氨基酸直接分析法原理及应用
牟世芬丁永胜
（中国科学院生态环境研完中心，Ｄｉｏｎｅｘ中国公司应用研宄中心北京１０００８５）
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摘要表文介龆一种新型氨基畦分析方法——离干交换色谱一彳只分脉冲安培法（ｆｔＰＩＣ－ＩＰＡＤ）。详细讨论方法的
雅理和应用。谜方法与传兢方法比较．无须进行拄后或柱前舒生反应，对氨基畦可以直接进行分析＋曼敏度高，大多数氨基政的置小检测依均小于１ｐｍｏｌ，线性范圈可以达到３个数量握以上。
关■调氨基畦；离于交换色谱一积分脉冲安培法
中宙分类号Ｘ１３．１３２
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Ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄｓ；ＨＰｌｏＩＰＡＤ
１前言
较为经典的氨基酸分析方法是阳离子交换分离，
柱后衍生反应，紫外分光或荧光检测【１Ｊ。常用的衍生试剂有茚三酮（Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）和邻苯二甲醛（ＯＰＡ）。此外还有柱前衍生．反相分离，衍生试剂有ＡＱＣ（６．
ａｍｌｎｏｑｕｉｎｏｌｙｌ－Ｎ—ｈｙｄｒｏｘｙ—ｓｕｅｅｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｃａｒｂａｍａｔｅ
２方法原理
２．１阴离子交换分离
迄今为止，自然界中已发现１８０多种氦基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有２０多种，称为基本氨基酸。这些氨基酸的基本结构通式如下：
Ｈ
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这些方法的缺点是操作复杂和影响因素多，如柱后衍
ＮＨＪ
生需要柱后衍生反应的附加装置和衍生试剂；柱前衍
生虽然克服了柱后衍生的～些缺点。但存在氨基酸衍生物的不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身干扰等
缺点ｉ２Ｊ。本文将讨论的美国Ｄｉｏｎｅｘ公司新近推出的
氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这也是氨基酸分离分析方法的基础。氨基酸直接分析用疏水性薄壳型阴离子交换树脂为固定相，碱性溶液为流动相，阴离子交换分离，积分脉冲安培
法直接检测。流动相由水、氢氧化钠和醋酸钠溶液组
成。
氨基酸直接分析方法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测．无需将待测氨基酸转变成可被检测化
合物的衍生反应。
收稿日期：２００１一０４—１６
作者俺卉：牟世棼，女，中国科学院生态歼境研究中心研究员．博士生导师，主要从事离子色谱应用基础研究。
２４
ＭｏｄｅｍＳｃ／ｅｎｆｉｆｌｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
２００Ｉ２
其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子ＯＨ一，而且碱性ｐＨ条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ａｃ一）对固定相的亲和力大于ＯＨ一．它对于极性较
小，保留较强的氨基酸起“推”的作用。表ｌ列出了分
析氨基酸的典型梯度淋洗条件【３Ｊ。图１为常见氨基酸混合标准溶液的色谱图ｕＪ。
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图１常见氨基酸混台标准溶液的色谱图
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水解产物中氨基酸分析的典型梯度淋洗条件
往：Ｅｌ＝纯水，ｂ＝０．２５ＭＮａＯＨ．Ｅ３＝１０ＭＮａＡｃ
２．２脉；中积分安培检测
在高ｐＨ溶液中，含有脂肪氪基（一ＮＨ２）的化合物可在金电极上被氧化，因此可用电化学法检测，然而由于金电极吸附待测成分的氧化产物以及金电极表
面形成氧化层，金电极会很快失效。为了解决这一问题。发展的电化学检测醇类和含氨基化合物的脉冲电
化学检测器，由三个不同的脉冲电位代替直流安培检测器中的加于工作电极上的恒定电位。较工作电位高的正电位用来除去金电极上被测成分的氧化产物。由于金电极本身会部分被氧化成氧化金。再加一个大
的负电位，使氧化金还原到还原状态。该脉冲每０．５
—１秒循环一次。Ｐｏｌｔａ等【４】首次报道了氨基酸的脉
现代科学仪器２００１
２
冲电化学检测。在金电极上得到氨基的最大氧化电
流所需的电位超过金表面氧化的电位，金电极表面氧化所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基
线的不稳定性。为了增加氮基氧化时所产生的检测
信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，１９８９年
Ｊｏｈｎｓｏｎ等人＿５１引入了一种新的技术——积分脉冲安
培。与脉冲安培相似，积分脉冲安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不是恒定的。而是在高．低值之间扫描。在高电位时，氨基和金的氧化同时发生。在高电位时所形成的氧化金在低电位时
被还原。因为在低电位时金的氧化是可逆的，而氨基
的氧化是不可逆的，因而来自金电极氧化的信号被大大抵消，由积分整个高一低循环的电流所得到的信号仅仅是被分析成分的信号。
检测氨基酸和氨基糖的积分安培波形与早期的波形相似，但首先用负电位作为清洗电位，这样可较
好地保持电极的清洁和活性，不会引起电极和信号的
损失。在前述的脉冲安培法中，首先用高的电位为清
洗电位，金电极的过量氧化会导致检测响应值的逐渐降低。经过对检测氨基酸和氮基糖的施加电位波形
的优化克服了基线漂移，改进了线性、信噪比和长时
间的重复性，而且不损坏金工作电极。新的波形如图
２所示，由六步组成，分为三个区。Ｅ．和Ｅ２为吸附／引
发区；Ｅ３和Ｂ为电流积分区；Ｅ５和ｋ为清洗／活化
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图２测定氟基酸的积分安培电位波形图
区。吸附步骤的施加电位Ｅ，一般为负电位，其大小和持续时间影响吸附氨基酸的灵敏度，导致吸附氨基
酸和非吸附氨基酸的响应因子的扩大，影响碱性氨基
酸的线性范围。因此必须控制Ｅｌ的持续时间，一般小于４０ｍｓ。Ｅ２是提供一个可以开始积分而氧又不会被还原的电位。开始积分之前在Ｅ２的延迟时间允许充电电流减弱。短的延迟时间大大减小由于醋酸钠梯度所引起的色谱基线改变以及不同氨基酸响应因子的差距，Ｅ２的推荐时间为６０ｍｓ。为了得到最高灵敏度，Ｅ２亦应为负电位（一０．０５Ｖ），使金电极完全还
２５
原，同时氨基酸的吸附在较低的速度下继续进行。开始积分时．第一积分电位Ｂ上升到足以氧化氨基酸和电极表面教氧化的正电位，一般应大于０．２０Ｖ，最佳值在０．２５～０．３０Ｖ之间。受金电极氧化的限制，
矗不宜太高．否则背景和噪音将增加。在第二积分
电位Ｅ４，积分电位由ｂ降到Ｅ。（积分开始前的电
垃）．此时氧化金的还原电荷将抵消金氧化的电荷，氧
化金的还原比氧化快。因此为了完成背景补偿（校
正），电位Ｅ。（～０．０５Ｖ）的时间不必像电位Ｅ３那样
长，总的积分时间约为４５０ｍｓ（Ｅ，为２９０ｍｓ，Ｅ４为１４０ｍｓ）。在积分完毕后，立即将电位降至清洗电位Ｅ，（一２Ｖ），对电极进行清洗，避免电极被过度氧化侵
蚀。然后迅速升高电位至活化电位ｋ（＋０．６Ｖ），再立
即回到初始电位Ｅ．，从而完成一次积分周期。高电
位时电极上形成的金氧化物在低电位时被还原，而氨
基的氧化反应是不可逆。因此，金电极自身的氧化反
应产生的信号被极大抵消，总的信号值决定于高低电
位之间的电流积分值。
３应用
样品的前处理方法在氨基酸分析中具有重要的地位。由于能够直接用于分析的样品有限，样品中的氮基酸大多以蛋白质，多肽的形式存在，需要进行前
处理，包括样品的提取，纯化和水解。表３列出了常用的４种水解方法№Ｊ，这些方法处理的拌品都能用美国Ｄｉｏｎｅｘ公司的Ａｄ～Ａ－直接氨基酸分析系统分析。
衰３氯基酸样品分析的水鼻方法
方｛盅
适甩范匮
最常用的术懈方法
端搿…咪ｉｉ孺纛１黧５．：＝：
酸的扭失
过甲赜氧化／６ＭＨＣＩ
甩于测定吉矗氟基艘．如半肚甄傲和肮氯瞳
：，甲苎璺髓中１１０。术解２２小时
’
。
。
一…。
色氟酸测定的首选方法，可以直接与ＡＡＡ．Ｄｉ．
４…．２Ｍ
Ｎａ时Ｏ…Ｉｏ℃术簸谳燃纛
条件温和．可用于测定色氨蘸
是ｔ度的强制。
美国Ｄｉｏｎｅｘ公司发展的氨基酸直接分析方法的
色谱条件如下：
分离柱：ＡｍｉｎｏＰａｃＰＡｌ０和ＰＧｌ０
淋洗液：ＥＩ＝纯水，Ｅ２＝２５０ｍＭＮａＯＨ，Ｅ３＝１．０
ＭＮａＡｃ
流速：０．２５ｍＬ／ｒａｉｎ
２６
进样体积：ｌＯ“Ｌ温度：３０℃
检测方式：积分脉冲安培检测器（ＩＰＡＤ），Ａｇ／Ａｇ—ｃｌ参比电极。金工作电极。
Ｄｉｏｎｅｘ公司的ＡＡＡ一直接氨基酸分析仪为ＰＥＥＫ全塑系统，该公司专门研制的用于分析氨基酸的高效
阴离子交换柱ＡｍｉｎｏＰａｃＰＡｌ０在ｐＨ０～１４及有机溶
剂中稳定。
此方法已广泛用于蛋白质和肽的水解产物，食品
和饮料等样品中氨基酸的分析。Ａｌａｎ
Ｐ
Ｃｔａｒｋｅ等
人【７’对２０多种基本氨基酸和胶原蛋白，胎球蛋白的水解物进行分离测定．并且与经典的茚三酮光度检测法进行比较，结果无显著差异。见表４。ＰｅｔｒＪａｎｄｉｋ等人１８０对细胞培养基与发酵内汤中氨基酸，部分糖类化台物进行了分析监测。特别要提到的是，这种方法简化了色氨酸等的检测．因为用ＨＣＩ水解样品时，色氪酸会分解，而用ＮａＯＨ水解时，由于柱前或柱后衍生反应的需要，必须经中和后方可进行衍生反应和进样
分析，而用Ｄｉｏｎｅｘ的直接分析方法，用ＮａＯＨ水解后
可直接进样。另外该法还可以一次进样同时分析氦
基酸，氨基糖和碳水化合物。
表４用积分脉冲安培法和茚兰酮光度法测定
肢原蛋白中矗基酸结果的比较
参考文献
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Ｍｏｄｅｒａ
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ｈｉｇｈ—ｐｅＨｏｒｍａｎｃｅｆｉｑｔｒｄ
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Ｄｉ衄“Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｔｅｃｈｉｎｃａｌ［７］Ａｌｍ
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ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍ∞Ｄｅｒｏｍｅｔｒｙ
［３］Ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ
ｒｅｃｔ
ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓａｎｄＴｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＡＡＡ．Ｄｉ．
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ｓｕｇａｒｓ
ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ，Ｄｏｃｕｍｅ∞ｌｔＮｏ．０３１４８１；Ｄｉｏｎｅｘｆｃ４Ｌｏｗｉｎｇ
ａｎｉｏｎ—ｅｘｃｈａｎｇｅ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｎａｌ
ａｍｉｎｏａｃＭｓ∞ｄ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ２０呻．２５～２７
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Ｐｏｈａ，Ｊ．Ａ；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｄｉｒｅｃｔａｌｅｆｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄ虬ｅｎ∞ｎｏｆ
Ｃｈｅｍ．１９９９．７１：２７７４～２７８ｌ
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Ｐｅｔｒ
Ｊａｎｄｉｋ．ＡｌａｎＰ
Ｃｌａｒｋｅ，Ａｎａｌｙｚｉｎｇｍｉｘｔｕｒｅｓｏｆ
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ｃａｒｂｏｈｙ出☆ｔ８∞％ｂｉ—ｍＤ削ｉｎｔｅｉｇｒａｔｅｄ
Ｃｈｒｏｍａｍｇｒ．Ｂ１９９９．７３２：１９３～２０１
ａｍｐｅｒｃ０＊ｅｔｒＪｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ。Ｊ．
Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
１９８３，６；１７２７～１７４３
表面等离子体子共振技术及其在生命科学中的应用
牟颖１・２
张寒琦２
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长春１３００２３）
（１吉林大学分子酶学Ｉ程教育部重点实验室，２吉林大学化学糸
Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｈｊｉｎ＠ｐｕｈｔｉｃ
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摘要简述了表面芋离子休子共振（ＳＰＲ）技术的基末原理并综述了ＳＰＲ技术在生命科学领域的应用。ＳＰＲ
技术可以在原位实时监剥生物分子间的相互作用而无需任何标记．因而可用于许多成赍相互间作用的研兜，也可用
于连续监洲吸附和解吸及分子的缔鲁和解离过程。ＳＰＲ技术在免疫分析、蛋白盾分子相互作用、ＤＮＡ的复制和转录以及药特的筛选等生命科学许多领域的应用研究巳取得了很大进展，具有许多常规技术堆以比拟的优越性。
关键词表面等离子体子共菲；生物分于相互作用；生命科学中图分类号０６５２．２
ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍａＲｅｓｏｎａｎｃｅａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ
ＭｕＹｉｎ９１一．ＺｈａｎｇＨａｎｑｉ２，ＪｉｒｔＯＪｎｈａｎ２
（１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌＫｕｌａｒＥⅡｙｒｎｏｌｏｇｙａｎｄＥｔａｇｉｎｅｅｆｉｎＥ．Ｍｉｎｉｓｔｒｙ。ｆ
２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｉｌ／ｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
１３００２３．ＰＲ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ
Ｃｈｉｎａ）
ｉｔｓａｐｐｉｉｃａ—
Ｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｓｕｒｆａｃｅｐｌａｙ－＇ｈａｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）ｉｓｂｒｉｅｆｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄ
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ｔｉｏｎＩｎ１ｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｉＳｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ
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ｂｅｍｏｎｉｔｏｒｅｄｗｉｔｈＳＰＲｉｎｒｅａｌｔｉｍｅａｎｄｉｎｓｉｔｕ，
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ｗｉｔｈｏｕｔｕｓｉｎｇａｎｙｌａｂｅｌｓ．Ｉｔ
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ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ∞ｗｅｌｌ
ｓｃｉｅｎｃｅ，ｓｕｃｈ
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ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＳＰＲｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｌｌｆｅ
ｉｍｍｕｎｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ
ｇｒｅａｔｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ，ｓｈｏｗｉｎｇ
ｉＴｔｏｒｅ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｈａｖｅｍａｄｅ
ａｄｖａｎｔａｇｅｓｔｈａｎｔｈｅｒｏｕｔｉｎｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ
Ｓｕｔｒａｃｅｐｌａｓｍａｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ；ｌｌｆｅｓｃｉｅｎｃｅ
生命科学在２１世纪将仍然是自然科学的前沿领域。众所周知，生物分子间相互作用的研究是研究生
收稿日期：２０００—０９—３０
基盒资叻：本项目得到国家自然科学基叠的资助．基金批准号：２９８７５０１０
命现象发生的基础，因为弄清生物分子之间的相互作
用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。
作者简介：牟籁（１９６９年生），女，吉林省长春人，吉林大学生命科学院剐教授１９９９年吉林大学博士后出站。主要研究方向为生物化学与分子生物学．博士后期间从事生物传感器研究。
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２
现代科学仪器２００１
氨基酸直接分析法原理及应用
作者：作者单位：
牟世芬， 丁永胜
中国科学院生态环境研究中心,Dionex中国公司应用研究中心(北京)
1. 安蓉 生命科学分析的一个新发展-Waters CapLCTM毛细管液相色谱系统与CapLCTM/MS联用系统[会议论文]-20012. 刘继锋.曹卫东.汪尔康 电化学检测微全分析系统[会议论文]-2001
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7. 陈卫伟.钱爱萍.颜孙安.林香信.张晓峰.Chen Weiwei.Qian Aiping.Yan Sunan.Lin Xiangxin.Zhang Xiaofeng 氨基酸分析仪测量水产饲料中赖氨酸的不确定度评定[期刊论文]-中国农学通报2007,23(11)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_3106489.aspx
氨基酸直接分析法原理及应用
牟世芬丁永胜
（中国科学院生态环境研完中心，Ｄｉｏｎｅｘ中国公司应用研宄中心北京１０００８５）
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ａｃ
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关■调氨基畦；离于交换色谱一积分脉冲安培法
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１０００８５，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
｛ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰ№ｓｅａｒｅｈＣｅｎｔｅｒｏｆＤｉ∞ｅｘＣｈｍａｃｏ．Ｌｔｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８５．ＰＲＣｈｉｎａ）
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Ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄｓ；ＨＰｌｏＩＰＡＤ
１前言
较为经典的氨基酸分析方法是阳离子交换分离，
柱后衍生反应，紫外分光或荧光检测【１Ｊ。常用的衍生试剂有茚三酮（Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）和邻苯二甲醛（ＯＰＡ）。此外还有柱前衍生．反相分离，衍生试剂有ＡＱＣ（６．
ａｍｌｎｏｑｕｉｎｏｌｙｌ－Ｎ—ｈｙｄｒｏｘｙ—ｓｕｅｅｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｃａｒｂａｍａｔｅ
２方法原理
２．１阴离子交换分离
迄今为止，自然界中已发现１８０多种氦基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有２０多种，称为基本氨基酸。这些氨基酸的基本结构通式如下：
Ｈ
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ＦＭＯＣ（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｅｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ），Ｄａｂｓｙｌ（４．ｄｉ．
ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－ａｚｏｈｅｒｗ．ｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ），Ｄａｎｓｙｌ等。
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这些方法的缺点是操作复杂和影响因素多，如柱后衍
ＮＨＪ
生需要柱后衍生反应的附加装置和衍生试剂；柱前衍
生虽然克服了柱后衍生的～些缺点。但存在氨基酸衍生物的不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身干扰等
缺点ｉ２Ｊ。本文将讨论的美国Ｄｉｏｎｅｘ公司新近推出的
氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这也是氨基酸分离分析方法的基础。氨基酸直接分析用疏水性薄壳型阴离子交换树脂为固定相，碱性溶液为流动相，阴离子交换分离，积分脉冲安培
法直接检测。流动相由水、氢氧化钠和醋酸钠溶液组
成。
氨基酸直接分析方法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测．无需将待测氨基酸转变成可被检测化
合物的衍生反应。
收稿日期：２００１一０４—１６
作者俺卉：牟世棼，女，中国科学院生态歼境研究中心研究员．博士生导师，主要从事离子色谱应用基础研究。
２４
ＭｏｄｅｍＳｃ／ｅｎｆｉｆｌｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
２００Ｉ２
其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子ＯＨ一，而且碱性ｐＨ条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ａｃ一）对固定相的亲和力大于ＯＨ一．它对于极性较
小，保留较强的氨基酸起“推”的作用。表ｌ列出了分
析氨基酸的典型梯度淋洗条件【３Ｊ。图１为常见氨基酸混合标准溶液的色谱图ｕＪ。
Ｐｅａｋｓ
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图１常见氨基酸混台标准溶液的色谱图
寰１
水解产物中氨基酸分析的典型梯度淋洗条件
往：Ｅｌ＝纯水，ｂ＝０．２５ＭＮａＯＨ．Ｅ３＝１０ＭＮａＡｃ
２．２脉；中积分安培检测
在高ｐＨ溶液中，含有脂肪氪基（一ＮＨ２）的化合物可在金电极上被氧化，因此可用电化学法检测，然而由于金电极吸附待测成分的氧化产物以及金电极表
面形成氧化层，金电极会很快失效。为了解决这一问题。发展的电化学检测醇类和含氨基化合物的脉冲电
化学检测器，由三个不同的脉冲电位代替直流安培检测器中的加于工作电极上的恒定电位。较工作电位高的正电位用来除去金电极上被测成分的氧化产物。由于金电极本身会部分被氧化成氧化金。再加一个大
的负电位，使氧化金还原到还原状态。该脉冲每０．５
—１秒循环一次。Ｐｏｌｔａ等【４】首次报道了氨基酸的脉
现代科学仪器２００１
２
冲电化学检测。在金电极上得到氨基的最大氧化电
流所需的电位超过金表面氧化的电位，金电极表面氧化所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基
线的不稳定性。为了增加氮基氧化时所产生的检测
信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，１９８９年
Ｊｏｈｎｓｏｎ等人＿５１引入了一种新的技术——积分脉冲安
培。与脉冲安培相似，积分脉冲安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不是恒定的。而是在高．低值之间扫描。在高电位时，氨基和金的氧化同时发生。在高电位时所形成的氧化金在低电位时
被还原。因为在低电位时金的氧化是可逆的，而氨基
的氧化是不可逆的，因而来自金电极氧化的信号被大大抵消，由积分整个高一低循环的电流所得到的信号仅仅是被分析成分的信号。
检测氨基酸和氨基糖的积分安培波形与早期的波形相似，但首先用负电位作为清洗电位，这样可较
好地保持电极的清洁和活性，不会引起电极和信号的
损失。在前述的脉冲安培法中，首先用高的电位为清
洗电位，金电极的过量氧化会导致检测响应值的逐渐降低。经过对检测氨基酸和氮基糖的施加电位波形
的优化克服了基线漂移，改进了线性、信噪比和长时
间的重复性，而且不损坏金工作电极。新的波形如图
２所示，由六步组成，分为三个区。Ｅ．和Ｅ２为吸附／引
发区；Ｅ３和Ｂ为电流积分区；Ｅ５和ｋ为清洗／活化
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图２测定氟基酸的积分安培电位波形图
区。吸附步骤的施加电位Ｅ，一般为负电位，其大小和持续时间影响吸附氨基酸的灵敏度，导致吸附氨基
酸和非吸附氨基酸的响应因子的扩大，影响碱性氨基
酸的线性范围。因此必须控制Ｅｌ的持续时间，一般小于４０ｍｓ。Ｅ２是提供一个可以开始积分而氧又不会被还原的电位。开始积分之前在Ｅ２的延迟时间允许充电电流减弱。短的延迟时间大大减小由于醋酸钠梯度所引起的色谱基线改变以及不同氨基酸响应因子的差距，Ｅ２的推荐时间为６０ｍｓ。为了得到最高灵敏度，Ｅ２亦应为负电位（一０．０５Ｖ），使金电极完全还
２５
原，同时氨基酸的吸附在较低的速度下继续进行。开始积分时．第一积分电位Ｂ上升到足以氧化氨基酸和电极表面教氧化的正电位，一般应大于０．２０Ｖ，最佳值在０．２５～０．３０Ｖ之间。受金电极氧化的限制，
矗不宜太高．否则背景和噪音将增加。在第二积分
电位Ｅ４，积分电位由ｂ降到Ｅ。（积分开始前的电
垃）．此时氧化金的还原电荷将抵消金氧化的电荷，氧
化金的还原比氧化快。因此为了完成背景补偿（校
正），电位Ｅ。（～０．０５Ｖ）的时间不必像电位Ｅ３那样
长，总的积分时间约为４５０ｍｓ（Ｅ，为２９０ｍｓ，Ｅ４为１４０ｍｓ）。在积分完毕后，立即将电位降至清洗电位Ｅ，（一２Ｖ），对电极进行清洗，避免电极被过度氧化侵
蚀。然后迅速升高电位至活化电位ｋ（＋０．６Ｖ），再立
即回到初始电位Ｅ．，从而完成一次积分周期。高电
位时电极上形成的金氧化物在低电位时被还原，而氨
基的氧化反应是不可逆。因此，金电极自身的氧化反
应产生的信号被极大抵消，总的信号值决定于高低电
位之间的电流积分值。
３应用
样品的前处理方法在氨基酸分析中具有重要的地位。由于能够直接用于分析的样品有限，样品中的氮基酸大多以蛋白质，多肽的形式存在，需要进行前
处理，包括样品的提取，纯化和水解。表３列出了常用的４种水解方法№Ｊ，这些方法处理的拌品都能用美国Ｄｉｏｎｅｘ公司的Ａｄ～Ａ－直接氨基酸分析系统分析。
衰３氯基酸样品分析的水鼻方法
方｛盅
适甩范匮
最常用的术懈方法
端搿…咪ｉｉ孺纛１黧５．：＝：
酸的扭失
过甲赜氧化／６ＭＨＣＩ
甩于测定吉矗氟基艘．如半肚甄傲和肮氯瞳
：，甲苎璺髓中１１０。术解２２小时
’
。
。
一…。
色氟酸测定的首选方法，可以直接与ＡＡＡ．Ｄｉ．
４…．２Ｍ
Ｎａ时Ｏ…Ｉｏ℃术簸谳燃纛
条件温和．可用于测定色氨蘸
是ｔ度的强制。
美国Ｄｉｏｎｅｘ公司发展的氨基酸直接分析方法的
色谱条件如下：
分离柱：ＡｍｉｎｏＰａｃＰＡｌ０和ＰＧｌ０
淋洗液：ＥＩ＝纯水，Ｅ２＝２５０ｍＭＮａＯＨ，Ｅ３＝１．０
ＭＮａＡｃ
流速：０．２５ｍＬ／ｒａｉｎ
２６
进样体积：ｌＯ“Ｌ温度：３０℃
检测方式：积分脉冲安培检测器（ＩＰＡＤ），Ａｇ／Ａｇ—ｃｌ参比电极。金工作电极。
Ｄｉｏｎｅｘ公司的ＡＡＡ一直接氨基酸分析仪为ＰＥＥＫ全塑系统，该公司专门研制的用于分析氨基酸的高效
阴离子交换柱ＡｍｉｎｏＰａｃＰＡｌ０在ｐＨ０～１４及有机溶
剂中稳定。
此方法已广泛用于蛋白质和肽的水解产物，食品
和饮料等样品中氨基酸的分析。Ａｌａｎ
Ｐ
Ｃｔａｒｋｅ等
人【７’对２０多种基本氨基酸和胶原蛋白，胎球蛋白的水解物进行分离测定．并且与经典的茚三酮光度检测法进行比较，结果无显著差异。见表４。ＰｅｔｒＪａｎｄｉｋ等人１８０对细胞培养基与发酵内汤中氨基酸，部分糖类化台物进行了分析监测。特别要提到的是，这种方法简化了色氨酸等的检测．因为用ＨＣＩ水解样品时，色氪酸会分解，而用ＮａＯＨ水解时，由于柱前或柱后衍生反应的需要，必须经中和后方可进行衍生反应和进样
分析，而用Ｄｉｏｎｅｘ的直接分析方法，用ＮａＯＨ水解后
可直接进样。另外该法还可以一次进样同时分析氦
基酸，氨基糖和碳水化合物。
表４用积分脉冲安培法和茚兰酮光度法测定
肢原蛋白中矗基酸结果的比较
参考文献
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ｒｅｃｔ
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ｓｕｇａｒｓ
ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ，Ｄｏｃｕｍｅ∞ｌｔＮｏ．０３１４８１；Ｄｉｏｎｅｘｆｃ４Ｌｏｗｉｎｇ
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ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｎａｌ
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Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ２０呻．２５～２７
Ｈｊ
Ｐｏｈａ，Ｊ．Ａ；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｄｉｒｅｃｔａｌｅｆｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄ虬ｅｎ∞ｎｏｆ
Ｃｈｅｍ．１９９９．７１：２７７４～２７８ｌ
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Ｊａｎｄｉｋ．ＡｌａｎＰ
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Ｃｈｒｏｍａｍｇｒ．Ｂ１９９９．７３２：１９３～２０１
ａｍｐｅｒｃ０＊ｅｔｒＪｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ。Ｊ．
Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
１９８３，６；１７２７～１７４３
表面等离子体子共振技术及其在生命科学中的应用
牟颖１・２
张寒琦２
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长春１３００２３）
（１吉林大学分子酶学Ｉ程教育部重点实验室，２吉林大学化学糸
Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｈｊｉｎ＠ｐｕｈｔｉｃ
ｃｃ
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摘要简述了表面芋离子休子共振（ＳＰＲ）技术的基末原理并综述了ＳＰＲ技术在生命科学领域的应用。ＳＰＲ
技术可以在原位实时监剥生物分子间的相互作用而无需任何标记．因而可用于许多成赍相互间作用的研兜，也可用
于连续监洲吸附和解吸及分子的缔鲁和解离过程。ＳＰＲ技术在免疫分析、蛋白盾分子相互作用、ＤＮＡ的复制和转录以及药特的筛选等生命科学许多领域的应用研究巳取得了很大进展，具有许多常规技术堆以比拟的优越性。
关键词表面等离子体子共菲；生物分于相互作用；生命科学中图分类号０６５２．２
ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍａＲｅｓｏｎａｎｃｅａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ
ＭｕＹｉｎ９１一．ＺｈａｎｇＨａｎｑｉ２，ＪｉｒｔＯＪｎｈａｎ２
（１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌＫｕｌａｒＥⅡｙｒｎｏｌｏｇｙａｎｄＥｔａｇｉｎｅｅｆｉｎＥ．Ｍｉｎｉｓｔｒｙ。ｆ
２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｉｌ／ｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
１３００２３．ＰＲ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ
Ｃｈｉｎａ）
ｉｔｓａｐｐｉｉｃａ—
Ｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｓｕｒｆａｃｅｐｌａｙ－＇ｈａｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）ｉｓｂｒｉｅｆｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄ
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ｔｉｏｎＩｎ１ｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｉＳｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｔｏ
ｉｎｔｅｒａｅｉｉｏｎ
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ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ∞ｗｅｌｌ
ｓｃｉｅｎｃｅ，ｓｕｃｈ
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ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＳＰＲｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｌｌｆｅ
ｉｍｍｕｎｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ
ｇｒｅａｔｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ，ｓｈｏｗｉｎｇ
ｉＴｔｏｒｅ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｈａｖｅｍａｄｅ
ａｄｖａｎｔａｇｅｓｔｈａｎｔｈｅｒｏｕｔｉｎｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ
Ｓｕｔｒａｃｅｐｌａｓｍａｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ；ｌｌｆｅｓｃｉｅｎｃｅ
生命科学在２１世纪将仍然是自然科学的前沿领域。众所周知，生物分子间相互作用的研究是研究生
收稿日期：２０００—０９—３０
基盒资叻：本项目得到国家自然科学基叠的资助．基金批准号：２９８７５０１０
命现象发生的基础，因为弄清生物分子之间的相互作
用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。
作者简介：牟籁（１９６９年生），女，吉林省长春人，吉林大学生命科学院剐教授１９９９年吉林大学博士后出站。主要研究方向为生物化学与分子生物学．博士后期间从事生物传感器研究。
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２
现代科学仪器２００１
氨基酸直接分析法原理及应用
作者：作者单位：
牟世芬， 丁永胜
中国科学院生态环境研究中心,Dionex中国公司应用研究中心(北京)
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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_3106489.aspx