燕 山 大 学
本科毕业设计（论文）开题报告
课题名称：
月日
一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:
1. 国内外研究现状
DNA 分子水平多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams 和Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性DNA 片段用作分子标记，并将此技术命名为RAPD （randomamplifidpolysnorphicDNA ），即随机扩增多态性DNA 。尽管RAPD 技术诞生的时间不长，但由于其丰富的DNA 多态性及快速、简便等特点，使它成为目前植物育种研究工作采用最多的手段[2]。
随机扩增多态性DNA （RandomAmplifiedPolymorphicDNA ），是以PCR 为基础，以随机的短核苷酸序列为引物，以实验材料基因组DNA 为模板，进行PCR 反应，找出扩增片段的多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此需单独对每一随机引物进行PCR ，如果引物结合部位的核苷酸序列发生了变化，或者扩增范围内碱基出现插入或缺失，DNA 重排，就会导致原来结合位点的消失或产生新的结合位点，或者使扩增片段的长度发生改变，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB 染色就检测出基因组所发生的变化。[1-4]
与其他分子标记技术相比，RAPD 具有以下优越性：RAPD 所用引物为随机引物，一套引物可用于不同植物基因组分析，且不需预先知道待扩增基因的核苷酸顺序，试验费用较低。RAPD 技术的多态性位点是无限的，灵敏度高，能够检测出品种间的微小差异。RAPD 实验中所需DNA 样品量少，纯度要求不高，实验过程中一般不需要进行South －ern 转移、分子杂交等一系列繁琐的程序，可一次检测大量样品。同时，RAPD 不需要使用同位素，减少了对工作人员的危害。RAPD 产物，经过克隆和序列分析后，可作为RFLP 和原位杂交的探针，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。
但RAPD 分子标记技术也存在着一些缺点，一是标记大多是显性标记，二是实验稳定性一般。但许多研究表明，这些缺点是可以克服的。通过在实验中对RAPD 技术体系进行优化，严格控制试验条件，并进行重复试验即可得到理想的结果。[7,8]
2. 选题依据及意义
此毕业设计的课题为《皮皮虾RAPD 分子标记的多态性初步研究》，主要是对皮皮虾组织总DNA 进行离提取，运用RAPD 分子标记的方法检测其多态性并进行初步研究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳提取与标记条件，并对其不同器官组织的多态性以及相同时期不同组织的多态性
进行初步研究，同时得出最佳提取与标记方案。本设计利用目前广泛应用的RAPD 分子标记检测DNA 多态性的方法，利用随机引物（一般为8—10bp ）通过PCR 反应非定点扩增DNA 片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA 片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA 多态性。同一组织的分子标记揭示来自DNA 的变异，随着分子生物学技术的发展，对皮皮虾的遗传育种、基因组作图、基因定位、亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面具有重大意义。
二、研究的基本内容，拟解决的主要问题
1. 皮皮虾组织中总DNA 的提取条件的进一步优化；
2. 通过分子标记，计算秦皇岛皮皮虾的基因分布特征；
3. 皮皮虾不同组织基因组特定区域DNA 的多态性分析。
三、研究步骤、方法及措施
1. 实验材料
1.1皮皮虾
1.2主要试剂
RAPD 引物：百盛（SBS ）公司设计的RAPD 引物
Taq 酶
10xPCR 缓冲液
MgCl 2：25mmol/L
dNTP ：2.5mmol/L
2. 实验方法
2.1从微量组织中提取总DNA
2.1.1取一小块冰冻的组织（少于1mg ，可用经消毒的枪头钻取），或1～3 根带有毛根的毛发（需先经 90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入500μl 5％的Chelex 溶液。
2.1.2将样品管在56℃下放置1 小时或更长时间，直至组织样品成粉末状（不同组织所需时间各不相同）。
2.1.3在振荡器上振荡10～15 秒钟。
2.1.4在 95～100℃下煮 15～40 分钟。
2.1.5在振荡器上振荡10～15 秒钟。
2.1.6将样品管在4℃下保存，进行PCR 反应之前再次离心，使Chelex 颗粒
沉淀。取上清液（1～10μl）作为DNA 模板。
2.2RAPD 分子标记
2.2.1在15ul 反应体系中，加入模板DNA 1ul (30-50ng)；RAPD 引物 1ul (约5pmol) ；10xPCR Buffer 1.5ul；MgCl 2 1ul；dNTP 1ul；Taq 酶 0.5单位（U ）；加ddH 2O 至 15ul ；混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
2.2.2在PCR 仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。
2.2.3循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
2.2.4在15ul PCR 产物中加2ul 上样缓冲液(6x ) 于1.6% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V 。
2.2.5电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
2.2.6用凝胶成像仪观察、拍照。
四、研究工作进度
1-3周 查阅相关文献资料，设计试验方案，写开题报告，任务书和
文献综述；
4-8周 配制试剂、从微量组织中提取总DNA ；
9-14周 RAPD 分子标记，观察DNA 片段长度，分析其多态性； 15-16周 分析结果；撰写毕业论文；
17周 论文评阅、答辩。
五、主要参考文献
[1] 刘晓宇. RAPD分子标记技术概述及应用. 应用技术, 2010, 11(9): 57-59.
[2] Toshiharu Hashizume, Ikuhiro Shimoto, Yoshiaki Harushi-ma, etal. Constructionflanatusmapforwatermelon(Citrul-lus Matsum)using random amplified polymorph: cDNA(RAPD) [J]. Euphytica, 1996, 90: 265-273.
[3] 陈亮, 王平盛, 山口聪. 应用RAPD 分子标记鉴定野生茶树种质资源研究[J] . 中国农业科学, 2002, 10:23-27.
[4] 任瑞文, 卢强, 徐晓立. 提高RAPD 稳定性的几点经验与探讨[J]. 生物技术. 2001, 02: 7-10.
[5] 韩斌, 张林丰. 现代生物化工中酶工程技术研究与应用. 北京农业, 2008, (33): 37-39.
[6] 王伟继; 孔杰; 董世瑞; 栾生; 王清印. 中国明对虾AFLP 分子标记遗传连锁图谱的构
建[J].动物学报. 2006, 03: 465-470.
[7] 宋铭晶, 张知彬, 徐来祥. 动物种群遗传多态性研究中的PCR 技术[J]. 动物学杂志. 2003, 01: 293-296.
[8] 李联泰, 安贤惠. 几种海水经济贝类DNA 提取方法探讨[J]. 淮海工学院学报(自然科学版). 2005, 04: 264-267.
[9] 张宁, 王凤山. DNA提取方法进展[J]. 中国海洋药物. 2004, 02: 591-594.
[10] Rai SK ,Mukheljee AK. Development of an Efficient Method for Extracting Total DNA of Intestinal Microflora[J]. Animal Husbandry and Feed Science. 2011, 03: 55-59.
[11] 陈子桂, 容丽, 宋微波. 海洋尾丝虫(Uronema marinum) 的DNA 微量提取研究[J]. 动
物学报. 2001, S1: 7574-7575.
[12] 王明森, 王洪光, 黄倢. 水产动物病毒性疾病样品的采集和检测[J]. 动物医学进展.
2009, 08: 710-715.
[13] T.W. Vahlenkamp, H.K. Enbergs, H. MuÈllerExperimental and natural borna
disease virus infections: presence of viral RNA in cells of the peripheral
blood .Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2000, 5 (2): 112-116.
[14] 李睿, 鲁志松, 乔琰, 姚汉超, 于非非, 杨旭. 甲醛对DNA 损伤的彗星实验研究[J],
实验生物学报, 2004, 04: :1399-1400.
[15] 王春琳, 叶选怡, 丁爱侠, 母昌考. 虾蛄繁殖生物学与繁育技术研究[J]. 海洋湖沼通
报. 2002, 03(5): 3-4.
[16]叶惠忠, 陈道才, 徐水祥. 虾蛄蛋白浆的制备及营养价值分析[J]. 浙江省医学科学院
学报. 2006, 01(2): 151.
六、导师意见
七、审核意见：
审查结果： 1
、通过；指导教师（签字） 年 月 日 、完善后通过； 3、未通过 负责人（签字）： 年 月 日 2
燕 山 大 学
本科毕业设计（论文）开题报告
课题名称：
月日
一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:
1. 国内外研究现状
DNA 分子水平多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams 和Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性DNA 片段用作分子标记，并将此技术命名为RAPD （randomamplifidpolysnorphicDNA ），即随机扩增多态性DNA 。尽管RAPD 技术诞生的时间不长，但由于其丰富的DNA 多态性及快速、简便等特点，使它成为目前植物育种研究工作采用最多的手段[2]。
随机扩增多态性DNA （RandomAmplifiedPolymorphicDNA ），是以PCR 为基础，以随机的短核苷酸序列为引物，以实验材料基因组DNA 为模板，进行PCR 反应，找出扩增片段的多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此需单独对每一随机引物进行PCR ，如果引物结合部位的核苷酸序列发生了变化，或者扩增范围内碱基出现插入或缺失，DNA 重排，就会导致原来结合位点的消失或产生新的结合位点，或者使扩增片段的长度发生改变，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB 染色就检测出基因组所发生的变化。[1-4]
与其他分子标记技术相比，RAPD 具有以下优越性：RAPD 所用引物为随机引物，一套引物可用于不同植物基因组分析，且不需预先知道待扩增基因的核苷酸顺序，试验费用较低。RAPD 技术的多态性位点是无限的，灵敏度高，能够检测出品种间的微小差异。RAPD 实验中所需DNA 样品量少，纯度要求不高，实验过程中一般不需要进行South －ern 转移、分子杂交等一系列繁琐的程序，可一次检测大量样品。同时，RAPD 不需要使用同位素，减少了对工作人员的危害。RAPD 产物，经过克隆和序列分析后，可作为RFLP 和原位杂交的探针，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。
但RAPD 分子标记技术也存在着一些缺点，一是标记大多是显性标记，二是实验稳定性一般。但许多研究表明，这些缺点是可以克服的。通过在实验中对RAPD 技术体系进行优化，严格控制试验条件，并进行重复试验即可得到理想的结果。[7,8]
2. 选题依据及意义
此毕业设计的课题为《皮皮虾RAPD 分子标记的多态性初步研究》，主要是对皮皮虾组织总DNA 进行离提取，运用RAPD 分子标记的方法检测其多态性并进行初步研究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳提取与标记条件，并对其不同器官组织的多态性以及相同时期不同组织的多态性
进行初步研究，同时得出最佳提取与标记方案。本设计利用目前广泛应用的RAPD 分子标记检测DNA 多态性的方法，利用随机引物（一般为8—10bp ）通过PCR 反应非定点扩增DNA 片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA 片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA 多态性。同一组织的分子标记揭示来自DNA 的变异，随着分子生物学技术的发展，对皮皮虾的遗传育种、基因组作图、基因定位、亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面具有重大意义。
二、研究的基本内容，拟解决的主要问题
1. 皮皮虾组织中总DNA 的提取条件的进一步优化；
2. 通过分子标记，计算秦皇岛皮皮虾的基因分布特征；
3. 皮皮虾不同组织基因组特定区域DNA 的多态性分析。
三、研究步骤、方法及措施
1. 实验材料
1.1皮皮虾
1.2主要试剂
RAPD 引物：百盛（SBS ）公司设计的RAPD 引物
Taq 酶
10xPCR 缓冲液
MgCl 2：25mmol/L
dNTP ：2.5mmol/L
2. 实验方法
2.1从微量组织中提取总DNA
2.1.1取一小块冰冻的组织（少于1mg ，可用经消毒的枪头钻取），或1～3 根带有毛根的毛发（需先经 90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入500μl 5％的Chelex 溶液。
2.1.2将样品管在56℃下放置1 小时或更长时间，直至组织样品成粉末状（不同组织所需时间各不相同）。
2.1.3在振荡器上振荡10～15 秒钟。
2.1.4在 95～100℃下煮 15～40 分钟。
2.1.5在振荡器上振荡10～15 秒钟。
2.1.6将样品管在4℃下保存，进行PCR 反应之前再次离心，使Chelex 颗粒
沉淀。取上清液（1～10μl）作为DNA 模板。
2.2RAPD 分子标记
2.2.1在15ul 反应体系中，加入模板DNA 1ul (30-50ng)；RAPD 引物 1ul (约5pmol) ；10xPCR Buffer 1.5ul；MgCl 2 1ul；dNTP 1ul；Taq 酶 0.5单位（U ）；加ddH 2O 至 15ul ；混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
2.2.2在PCR 仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。
2.2.3循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
2.2.4在15ul PCR 产物中加2ul 上样缓冲液(6x ) 于1.6% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V 。
2.2.5电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
2.2.6用凝胶成像仪观察、拍照。
四、研究工作进度
1-3周 查阅相关文献资料，设计试验方案，写开题报告，任务书和
文献综述；
4-8周 配制试剂、从微量组织中提取总DNA ；
9-14周 RAPD 分子标记，观察DNA 片段长度，分析其多态性； 15-16周 分析结果；撰写毕业论文；
17周 论文评阅、答辩。
五、主要参考文献
[1] 刘晓宇. RAPD分子标记技术概述及应用. 应用技术, 2010, 11(9): 57-59.
[2] Toshiharu Hashizume, Ikuhiro Shimoto, Yoshiaki Harushi-ma, etal. Constructionflanatusmapforwatermelon(Citrul-lus Matsum)using random amplified polymorph: cDNA(RAPD) [J]. Euphytica, 1996, 90: 265-273.
[3] 陈亮, 王平盛, 山口聪. 应用RAPD 分子标记鉴定野生茶树种质资源研究[J] . 中国农业科学, 2002, 10:23-27.
[4] 任瑞文, 卢强, 徐晓立. 提高RAPD 稳定性的几点经验与探讨[J]. 生物技术. 2001, 02: 7-10.
[5] 韩斌, 张林丰. 现代生物化工中酶工程技术研究与应用. 北京农业, 2008, (33): 37-39.
[6] 王伟继; 孔杰; 董世瑞; 栾生; 王清印. 中国明对虾AFLP 分子标记遗传连锁图谱的构
建[J].动物学报. 2006, 03: 465-470.
[7] 宋铭晶, 张知彬, 徐来祥. 动物种群遗传多态性研究中的PCR 技术[J]. 动物学杂志. 2003, 01: 293-296.
[8] 李联泰, 安贤惠. 几种海水经济贝类DNA 提取方法探讨[J]. 淮海工学院学报(自然科学版). 2005, 04: 264-267.
[9] 张宁, 王凤山. DNA提取方法进展[J]. 中国海洋药物. 2004, 02: 591-594.
[10] Rai SK ,Mukheljee AK. Development of an Efficient Method for Extracting Total DNA of Intestinal Microflora[J]. Animal Husbandry and Feed Science. 2011, 03: 55-59.
[11] 陈子桂, 容丽, 宋微波. 海洋尾丝虫(Uronema marinum) 的DNA 微量提取研究[J]. 动
物学报. 2001, S1: 7574-7575.
[12] 王明森, 王洪光, 黄倢. 水产动物病毒性疾病样品的采集和检测[J]. 动物医学进展.
2009, 08: 710-715.
[13] T.W. Vahlenkamp, H.K. Enbergs, H. MuÈllerExperimental and natural borna
disease virus infections: presence of viral RNA in cells of the peripheral
blood .Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2000, 5 (2): 112-116.
[14] 李睿, 鲁志松, 乔琰, 姚汉超, 于非非, 杨旭. 甲醛对DNA 损伤的彗星实验研究[J],
实验生物学报, 2004, 04: :1399-1400.
[15] 王春琳, 叶选怡, 丁爱侠, 母昌考. 虾蛄繁殖生物学与繁育技术研究[J]. 海洋湖沼通
报. 2002, 03(5): 3-4.
[16]叶惠忠, 陈道才, 徐水祥. 虾蛄蛋白浆的制备及营养价值分析[J]. 浙江省医学科学院
学报. 2006, 01(2): 151.
六、导师意见
七、审核意见：
审查结果： 1
、通过；指导教师（签字） 年 月 日 、完善后通过； 3、未通过 负责人（签字）： 年 月 日 2