体基因与噬菌体编码的外壳蛋白Ⅲ(cpm)或Ⅷ(cpV1)相连,在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合蛋白的形成表达。经辅助病毒感染后,借助cpm的信号肽穿膜作用,进入宿主外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾部,随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒。此抗体可以特异性识别抗原,又能够感染宿主菌进行再扩增,将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装成噬菌体抗体的群体,则成为噬菌体抗体库技术。噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项技术的发展:一是PCR技术使人们可以用一组引物克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因;二是成功地采用大肠埃希菌分泌表达具有生物活性的抗体功能片段;三是噬菌体表面展示技术的建立。
噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物,提供了不经免疫制备抗体的可能;DNA操作是在细菌中进行,比杂交瘤技术简单快速,适应于大规模工业化生产,因而使人们随心所欲地制造抗体的愿望成为现实;能够模拟抗体亲和力成熟过程,可通过链置换、PCR错配或随机致突变技术改变抗体亲和力,噬菌体抗体库技术对提高
抗体亲和力具有巨大的潜力。尽管提高抗体亲和力的新技术不断出现,然而如何有效获得高亲和力抗体仍是抗体库研究的核心课题之一,也是基因工程抗体能否应用的关键。因此,噬菌体抗体库技术的研究与应用必将成为研究者的研究重心,成为备受瞩目的焦点。
2 噬菌体抗体库的构建
2.1 噬菌体抗体表达的抗体分子片段 噬菌体可有效地表达Fab段、单链抗体(ScFv)、二硫键固定的Fv段(dsFv)及双链抗体(diabody)等。在表达Fab段时,一般将轻链基因和重链Fc段基因组合在同一个表达载体内,也可以分别将携有轻链基因和重链Fc段基因的表达载体导入到同一个大肠埃希菌细胞内。噬菌体外壳蛋白基因(基因Ⅲ和基因Ⅷ)可以和轻链基因融合,也可以和Fc段基因融合,融合的链固定在细菌内膜上,与分泌到周质腔内的另一条链通过链间二硫键连接起来,最终都可形成有结合性的噬菌体抗体。表达ScFv较表达Fab段有一定的优越性,Sheets等[1]通过重叠延伸剪接法(solid-overlapextensionSOE),用
PCR直接将轻链和重链可变区基因组合在一起构建ScFv,减少一次重组过程,操作较为简便。Bfinkmann等[2]分别在HH和VL的适当位置,通过突变各引入一个半胱氨酸残基,所形成的Fv段由共价键连接VH和VL,比ScFv更为稳定,将一个可变区与基因Ⅲ融合,可在噬菌体表面表达出dsFv。McGuinness等[3]通过将ScFv的接头缩短,使同一分子内的VH和VL难以配对形成Fv段,强迫不同分子的
X基金项目:国家:0209。
:(,,el:
84
现代检验医学杂志 第23卷 第2期 2008年3月 JModLabMed,Vol.23,No.2,Mar.2008
VH,VL配对,形成由非共价键结合的双价或双特异性小分子抗体diabody。通过与基因Ⅲ的融合,diabody也成功地表达在噬菌体表面。
2.2 抗体基因的扩增 从经抗原接种或被免疫的小鼠脾细胞或人外周血淋巴细胞、脾、扁桃腺、淋巴结组织或骨髓细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得全套抗体可变区基因。抗体基因扩增的5’端引物的设计通常是根据成熟抗体v区外显子的框架1区(FRI)或前导区的保守序列,3’端主要依据抗体绞链区(J区)的保守序列。依据各种抗体基因家族序列而设计一组引物,分别对抗体cDNA扩增后,再将扩增产物予以混合。Larrick等[4]还采用简并引物扩增,以获得引物与模板间的最大互补性。
2.3 抗体基因的克隆噬菌体 抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的,这些载体除含有LacZ启动子、核糖体结合位点、PelB前导序列及供外源基因插入的多克隆位点外,还含有丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因。pComb3和pCANTAB5E是其常用载体。使用这些载体构建抗体基因库时,获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后,克隆进相应酶切位点。所克隆进载体中的重、轻链基因间的配对存在着很大的随机性,因而增加了抗体库的多样性。
2.4 抗体基因的表达 免疫球蛋白分子在体内有膜型和可溶性两种表达方式。噬菌体抗体的抗体分子以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒外膜上,相当于体内B细胞的膜型表达,使我们能在体外模拟体内的抗原对特异性抗体的克隆选择过程。而在完成生物学效应时一般需要可溶性抗体分子,可通过两种方法解决这个问题:一是Lemer等[5]在表达载体中基因Ⅲ或基因Ⅷ的两端设计2个适当的限制性内切酶位点,通过内切酶的消化,除去外壳蛋白的基因,即可得到可溶性抗体分子的表达载体;另一个方法是Hoogenboom等[6]在抗体基因和外壳蛋白基因相接处,设计一个琥珀(amber)密码子(TAG),在含有琥珀抑制子(ambersuppressor)的宿主菌中,TAG可翻译为某种氨基酸而不起终止密码子的作用,抗体融合基因表达为抗体-外壳蛋白融合分子。在无琥珀抑制基因的宿主菌中TAG则成为终止密码子,抗体表达为可溶性蛋白质分子。
2.5 特异性抗体片段的筛选 噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用,展示在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选,同时由于噬菌体对大肠埃希菌的感染性,噬菌体抗体库技术能够以淘选的方式,为快速选择特异性抗体提供了简便而高效的操作系统。包括:¹靶抗原吸附噬菌体抗体;º洗涤去除非特异性结合,收集与抗原结合的噬菌体抗体;»感染大肠埃希菌,使特异的噬菌体抗体扩增富集。经过4轮这样的“吸附-洗脱-扩增”的淘选,可使特异性噬菌体抗体的富集率达1以上,筛选出占库容量仅为1的噬菌体,噬菌体抗体库技术借助这种高效筛选系统,能够方便地对库容量在1以上的抗体进行筛选。Marks等[7]报道了用红细胞筛选抗血型抗原的抗体。Hoogenboom等[8]则将复合抗原经SDS-PAGE分离后用蛋白质印迹(western-blotting)从噬菌体抗体库中获得富集
效果。除此之外,也有用组织器官淘选等方式进行筛选的报
道,为噬菌体抗体的淘选增添了新的途径。
3 噬菌体抗体库筛选技术在农兽药快速检测技术中的应
用 近年来噬菌体抗体库技术已在生物学医学研究和疾病诊断方面取得了长足的发展。但是,该技术目前还处于基础研究和不断完善的阶段,其在许多方面的应用,如在农药和兽药快速检测方面的应用还有待深入开展。
Kramer等[9]应用基因工程方法成功地制备了针对除草剂Triazine的单链抗体,间接竞争ELISA检测结果表明,所获得的单链抗体对Triazine有较高的特异性和亲和力,IC50值可达15.6ng/ml,最低检测限(LOD)可达5.2ng/ml。Kramer等在进行抗体文库的构建之前,通过免疫磁性细胞分离技术(immunomagneticseparation,IMS)使针对半抗原的B细胞含量显著增加,提高了文库中针对半抗原的抗体基因的比例,有利于“半抗原基因”的优先克隆。该方法利用B细胞表达的半抗原特异性表面免疫球蛋白(surfaceimmunoglobulin,sIg)和包被在磁性微粒上的Tri-azine衍生物的特异结合,在磁场作用下实现Triazine特异性B细胞和载体特异性B细胞的分离,然后通过IMS技术分离获得的B细胞,并以它作为抗体基因的来源进行噬菌体文库的构建,从而降低了文库构建和筛选的难度。
4 展望 基因工程抗体的研究已使抗体制备技术进入了一个全新的时代,尤其是噬菌体抗体库技术的建立,使得可以不经过免疫,利用抗原直接从库中筛选特异性抗体成为可能,使抗体的制备变得简单易行,稳定有效,使人源抗体的制备有了突破,这是抗体工程领域的重大进展。这极大地推动了各种性能优良抗体及多功能抗体融合蛋白的开发和应用。随着分子生物学、分子免疫学的发展及噬菌体抗体库技术的成熟,人们可以根据需要改造和制备各种人和动物用抗体。可以预见,一个随意定向地制造抗体的时代即将到来,届时噬菌体抗体库筛选技术在农兽药快速检测方面将会发挥更大的作用。
参考文献:
[1] SheetsM,Amersdorfer,FinnermR,etal.[J].Proc
NatlAcadSci,1998,95(11):6157-6162.
[2] BfinkmannU,DChowdhury,etal.[J].JImmunol
Methods,1995,182:4150.
[3] McGuinnessBT,GWalter,etal.[J].NatBiotech-no1,1996,14:1149.
[4] LarrickJW.Acompositionmethodsinenzymology
[J].Methods,1990,2(2):106.
[5] BarbasCF,LemerRA.Acompositionmethodsin
Enzymology[J].Methods,1991,2:119.
[6] HoogenboomHR,GritlithsAD,SmithHE,etal.
Multi-subunitproteinsonthesurfacesoffilamen-tousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchains[J].NuclAcidsRes,1991,19:4133.
[7] MarksJO,OuwehandWH,etal[J].BioTechnolo-gy,1993,11:l145.
[8] HoogenboomHR,BruineAP,FendlyB,etal[J].Im-munotechnology,1998,4:120.
[9] KramerK.Synthesisofagroup-selectiveantibodyli-braryagainsthaptens[J].JImmunolMethods,2002,266(1-2):209-220.收稿日期:2007-07-17