蛇志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳＮＡＫＥ（Ｓｃｉｅｎｃｅ＆ＮＡｔｕｒｅ
ｆｕｒｔｈｅｒｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔ
ａｒｅ
ＫＥｙ
ｔｏ
ｈｅａｌｔｈ）２０１０年第２２卷第２期Ｖ０１．２２
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ２００８，４１（４）１３３１—３３８．
ｕｓｅ
Ｎｏ．２。２０１０
Ｉ／ＣＸＣＲ４
ａｘｉｓＩｉｎｎａｔｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙｏｒｃｈｅｓ－
ｄａｔａ［刀．ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌ．
ｔｒａｔ∞ｔｈｅｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ
ＥＪ３．ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，２０１０，３８（４）ｚ３２１—３３２．
［９］ＣａｌａｎｄｒａＧ，ＭｃＣａｒｔｙＪ，ＭｃＧｕｉｒｋＪ，ｅｔａ１．ＡＭＤ３１００ｐｌｕｓＧＣｓＰ
ｃａｎ
［１０］Ｄｅｖｉｎｅ
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Ｍ，ＶｉｉＲｔＲｅｔｔｉｇＭ・ｅｔａＬＲａｐｉｄｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃ－
ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ
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ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｍｏｂｉｌｉｚｅＣＤ３４＋ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｎｏｎ—Ｈｏｄｇｋｉｎ＇ａｌｙｌｎ－
ＡＭＤ３１００。ａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｔｏｆｔｈｅＣＸＣＲ４／ＳＤＦ－１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ．２００８。１１２（４）１９９０－９９８．
ｐｈｏｍａ．Ｈｏｄｇｋｉｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｉｅｍｙｅｌｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓｐｒｅｖｉ－ｏｕｓｌｙｆａｉｌｉｎｇｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ
ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ
ａｎｄ／ｏｒｅｙｔｏｋｉｎｅ
ａ一银环蛇毒素和ｐ银环蛇毒紊的研究进展
邵敏贞ｈ２，郑
研究所，云南昆明
颖２”，叶锋平２，范泉水扣。
６５０２０１１２．成都军区疾病预防控制中心军事医学
６５０１１８）
（１．云南农业大学动物科学技术学院．云南昆明
６５００３２１３．中国协和医科大学医学生物学研究所，云南昆明
［关键调］银环蛇毒素・ａ一银环蛇毒索・｝银环蛇毒素［中圈分类号］Ｒ５９５．８［文献标识码］
Ａ［文章编号］１００１－－５６３９（２０１０）０２－－０１３２－－０５
银环蛇属动物界，脊索动物门，爬虫纲，有鳞目，眼镜蛇科．环蛇属。全身背面是黑白相问的环纹，具３０～５０个白色或乳黄色窄横纹。是世界十大毒蛇之一．属前沟牙类毒蛇，其一次排毒４．６
ｎａｇ，１
的Ｃ末端尾巴从致密的二硫键核心伸出．４对二硫键与结构稳定性有关，大部分集中在中间大环上且分布于环的一侧，形成一个活性表面．铲ＢＧＴ不存在ａ螺旋．主要由｝折叠和｝转角组成．长链和短链的蛇毒突触后神经毒索主要区别在于尾巴表面存有不同的识别位点［‘１。在一级结构上的差别是长链蛇神经毒素比短链的蛇神经毒素多１０～１５个氨基酸和一对二硫键．空间结构上的差别在于长链神经毒素的第５对二硫键存在于中央大环ｌｏｏｐｌｌ的顶部，产生一个循环螺旋样的动态的构象，使得长链神经毒素适应不同受体亚型．具有三指形结构的蛇神经毒紊一般由６０～８０个氨基酸残基组成一条多肽链．氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性．长链和短链的蛇毒突触后神经毒素都属于这类结构，三指型毒紊折叠的可塑性已经历了最佳的进化，可利用功能基团的不同组合特异性识别ｎＡＣｈＲ亚型间的细微
差别［力．
ｍｇ千毒就能致人于死地．毒腺分泌
的蛇毒含多种多肽成分，具有不同的生物学活性［１】．随着捕食者和被捕者的相互作用．毒素随之进化．功能性的生理活性发生相应的变化【｜］．银环蛇毒素的主要成分为蛋白质和多肽，包括廿银环蛇毒紊（ａ－ＢＧＴ）、ｐ银环蛇毒素（争ＢＧＴ）、静银环蛇毒素（争ＢＧＴ）、７－银环蛇毒素（７．ＢＧＴ）和磷脂酶Ａ等酶类［３１．Ｑｉａｎ等ｃ‘］报道了银环蛇毒素中还存在心脏毒素（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）和一些心脏毒素样碱性蛋白（ＣＬＢＰｓ）以及神经毒素类似物（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＢＭＮＴＬｌ一４）．
１
ａ－ＢＧＴ和｝ＢＧＴ的结构
根据神经毒素的作用靶点不同，把银环蛇神经毒素分为
两类ｔ一类为突触后神经毒素或ａ－神经毒素，这类毒素竞争性的与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合。阻断神经递质的传导，另一类为突触前神经毒素或争神经毒素，其直接作用于运动神经突触前膜，阻断乙酰胆碱的释放，使骨骼肌失去收缩功能而麻痹．根据相对的分子质量大小和二硫键的数目把突触后神经毒素又分为短链神经毒素（６０＇－－－，６２个氨基酸残基．４对二硫键）和长链神经毒素（７０～７４个氨基酸残基，５对二硫键）［”．其中短链神经毒素的阻断作用具有一定的可逆性．
１．１十ＢＧＴ十ＢＧＴ是１９６３年发现的．是一种碱性多肽，含较多的碱性氨基酸和ｌｏ个半胱氮酸残基，半胱氨酸残基都参与５对二硫键的形成．属于长链突触后神经毒素，由７４个氨基酸组成，相对分子质量为８０００Ｄ，空间结构复杂，几乎每一个氮基酸对空间结构的形成发挥着重要作用．
ａ－ＢＧＴ结构如三指形，４个二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心仲展出３个肽链环仿佛３个手指，长
乙酰胆碱受体种类很多．十ＢＧＴ是与Ｎ一型的乙酰胆碱受体结合，其结合是专一性的．饱和的和不可逆性的，具很高的亲和力．乙酰胆碱受体ａ２ｐ帕的｝亚基是结合乙酰胆碱和毒素的亚基．关键氨基酸位于１２５＂一１４７残基之间．
１．２
ｐＢＧＴ由Ｃｈａｎｇ于１９６３年在台湾银环蛇中发现．为
突触前碱性多肽神经毒索．由Ａ链和Ｂ链两条链构成，其分子量为２０～２２ｋＤ，等电点为８．８＂－－９．７．Ａ链通过Ｃｙｓ１５和Ｂ链的Ｃｙｓ５５相连。把２条链连接起来．Ａ链含１２０个氨基酸，有１３个半胱氨酸，分子量为１３５００Ｄ，一级结构类似于蛇毒和哺乳动物胰腺中的磷脂酶凡（ＰＬＡ，），但活性比较弱．
Ｈｉｓ４８．Ａｓｐ
９９和Ｔｙｒ５２的侧链互相影响形成一个氢键中
心，组成活性中心区域，处于活性中心的氨基酸是相当保守的．Ｂ链由６０个氨基酸组成，分子量为７０００Ｄ．与胰蛋白酶抑制剂、毒素Ｉ及树眼镜蛇毒素具有序列同源性Ｃｓ－ｌｏ］．其中树眼镜蛇毒素分离自非洲的曼巴蛇，选择性地阻断神经元的
・・通讯作者１３２
万方数据
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ｈｅａｌｔｈ）
２０１０年第２２卷第２期Ｖ０１．２２
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电压门控钾通道［１１］．Ｃｈｅｎ等［１幻研究ｐ。－ＢＧＴ的免疫化学性质时，通过定量沉淀反应和研究Ｆａｂ片段组成的可溶性复合物的分子量分析发现岛一ＢＧＴＡ链．Ｂ链的抗原决定簇的数目分别为５和２．其制备了２３个单克隆抗体。其中７个能抑制ＰＬＡ。７０％的活性．中和毒素的毒性．免疫印迹显示，６个单克隆抗体识别连续的表位．Ａ链的序列３１－３７，４６—５１。９１－
９８。１００－１０６是可以被中和的表位．２银环蛇毒素的毒理作用
神经毒素是银环蛇毒的主要成分．被银环蛇咬伤．中毒症状为伤口轻微疼痛．肢体感觉异常，嗜睡。运动神经失调，眼睑下垂。吞咽困难。乏力，一旦呼吸衰竭，易造成死亡．
２．１
ａ－ＢＧＴ的毒理作用ａ－ＢＧＴ与运动终板乙酰胆碱受体
结合，从而抑制了乙酰胆碱对横纹肌细胞膜的除极化作用．导致神经传导阻断，引起横纹肌松弛．ａ－ＢＧＴ并不影响神经末梢乙酰胆碱的释放．２．２争ＢＯＴ的毒理作用
ｐ－ＢＧＴ作用于运动神经突触前膜
产生一种三相变化，首先是传出递质数量的迅速降低．其次是释放增加，随后是进一步抑制，从而阻断突触间神经冲动传递．使骨骼肌不能兴奋收缩而转入持续性麻痹，其毒性比突触后毒素高得多口钉．
争ＢＧＴ主要作用于神经系统．在外周神经系统中不可逆地阻断神经肌肉的兴奋传递。在中枢神经系统中特异地抑制某些神经元突触前膜递质的释放．其毒性作用依赖于ＰＬ如活性，Ａ链的Ｌｙｓ６４与ＰＬＡ２活性和争ＢＧＴ其他毒性有关［１“．当亚基问二硫键断裂，或ＰＬＡ。活性中心被共价修饰时．都可导致ｐ－ＢＧＴ的神经毒性丧失［１５】．
ＰＬＡｚ活性具有间接溶血作用，在Ｃａ２＋存在下能水解卵磷脂（专一水解ｃ－２酯键），生成能溶解红细胞的溶血卵磷脂及脂肪酸。两者促进突触囊泡和突触前膜的融合。在膜表面暴露出突触囊泡蛋白的内部表位．诱导突触囊泡分泌到胞外。伴随着细胞外的大量钙离子流向神经末梢．这两者还使神经末梢的突出囊泡储存库消失［１盯．用谷胱甘肽还原链问二硫键可提高ｐ－ＢＯＴ的膜破坏活性［１”．Ｂ链识别特定靶细胞膜，阻断电压门控钾通道。但也需要Ａ链的相互作用及钙离子的参与［ｎ】．但Ｃｈｅｎｇ等发现Ｂ链引起人类神经节ＳＫ－Ｎ－ＳＨ细胞凋亡，这种细胞毒性与Ａ链的ＰＬＡ。活性没有多大关系［１’１．Ｐｅｉ－ＦｕｎｇＷｕ等发现当Ｂ－ＢＯＴ的浓度为３５７ｎＭ时．内化为ＮＢ４１Ａ３细胞时并不引起胞质的钙离子浓度变化．其中。钙离子的增加与ＰＬＡｚ有关．所以当ＥＧＴＡ（钙离子螯合剂）存在时，也不会影响细胞的突起生长。这说明。ｐＢＧＴ的内化与Ａ链的ＰＬＡ。的活性是独立的［趵３．是否只与Ｂ链有关．还需要进一步的实验来确定．
Ｌｉｏｕ等口１３利用瓜蟾的神经肌肉组织研究ｐＢＧＴＡ链和Ｂ链的作用，发现ｐＢＧＴ能增强自发突触电流（ＳＳＣ）的发生频率，用５’。磷酸一吡哆醛修饰争ＢＧＴ或用Ｂａ抖代替缓冲液中的Ｃａ２＋则能消除ｐ－ＢＧＴ的磷酸酶Ａ。活性，减少ｓｓｃ的发生频率．针对Ａ链或Ｂ链的特异性抗体均能有效地抑制磷酸酶＆活性ｔ但对ＳＳＣ的发生频率没有太大影响．说明Ａ
万方数据
链和Ｂ链对增强瓜蟾的神经肌肉ＳＳＣ的发生频率都是必不可少的．随后发现。由于争ＢＧＴ引起Ｃｄ＋从细胞内释放．从而增加ＳＳＣ的频率ｎ扪．
３
ａ－ＢＯＴ．｝ＢＧＴ的ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ
对铲ＢＧＴ、争ＢＧＴ基因的研究发展迅速．ａ＿ＢＧＴ的ｃＤ－
ＮＡ序列包括信号肽序列，编码成熟蛋白的序列和５‘．３’－ＵＴＲ序列．不同＿来源的十ＢＧＴ的ｃＤＮＡ有很高的同源性，其中信号肽序列和５。，３．－ＵＴＲ序列保守并与眼镜蛇科和海蛇科的序列完全一样．由此可以推断它们由同一个祖先进化
而来的．ａ－ＢＧＴ的ｃＤＮＡ全长约５００ｂｐ，其中５・一端约３０
ｂｐ．３’・端约２００ｂｐ为非蛋白编码区域．编码区编码一个由２１个氨基酸残基组成的信号肽和一个７４个氨基酸残基组成的成熟蛋白质．Ｌｉｕ等［２３］从银环蛇毒腺中提取ａ－ＢＧＴ的总ｍＲＮＡ，扩增了口－ＢＧＴｃＤＮＡ片段，其全长为５３０
ｂｐ。５・－
ＵＴＲ３３
ｂｐ，信号肽６３ｂｐ．编码区２２２ｂｐ。３’－ＵＴＲ
１９５
ｂｐ，有
一个终止密码子ＴＧＡ和ＡＡＴＡＡ信号ｐｏｌｙＡ序列．ａ－ＢＧＴｍＲＮＡ在同一个体中也存在多样性。是由转录后编辑形成，还是由于实验中反转录过程的错误、基因克隆中的偏差以及测序过程的误差造成，或两者都有，一直存有争论．
ａ－ＢＧＴ的基因组ＤＮＡ有３个外显子，被２个内含子分隔开．外显子、内舍子连接遵循ＧＴ／ＡＧ法则，启动子序列和３’－ＵＴＲ是高度保守的，ＴＡＴＡ盒位于转录起始位点上游
２５－－－３３
ｂｐ．Ｃｈａｎｇ等【“］从银环蛇毒中提取了２个约２７００
ｂｐ钓基因组ＤＮＡ，即ａ－Ｂｇｔ（Ａ３１）和ａ－Ｂｇｔ（Ｖ３１），它们表现出完全一样的基因结构．含有３个外显子基因．在同样的位置插人２个内含子．且它们的核苷酸序列具有９８％的同源性．内含子ｌ的长度约为１８００ｂｐ，内含子２的长度约为５４０ｂｐ．跟短链神经毒素相比．发现内含子２的长度变化比较小，比内含子１保守．短链神经毒素和长链神经毒素的外显子区域比内含子区域更具多样化．林鲁萍［２５３用引物扩增得到２６５５ｂｐ的口＿ＢＧＴ基因．ａ－ＢＧＴ编码区共有２８８ｂｐ．第１个外显子包括５８ｂｐ的编码区部分，编码信号肽部分Ｎ端的２０个氨基酸Ｉ外显子２全长１０５ｂｐ，编码信号肽剩余的４个氨基酸和成熟肤Ｎ端的３３个氨基酸，夕｝显子３全长１２８ｂｐ．包括编码剩余４１个氨基酸部分和１个终止密码子．翻译出来的蛋白序列符合Ｖ３１变体［２‘１．得到序列的２个内含子分别为１７９０ｂｐ和５３８
ｂｐ．
从银环蛇毒中已分离出７种ｐ银环蛇毒紊异构体．除了Ａ２链外．Ａｌ和Ａ３链的ｃＤＮＡ还未克隆到．另外４个Ａ链异构体（Ａ４－ＡＴ）的ｃＤＮＡ已被克隆，３个Ｂ链ｃＤＮＡ已被克隆．现代色谱技术及氨基酸分析揭示至少有１６种争ＢＯＴ亚型．Ａ链与Ｂ链的分开可用二硫苏糖醇还原链问二硫键，也可用２一巯基乙醇还原。然后用碘乙酸烷化．
Ｌｏｎｇ－ＳｅｎＣｈａｎｇ等［”３通过ＰＣＲ扩增争ＢＧＴ的Ａ链和
Ｂ链基因．分析Ａ链和Ｂ链基因的编码区，发现有３个外显子被２个内含子分隔开，外显子和内含子连接遵循Ｇ，ｒ／ＡＧ法则．分析启动子序列．得出结论，Ａ链和Ｂ链由不同的基因编码．这个结论支持完整的争ＢＧＴ来自转录后的Ａ链和
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Ｂ链配对这个观点．克隆到的Ａ链样基因全长３０２２ｂｐ，外显子１编码５・一ＵＴＲ．２５个氨基酸残基组成的信号肽和氨基酸残基ｌ一４３，外显子２编码氨基酸残基４３－８１．外显子３编码氨基酸残基８１－１２０和３。－ＵＴＲ．克隆到的Ｂ１链基因长５０６２ｂｐ．外显子１编码５一ＵＴＲ．２４个氨基酸残基组成的信号肽，氨基酸残基１－５，外显子２编码氨基酸残基５－５９，外显子３编码氨基酸残基５９－６１和３’－ＵＴＲ．
Ｃｈｅｎｇ等口。３根据ｐ－ＢＧＴ的Ｂ１链启动子区域。３・非编码区．Ｂ１链ｅＤＮＡ分别设计引物．扩增从银环蛇提取的１３－ＢＯＴ显示较弱的磷脂酶～活性．为阐明礴脂酶凡的作用机制和生物活性的研究提供了材料．
Ｗｕ等ｍ］构建了｝银环蛇毒素Ｂ链（Ｂ１和Ｂ２）的ｃＤ－ＮＡ．Ｂ链ｅＤＮＡ编码２４个氨基酸组成的信号肽和精氨酸为起始的由６１个氨基酸组成的成熟蛋白．Ｂ１链ｅＤＮＡ全
长４２５ｂｐ。Ｂ２链ｅＤＮＡ全长３２８ｂｐ．将Ｂ链亚克隆到表达
载体ＰＥＴ－３２ａ（＋），转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）．用Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ树脂柱纯化表达的硫氧还蛋白融合蛋白．Ｂ链用Ｓｅｔ代替Ｃｙｓ－５５。亲和纯化的融合蛋白量至少增加１００倍．如果用肠的基因组。克隆到Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６链的基因组，Ｂ２、Ｂ４链的长度分别为４６９９ｂｐ、３２４３ｂｐ．Ｂ５、Ｂ６链约为２０００ｂｐ，但不包括启动子序列。同源比较６条Ｂ１链的氨基酸序列，显示信号肽有２４个氨基酸组成．２个内含子在相同的位置分隔编码区域，Ｂ２和Ｂ４链第６ｌ位上的氨基酸不同，Ｂ５、Ｂ６在Ｃ末端和Ｎ末端缺少２个氨基酸，但是所有的Ｂ链都有７个半胱氨酸．位于７个不同的保守位点．比较６条链的基因组，发现内含子Ｉ长度几乎一样．内含子２长度变化很大，Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６链缺少内含子２的２个区域，但是６条链在剪接位点附近的内舍子２的序列是高度保守的。和眼镜蛇的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因作比较，发现有共同的基因组结构，而且核苷酸序列高度相似．
在研究银环蛇毒蛋白酶抑制荆类蛋白质（ＰＩＬＰ）时，活性试验表明．重组ＰＩＬＰ－Ｉ能抑制胰蛋白酶的活性．比较ＰＩＬＰ和Ｂ链的基因序列，发现有相同的基因结构，除了编码性．这表明。ＰＩＬＰ基因和Ｂ链基因起源于公共的祖先，进化的加速可能使ＰＩＬＰ基因和Ｂ链基因具多样化．ＷｅｗＭｉｎ能抑制神经母细胞瘤的侵袭和迁移．
ａ－ＢＧＴ。Ｐ－ＳｅＴ的克隆和表达
目前，蛇毒神经毒素主要来源于捕蛇或养蛇提取蛇毒后
进行纯化的方法进行．银环蛇由于人工养殖成本高、周期长、越冬存活率极低，因此通过人工养殖获得大量银环蛇毒物，从野生来源获得银环蛇毒也有很大问题．因此从天然蛇和临床治疗比较困难，而通过基因工程得到足够的ａ－ＢＧＴ、钱友存等［３】】从银环蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ．ＲＴ－ＰＣＲ扩的信号肽和１２０个氨基酸的成熟蛋白，该成熟蛋白和其他ｐ和这些Ａ链具有很高的同源性．将ｐ银环蛇毒素Ａ链ｃＤ－】３４
万方数据
林鲁萍等［３３］用已经构建的ｐＧＥＸ－ＢｇＴＸ（Ｐ２２－Ａ３１）质粒ｍｇ／Ｌ．胡延春等ｍ］将扩增获得的巾ＢＧＴ基因连接至ｐＵＣｍ－ＴｋＤ的重组十ＢＧＴ，其表达量约占细菌总蛋白ｂｌｏｔｔｉｎｇ和间接ＥＬＩＳＡ检测结果表通过以上研究证明，用基因工程的方法获得蛇神经毒素ａ－ＢＧＴ与乙酰胆碱受体结合的亲和力高，因此是研究乙２０世纪７０年代末，应用Ｉ”５标记的ａ－ＢＧＴ作配体采探Ｃｈａｎｇ等［刎克隆并表达了ＰｍＰ－１．ＰＩＬＰ－２。ＰＩＬＰ－３．蛋白酶信号肽的外显子外。编码蛋白质的外显子比内含子更具多样Ｃｈｏｕ等汹】发现ＰＩＬＰ－３还是基质金属蛋白酶一２的抑制剂，４
激酶切掉融合的硫氧还蛋白，则分离的Ｂ链不溶于水．
在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达，并用谷胱甘肽ＳｅｐｈＩＬｒｏｓｅＦＦ纯化ＧＳＴ－ａ－银环蛇毒素融合蛋白，再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，睽汀）．得到了较纯的重组十银环蛇毒素同工毒素．得率约为１．２２５用重组口－银环蛇毒素制备多克隆抗体，经ＥＬＩＳＡ和Ｗａｓｔｅｒｎ杂交鉴定后确定重组口－银环蛇毒素与天然ａ一银环蛇毒素的抗原性一致．
载体构建克隆质粒ｐＵＣｍ－ａ－ＢＧＴ，克隆质粒双酶切后连接至融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ一１中．转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经１５％ＳＤ争ＰＡＧＥ分析，得到约３４的３２．１６％．Ｗａｓｔｅｍ明。ａ－ＢＧＴ的融合表达蛋白也与天然的ａ－ＢＧＴ标准品具有相似的抗原性．在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中的非融合型表达ａ－ＢＧＴ占细菌总蛋白的１１．９８％，主要以包涵体形式存在．也与天然巾ＢＧＴ标准品具有相似的抗原性哺】．巾ＢＧＴ基因失望克隆、表达和活性研究，为改造十ＢＧＴ基因，降低其毒性和用表达的重组十ＢＧＴ研究乙酰胆碱受体提供了有效的途径．
是可行的。且融合表达效率高，具有较好的可溶性．得到的重组毒素蛋白具有一定的生物活性。并与天然的蛋白有相似的免疫原性．但表达的重组｝ＢＧＴ、ｐＢＧＴ与天然的蛋白相比生物活性有所降低．这可能是因为ａ－ＢＧＴ、ｐ－ＢＧＴ都具有多对二硫键，从而造成无论真核还是原核表达都不能完全正确折叠恢复成天然构象，也可能是在表达纯化的过程中一些试剂的影响，使部分蛋白构象改变而导致生物活性降低。但融合表达．
５银环蛇毒素的应用
酰胆碱受体结构的理想探针，可用于显示完整细胞膜表面乙酰胆碱受体的分布和密度，观察各种药物、毒物和其他致病因子对乙酰胆碱受体动力学变化的影响．也是从组织中分离和纯化乙酰胆碱受体的重要工具‘…．
测ｎＡｃｈＲ的数量对阐明重症肌无力（ｍｙａｓｔｈｅｒｎｉａｇｒａｖｉｓ，
有较大困难．而野生银环蛇也由于过度捕猎使银环蛇种群数量逐年下降，加上目前银环蛇也列入国家一级保护野生动毒中分离纯化得到足够数量的ａ－ＢＧＴ、ｐ－ＢＧＴ以供科学研究ｐＢＧＴ成为一条很好的途径．
增编码争银环蛇毒素Ａ链的ｃＤＮＡ．克隆并测定了一个新的８－ＢＧＴ－ｃＤＮＡ全序列，命名为Ａ７链。编码含有２７个氨基酸银环蛇毒素Ａ链一样，具有１３个位置固定的半胱氨酸，而且ＮＡ亚克隆到表达载体ｐＭＡＬ－ｐ２上，转化大肠杆菌ＢＬ２１菌株，得到高效的可溶性融合蛋白．表达产物经ｘ口因子酶切后
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ＭＧ）的发病机制起了极大的作用。ＭＧ是ｎＡｅｈＲ自身免疫性疾病．利用ａ－ＢＧＴ纯化的ｎＡｃｈＲ作为抗原。免疫接种于动物．可制成自身免疫性重症肌无力的模型．为免疫调节诊疗的研究提供了必不可少的工具．莫雪安等［３ｆ］利用ａ－ＢＧＴ能特异性地不可逆地与突触后膜乙酰胆碱受体结合，争ＢＧＴ能特异性地不可逆地与突触前膜的相应蛋白质结合的特性．将ａ－ＢＧＴ和｝ＢＧＴ混合一起包被酶标板，结合随后加的肌肉提取液中相应蛋白质为抗原。以ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ法检测重症肌无力病人血清中混合的抗乙酰胆碱受体抗体（ＡｃｈＲａｂ）和抗突触前膜受体抗体（ＰｓｍＲａｂ），称为抗突触受体抗体。结果ｔ７５名正常人均阴性．８０例临床对照组中，除２例运动神经元疾病和１例多发性肌炎阳性外，其余均阴性。本组１２２例重症肌无力病人中９８例阳性（８０．３％，其中全身型阳性８７．５％）．阳性率明显高于单独检测ＡｃｈＲａｂ（Ｐ＜０．００１）．创建了重症肌无力诊断的一个阳性率较高的实验室指标。
蛇毒神经毒索能抑制中枢神经系统，尤其是延髓呼吸中枢ｍ】。对周围神经系统的作用主要是阻断神经－肌肉接头处冲动的传导，导致骨骼肌尤其是呼吸肌瘫痪．林鲁萍等口３】采用小鼠化学法镇痛试验表明，重组｝银环蛇毒索有一定的镇痛药效，在外周镇痛作用中呈一定的量效关系．于是人们根据蛇毒铲神经毒素这一性质开发出了不成瘾的新型镇痛药，用于镇痛、麻醉和戒毒［３”．神经毒素的镇痛作用与阿片类镇痛药物相比起效较慢，一般肌肉注射或腹腔注射的起效
时同在１ｈ以上，３－－－－５ｈ达高峰Ｈ０１．
ｐ银环蛇毒素主要用予医学药理学和分子免疫学，制备单克隆抗体，在蛇毒的检测、蛇咬伤中毒的预防和救治等方面具有重要意义“¨．通过研究ＰＬＡ２酶活性可以帮助了解磷脂在生理生化过程中的作用。利用ｐＢＣ－Ｔ还可以研究突触前神经递质传递的机制．
６展望
目前．我国对银环蛇蛇毒活性成分的分离、基因克隆和生理、病理学方面进行了一定的研究．如在研究清楚各神经毒素的作用机制的基础上根据不同目的对天然蛇毒神经毒紊基因进行改造．则有可能得到毒性低、疗效好，用于治疗神经传导性疾病的药物，以及低成瘾性、高镇痛效果的镇痛药物Ｉ同时通过研究银环蛇毒素的毒理，可以设计制备针对各个毒性抗原决定簇的新型抗体，从而可准确鉴别不同种属的毒蛇咬伤。为正确应用抗蛇毒血清起到关键的指导作用．同时新型抗体的应用在银环蛇咬伤治疗中也可大于异源蛋白的输入量的同时起到高效的治疗作用。随着研究的不断深入、技术的不断成熟和完善．银环蛇毒素的研究和应用将会越来越广．
［参考文献］
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ｖｅｎｏｒｎ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
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２００６。６３（４）１３０３０—３０４Ｉ．
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ａｎ
ａｒｓｅｎａｌｌａｄａｐｔｉｖｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｎｅｏｆｔｌｎｅ—
ｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡｚ
ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ
万方数据
ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｙ，２００７。７（２）１１－１４．
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ｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｅＩ
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ｔｏ
ｂｒａｉｎｅｍｂｒａｎｅａｂｙｍａｓｔｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇｐｅｐ删ｅ．
ｔｏｘｉｎ
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ｈｉｓ（｝ａｍｉｎｏｅ－ｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）一Ｎ・Ｎ・Ｎ・．
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１３５
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ａｒｅ
ＫＥｙ
ｔｏ
ｈｅａｌｔｈ）
２０１０年第２２卷第２期
３２２－３２９．
Ｖ０１．２２Ｎｏ．２．２０１０
ｎｅｕｒｏｂｈｓｔｏｎｍＳＫ—Ｎ－ＳＨｃｅｌｌｓｒＪ＇１．Ｔｏｘｉｃ－ｏｎ．２００８，６１（２）１３０４－３１５．
［２９３ＣｈｒＩｇ
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Ｓ，ＷａｎｇＪＪ。ＣｈｅｎｇＹＣ，ｅｔａＬＧｅｎｅｔｉｃｏｒｇａｎｋａｔｉｏｎｏｆ
ｐｒｏｔｅａｓｅ
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ＷｕＰＦ．ＣｈａｎｇＬＳ・ＫａｏＹＬ・ｅｔ＾Ｌ争Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
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Ｔｏｘｉｃｏｎ。２００８，５１（８）１１４９０－１４９５．Ｃｈｏｕ
ＷＭ．ＬｉｕＷＨ．ＣｈｅｎＫＣ。ｅｔａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｅｔｉｏｎ
ｏｎ
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ｃｈａｉｎｏｆｐ－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ
ｔａｔｉｏｎ
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ｓｔｕｄｉｅｓ
ａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＢｕｎｇａｒｕｓｍｎｉｔｉｃｉｎｅｔｕｓ
ｏｎ
ｐｒｏｔｅ－
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ｎｅｌｌ＇ｓ－
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ
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ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｒｅｌｅａｓｅｉｎＸｅｎｏｐｔｍ
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Ｐｉｎｌ与肿瘤关系
郑东林，陈远能
（广西医科大学。广西南宁５３００２１）
［关麓词］多肽脯氨酰基顺反异构酶；Ｐｉｎｌｌ肿瘤
［中圈分类号］Ｒ７３０．１［文献标识码】Ａ［文章编号］１００１－－５６３９（２０１０）０２－－０１３６－－０４
蛋白质脯氨酸前的丝氨酸／苏氨酸磷酸化修饰在细胞的生命过程中起重要作用，参与多种细胞信号转导通路的调节．Ｐｉｎｌ是一种高度保守的、特异的多肽脯氨酰基顺反异构酶（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ
ｃｉｓｔｒａｎｓ
３９个氨基酸残基组成，以两个恒定的色氨酸为特征，形成独特的兜状结构．是一个特异性的磷酸化丝氨酸／苏氨酸模体基序的连接区．介导Ｐｉｎｌ结合于底物中磷酸化的蛋白质ｌ另一个是Ｃ端的肽酰脯氨酰异构酶活性区，由１２０个氨基酸残基组成，此区包含活化位点．具有ＲＮＡ聚合酶的功能．以上两区由一个可变氨基酸序列连接，它们共同构成一个双监测
机制‘卜盯．
２
ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＰＩａｓｅ），能特异性地
催化磷酸化的丝／苏一脯氨酸基序发生顺反异构。影响磷酸化
蛋白的功能．
１
Ｐｉｎｌ基因与Ｐｌｎｌ蛋白结构
Ｐｉｎｌ基因定位于１９ｐ１３．编码核蛋白Ｐｉｎｌ由１６３个氨基酸残基组成，相对分子质量为１８×１０３的ＰＰｌａｓｅ．其含有两个功能结构区；一个是Ｎ端的色氨酸一色氨酸中心区（Ｗｗ）。由
】３６
Ｐｉｎｌ的功能
丝／苏一脯氨酸基序是细胞周期中许多关键的蛋白激酶
（包括周期素依赖的激酶、丝裂原激活的蛋白激酶、糖原合成
万方数据
蛇志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳＮＡＫＥ（Ｓｃｉｅｎｃｅ＆ＮＡｔｕｒｅ
ｆｕｒｔｈｅｒｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔ
ａｒｅ
ＫＥｙ
ｔｏ
ｈｅａｌｔｈ）２０１０年第２２卷第２期Ｖ０１．２２
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ２００８，４１（４）１３３１—３３８．
ｕｓｅ
Ｎｏ．２。２０１０
Ｉ／ＣＸＣＲ４
ａｘｉｓＩｉｎｎａｔｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙｏｒｃｈｅｓ－
ｄａｔａ［刀．ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌ．
ｔｒａｔ∞ｔｈｅｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ
ＥＪ３．ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，２０１０，３８（４）ｚ３２１—３３２．
［９］ＣａｌａｎｄｒａＧ，ＭｃＣａｒｔｙＪ，ＭｃＧｕｉｒｋＪ，ｅｔａ１．ＡＭＤ３１００ｐｌｕｓＧＣｓＰ
ｃａｎ
［１０］Ｄｅｖｉｎｅ
ｔｉｏｎａｌ
Ｓ
Ｍ，ＶｉｉＲｔＲｅｔｔｉｇＭ・ｅｔａＬＲａｐｉｄｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃ－
ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ
ｅｅＵｓ
ｗｉｔｈｏｕｔＧ－ＣＳＦ
ｕｓｉｎｇ
ｄｏｎｏｒ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｍｏｂｉｌｉｚｅＣＤ３４＋ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｎｏｎ—Ｈｏｄｇｋｉｎ＇ａｌｙｌｎ－
ＡＭＤ３１００。ａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｔｏｆｔｈｅＣＸＣＲ４／ＳＤＦ－１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ．２００８。１１２（４）１９９０－９９８．
ｐｈｏｍａ．Ｈｏｄｇｋｉｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｉｅｍｙｅｌｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓｐｒｅｖｉ－ｏｕｓｌｙｆａｉｌｉｎｇｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ
ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ
ａｎｄ／ｏｒｅｙｔｏｋｉｎｅ
ａ一银环蛇毒素和ｐ银环蛇毒紊的研究进展
邵敏贞ｈ２，郑
研究所，云南昆明
颖２”，叶锋平２，范泉水扣。
６５０２０１１２．成都军区疾病预防控制中心军事医学
６５０１１８）
（１．云南农业大学动物科学技术学院．云南昆明
６５００３２１３．中国协和医科大学医学生物学研究所，云南昆明
［关键调］银环蛇毒素・ａ一银环蛇毒索・｝银环蛇毒素［中圈分类号］Ｒ５９５．８［文献标识码］
Ａ［文章编号］１００１－－５６３９（２０１０）０２－－０１３２－－０５
银环蛇属动物界，脊索动物门，爬虫纲，有鳞目，眼镜蛇科．环蛇属。全身背面是黑白相问的环纹，具３０～５０个白色或乳黄色窄横纹。是世界十大毒蛇之一．属前沟牙类毒蛇，其一次排毒４．６
ｎａｇ，１
的Ｃ末端尾巴从致密的二硫键核心伸出．４对二硫键与结构稳定性有关，大部分集中在中间大环上且分布于环的一侧，形成一个活性表面．铲ＢＧＴ不存在ａ螺旋．主要由｝折叠和｝转角组成．长链和短链的蛇毒突触后神经毒索主要区别在于尾巴表面存有不同的识别位点［‘１。在一级结构上的差别是长链蛇神经毒素比短链的蛇神经毒素多１０～１５个氨基酸和一对二硫键．空间结构上的差别在于长链神经毒素的第５对二硫键存在于中央大环ｌｏｏｐｌｌ的顶部，产生一个循环螺旋样的动态的构象，使得长链神经毒素适应不同受体亚型．具有三指形结构的蛇神经毒紊一般由６０～８０个氨基酸残基组成一条多肽链．氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性．长链和短链的蛇毒突触后神经毒素都属于这类结构，三指型毒紊折叠的可塑性已经历了最佳的进化，可利用功能基团的不同组合特异性识别ｎＡＣｈＲ亚型间的细微
差别［力．
ｍｇ千毒就能致人于死地．毒腺分泌
的蛇毒含多种多肽成分，具有不同的生物学活性［１】．随着捕食者和被捕者的相互作用．毒素随之进化．功能性的生理活性发生相应的变化【｜］．银环蛇毒素的主要成分为蛋白质和多肽，包括廿银环蛇毒紊（ａ－ＢＧＴ）、ｐ银环蛇毒素（争ＢＧＴ）、静银环蛇毒素（争ＢＧＴ）、７－银环蛇毒素（７．ＢＧＴ）和磷脂酶Ａ等酶类［３１．Ｑｉａｎ等ｃ‘］报道了银环蛇毒素中还存在心脏毒素（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）和一些心脏毒素样碱性蛋白（ＣＬＢＰｓ）以及神经毒素类似物（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＢＭＮＴＬｌ一４）．
１
ａ－ＢＧＴ和｝ＢＧＴ的结构
根据神经毒素的作用靶点不同，把银环蛇神经毒素分为
两类ｔ一类为突触后神经毒素或ａ－神经毒素，这类毒素竞争性的与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合。阻断神经递质的传导，另一类为突触前神经毒素或争神经毒素，其直接作用于运动神经突触前膜，阻断乙酰胆碱的释放，使骨骼肌失去收缩功能而麻痹．根据相对的分子质量大小和二硫键的数目把突触后神经毒素又分为短链神经毒素（６０＇－－－，６２个氨基酸残基．４对二硫键）和长链神经毒素（７０～７４个氨基酸残基，５对二硫键）［”．其中短链神经毒素的阻断作用具有一定的可逆性．
１．１十ＢＧＴ十ＢＧＴ是１９６３年发现的．是一种碱性多肽，含较多的碱性氨基酸和ｌｏ个半胱氮酸残基，半胱氨酸残基都参与５对二硫键的形成．属于长链突触后神经毒素，由７４个氨基酸组成，相对分子质量为８０００Ｄ，空间结构复杂，几乎每一个氮基酸对空间结构的形成发挥着重要作用．
ａ－ＢＧＴ结构如三指形，４个二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心仲展出３个肽链环仿佛３个手指，长
乙酰胆碱受体种类很多．十ＢＧＴ是与Ｎ一型的乙酰胆碱受体结合，其结合是专一性的．饱和的和不可逆性的，具很高的亲和力．乙酰胆碱受体ａ２ｐ帕的｝亚基是结合乙酰胆碱和毒素的亚基．关键氨基酸位于１２５＂一１４７残基之间．
１．２
ｐＢＧＴ由Ｃｈａｎｇ于１９６３年在台湾银环蛇中发现．为
突触前碱性多肽神经毒索．由Ａ链和Ｂ链两条链构成，其分子量为２０～２２ｋＤ，等电点为８．８＂－－９．７．Ａ链通过Ｃｙｓ１５和Ｂ链的Ｃｙｓ５５相连。把２条链连接起来．Ａ链含１２０个氨基酸，有１３个半胱氨酸，分子量为１３５００Ｄ，一级结构类似于蛇毒和哺乳动物胰腺中的磷脂酶凡（ＰＬＡ，），但活性比较弱．
Ｈｉｓ４８．Ａｓｐ
９９和Ｔｙｒ５２的侧链互相影响形成一个氢键中
心，组成活性中心区域，处于活性中心的氨基酸是相当保守的．Ｂ链由６０个氨基酸组成，分子量为７０００Ｄ．与胰蛋白酶抑制剂、毒素Ｉ及树眼镜蛇毒素具有序列同源性Ｃｓ－ｌｏ］．其中树眼镜蛇毒素分离自非洲的曼巴蛇，选择性地阻断神经元的
・・通讯作者１３２
万方数据
蛇志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳＮＡＫＥ（Ｓｃｉｅｎｃｅ＆ＮＡｔｕｒｅ
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电压门控钾通道［１１］．Ｃｈｅｎ等［１幻研究ｐ。－ＢＧＴ的免疫化学性质时，通过定量沉淀反应和研究Ｆａｂ片段组成的可溶性复合物的分子量分析发现岛一ＢＧＴＡ链．Ｂ链的抗原决定簇的数目分别为５和２．其制备了２３个单克隆抗体。其中７个能抑制ＰＬＡ。７０％的活性．中和毒素的毒性．免疫印迹显示，６个单克隆抗体识别连续的表位．Ａ链的序列３１－３７，４６—５１。９１－
９８。１００－１０６是可以被中和的表位．２银环蛇毒素的毒理作用
神经毒素是银环蛇毒的主要成分．被银环蛇咬伤．中毒症状为伤口轻微疼痛．肢体感觉异常，嗜睡。运动神经失调，眼睑下垂。吞咽困难。乏力，一旦呼吸衰竭，易造成死亡．
２．１
ａ－ＢＧＴ的毒理作用ａ－ＢＧＴ与运动终板乙酰胆碱受体
结合，从而抑制了乙酰胆碱对横纹肌细胞膜的除极化作用．导致神经传导阻断，引起横纹肌松弛．ａ－ＢＧＴ并不影响神经末梢乙酰胆碱的释放．２．２争ＢＯＴ的毒理作用
ｐ－ＢＧＴ作用于运动神经突触前膜
产生一种三相变化，首先是传出递质数量的迅速降低．其次是释放增加，随后是进一步抑制，从而阻断突触间神经冲动传递．使骨骼肌不能兴奋收缩而转入持续性麻痹，其毒性比突触后毒素高得多口钉．
争ＢＧＴ主要作用于神经系统．在外周神经系统中不可逆地阻断神经肌肉的兴奋传递。在中枢神经系统中特异地抑制某些神经元突触前膜递质的释放．其毒性作用依赖于ＰＬ如活性，Ａ链的Ｌｙｓ６４与ＰＬＡ２活性和争ＢＧＴ其他毒性有关［１“．当亚基问二硫键断裂，或ＰＬＡ。活性中心被共价修饰时．都可导致ｐ－ＢＧＴ的神经毒性丧失［１５】．
ＰＬＡｚ活性具有间接溶血作用，在Ｃａ２＋存在下能水解卵磷脂（专一水解ｃ－２酯键），生成能溶解红细胞的溶血卵磷脂及脂肪酸。两者促进突触囊泡和突触前膜的融合。在膜表面暴露出突触囊泡蛋白的内部表位．诱导突触囊泡分泌到胞外。伴随着细胞外的大量钙离子流向神经末梢．这两者还使神经末梢的突出囊泡储存库消失［１盯．用谷胱甘肽还原链问二硫键可提高ｐ－ＢＯＴ的膜破坏活性［１”．Ｂ链识别特定靶细胞膜，阻断电压门控钾通道。但也需要Ａ链的相互作用及钙离子的参与［ｎ】．但Ｃｈｅｎｇ等发现Ｂ链引起人类神经节ＳＫ－Ｎ－ＳＨ细胞凋亡，这种细胞毒性与Ａ链的ＰＬＡ。活性没有多大关系［１’１．Ｐｅｉ－ＦｕｎｇＷｕ等发现当Ｂ－ＢＯＴ的浓度为３５７ｎＭ时．内化为ＮＢ４１Ａ３细胞时并不引起胞质的钙离子浓度变化．其中。钙离子的增加与ＰＬＡｚ有关．所以当ＥＧＴＡ（钙离子螯合剂）存在时，也不会影响细胞的突起生长。这说明。ｐＢＧＴ的内化与Ａ链的ＰＬＡ。的活性是独立的［趵３．是否只与Ｂ链有关．还需要进一步的实验来确定．
Ｌｉｏｕ等口１３利用瓜蟾的神经肌肉组织研究ｐＢＧＴＡ链和Ｂ链的作用，发现ｐＢＧＴ能增强自发突触电流（ＳＳＣ）的发生频率，用５’。磷酸一吡哆醛修饰争ＢＧＴ或用Ｂａ抖代替缓冲液中的Ｃａ２＋则能消除ｐ－ＢＧＴ的磷酸酶Ａ。活性，减少ｓｓｃ的发生频率．针对Ａ链或Ｂ链的特异性抗体均能有效地抑制磷酸酶＆活性ｔ但对ＳＳＣ的发生频率没有太大影响．说明Ａ
万方数据
链和Ｂ链对增强瓜蟾的神经肌肉ＳＳＣ的发生频率都是必不可少的．随后发现。由于争ＢＧＴ引起Ｃｄ＋从细胞内释放．从而增加ＳＳＣ的频率ｎ扪．
３
ａ－ＢＯＴ．｝ＢＧＴ的ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ
对铲ＢＧＴ、争ＢＧＴ基因的研究发展迅速．ａ＿ＢＧＴ的ｃＤ－
ＮＡ序列包括信号肽序列，编码成熟蛋白的序列和５‘．３’－ＵＴＲ序列．不同＿来源的十ＢＧＴ的ｃＤＮＡ有很高的同源性，其中信号肽序列和５。，３．－ＵＴＲ序列保守并与眼镜蛇科和海蛇科的序列完全一样．由此可以推断它们由同一个祖先进化
而来的．ａ－ＢＧＴ的ｃＤＮＡ全长约５００ｂｐ，其中５・一端约３０
ｂｐ．３’・端约２００ｂｐ为非蛋白编码区域．编码区编码一个由２１个氨基酸残基组成的信号肽和一个７４个氨基酸残基组成的成熟蛋白质．Ｌｉｕ等［２３］从银环蛇毒腺中提取ａ－ＢＧＴ的总ｍＲＮＡ，扩增了口－ＢＧＴｃＤＮＡ片段，其全长为５３０
ｂｐ。５・－
ＵＴＲ３３
ｂｐ，信号肽６３ｂｐ．编码区２２２ｂｐ。３’－ＵＴＲ
１９５
ｂｐ，有
一个终止密码子ＴＧＡ和ＡＡＴＡＡ信号ｐｏｌｙＡ序列．ａ－ＢＧＴｍＲＮＡ在同一个体中也存在多样性。是由转录后编辑形成，还是由于实验中反转录过程的错误、基因克隆中的偏差以及测序过程的误差造成，或两者都有，一直存有争论．
ａ－ＢＧＴ的基因组ＤＮＡ有３个外显子，被２个内含子分隔开．外显子、内舍子连接遵循ＧＴ／ＡＧ法则，启动子序列和３’－ＵＴＲ是高度保守的，ＴＡＴＡ盒位于转录起始位点上游
２５－－－３３
ｂｐ．Ｃｈａｎｇ等【“］从银环蛇毒中提取了２个约２７００
ｂｐ钓基因组ＤＮＡ，即ａ－Ｂｇｔ（Ａ３１）和ａ－Ｂｇｔ（Ｖ３１），它们表现出完全一样的基因结构．含有３个外显子基因．在同样的位置插人２个内含子．且它们的核苷酸序列具有９８％的同源性．内含子ｌ的长度约为１８００ｂｐ，内含子２的长度约为５４０ｂｐ．跟短链神经毒素相比．发现内含子２的长度变化比较小，比内含子１保守．短链神经毒素和长链神经毒素的外显子区域比内含子区域更具多样化．林鲁萍［２５３用引物扩增得到２６５５ｂｐ的口＿ＢＧＴ基因．ａ－ＢＧＴ编码区共有２８８ｂｐ．第１个外显子包括５８ｂｐ的编码区部分，编码信号肽部分Ｎ端的２０个氨基酸Ｉ外显子２全长１０５ｂｐ，编码信号肽剩余的４个氨基酸和成熟肤Ｎ端的３３个氨基酸，夕｝显子３全长１２８ｂｐ．包括编码剩余４１个氨基酸部分和１个终止密码子．翻译出来的蛋白序列符合Ｖ３１变体［２‘１．得到序列的２个内含子分别为１７９０ｂｐ和５３８
ｂｐ．
从银环蛇毒中已分离出７种ｐ银环蛇毒紊异构体．除了Ａ２链外．Ａｌ和Ａ３链的ｃＤＮＡ还未克隆到．另外４个Ａ链异构体（Ａ４－ＡＴ）的ｃＤＮＡ已被克隆，３个Ｂ链ｃＤＮＡ已被克隆．现代色谱技术及氨基酸分析揭示至少有１６种争ＢＯＴ亚型．Ａ链与Ｂ链的分开可用二硫苏糖醇还原链问二硫键，也可用２一巯基乙醇还原。然后用碘乙酸烷化．
Ｌｏｎｇ－ＳｅｎＣｈａｎｇ等［”３通过ＰＣＲ扩增争ＢＧＴ的Ａ链和
Ｂ链基因．分析Ａ链和Ｂ链基因的编码区，发现有３个外显子被２个内含子分隔开，外显子和内含子连接遵循Ｇ，ｒ／ＡＧ法则．分析启动子序列．得出结论，Ａ链和Ｂ链由不同的基因编码．这个结论支持完整的争ＢＧＴ来自转录后的Ａ链和
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Ｂ链配对这个观点．克隆到的Ａ链样基因全长３０２２ｂｐ，外显子１编码５・一ＵＴＲ．２５个氨基酸残基组成的信号肽和氨基酸残基ｌ一４３，外显子２编码氨基酸残基４３－８１．外显子３编码氨基酸残基８１－１２０和３。－ＵＴＲ．克隆到的Ｂ１链基因长５０６２ｂｐ．外显子１编码５一ＵＴＲ．２４个氨基酸残基组成的信号肽，氨基酸残基１－５，外显子２编码氨基酸残基５－５９，外显子３编码氨基酸残基５９－６１和３’－ＵＴＲ．
Ｃｈｅｎｇ等口。３根据ｐ－ＢＧＴ的Ｂ１链启动子区域。３・非编码区．Ｂ１链ｅＤＮＡ分别设计引物．扩增从银环蛇提取的１３－ＢＯＴ显示较弱的磷脂酶～活性．为阐明礴脂酶凡的作用机制和生物活性的研究提供了材料．
Ｗｕ等ｍ］构建了｝银环蛇毒素Ｂ链（Ｂ１和Ｂ２）的ｃＤ－ＮＡ．Ｂ链ｅＤＮＡ编码２４个氨基酸组成的信号肽和精氨酸为起始的由６１个氨基酸组成的成熟蛋白．Ｂ１链ｅＤＮＡ全
长４２５ｂｐ。Ｂ２链ｅＤＮＡ全长３２８ｂｐ．将Ｂ链亚克隆到表达
载体ＰＥＴ－３２ａ（＋），转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）．用Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ树脂柱纯化表达的硫氧还蛋白融合蛋白．Ｂ链用Ｓｅｔ代替Ｃｙｓ－５５。亲和纯化的融合蛋白量至少增加１００倍．如果用肠的基因组。克隆到Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６链的基因组，Ｂ２、Ｂ４链的长度分别为４６９９ｂｐ、３２４３ｂｐ．Ｂ５、Ｂ６链约为２０００ｂｐ，但不包括启动子序列。同源比较６条Ｂ１链的氨基酸序列，显示信号肽有２４个氨基酸组成．２个内含子在相同的位置分隔编码区域，Ｂ２和Ｂ４链第６ｌ位上的氨基酸不同，Ｂ５、Ｂ６在Ｃ末端和Ｎ末端缺少２个氨基酸，但是所有的Ｂ链都有７个半胱氨酸．位于７个不同的保守位点．比较６条链的基因组，发现内含子Ｉ长度几乎一样．内含子２长度变化很大，Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６链缺少内含子２的２个区域，但是６条链在剪接位点附近的内舍子２的序列是高度保守的。和眼镜蛇的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因作比较，发现有共同的基因组结构，而且核苷酸序列高度相似．
在研究银环蛇毒蛋白酶抑制荆类蛋白质（ＰＩＬＰ）时，活性试验表明．重组ＰＩＬＰ－Ｉ能抑制胰蛋白酶的活性．比较ＰＩＬＰ和Ｂ链的基因序列，发现有相同的基因结构，除了编码性．这表明。ＰＩＬＰ基因和Ｂ链基因起源于公共的祖先，进化的加速可能使ＰＩＬＰ基因和Ｂ链基因具多样化．ＷｅｗＭｉｎ能抑制神经母细胞瘤的侵袭和迁移．
ａ－ＢＧＴ。Ｐ－ＳｅＴ的克隆和表达
目前，蛇毒神经毒素主要来源于捕蛇或养蛇提取蛇毒后
进行纯化的方法进行．银环蛇由于人工养殖成本高、周期长、越冬存活率极低，因此通过人工养殖获得大量银环蛇毒物，从野生来源获得银环蛇毒也有很大问题．因此从天然蛇和临床治疗比较困难，而通过基因工程得到足够的ａ－ＢＧＴ、钱友存等［３】】从银环蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ．ＲＴ－ＰＣＲ扩的信号肽和１２０个氨基酸的成熟蛋白，该成熟蛋白和其他ｐ和这些Ａ链具有很高的同源性．将ｐ银环蛇毒素Ａ链ｃＤ－】３４
万方数据
林鲁萍等［３３］用已经构建的ｐＧＥＸ－ＢｇＴＸ（Ｐ２２－Ａ３１）质粒ｍｇ／Ｌ．胡延春等ｍ］将扩增获得的巾ＢＧＴ基因连接至ｐＵＣｍ－ＴｋＤ的重组十ＢＧＴ，其表达量约占细菌总蛋白ｂｌｏｔｔｉｎｇ和间接ＥＬＩＳＡ检测结果表通过以上研究证明，用基因工程的方法获得蛇神经毒素ａ－ＢＧＴ与乙酰胆碱受体结合的亲和力高，因此是研究乙２０世纪７０年代末，应用Ｉ”５标记的ａ－ＢＧＴ作配体采探Ｃｈａｎｇ等［刎克隆并表达了ＰｍＰ－１．ＰＩＬＰ－２。ＰＩＬＰ－３．蛋白酶信号肽的外显子外。编码蛋白质的外显子比内含子更具多样Ｃｈｏｕ等汹】发现ＰＩＬＰ－３还是基质金属蛋白酶一２的抑制剂，４
激酶切掉融合的硫氧还蛋白，则分离的Ｂ链不溶于水．
在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达，并用谷胱甘肽ＳｅｐｈＩＬｒｏｓｅＦＦ纯化ＧＳＴ－ａ－银环蛇毒素融合蛋白，再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，睽汀）．得到了较纯的重组十银环蛇毒素同工毒素．得率约为１．２２５用重组口－银环蛇毒素制备多克隆抗体，经ＥＬＩＳＡ和Ｗａｓｔｅｒｎ杂交鉴定后确定重组口－银环蛇毒素与天然ａ一银环蛇毒素的抗原性一致．
载体构建克隆质粒ｐＵＣｍ－ａ－ＢＧＴ，克隆质粒双酶切后连接至融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ一１中．转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经１５％ＳＤ争ＰＡＧＥ分析，得到约３４的３２．１６％．Ｗａｓｔｅｍ明。ａ－ＢＧＴ的融合表达蛋白也与天然的ａ－ＢＧＴ标准品具有相似的抗原性．在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中的非融合型表达ａ－ＢＧＴ占细菌总蛋白的１１．９８％，主要以包涵体形式存在．也与天然巾ＢＧＴ标准品具有相似的抗原性哺】．巾ＢＧＴ基因失望克隆、表达和活性研究，为改造十ＢＧＴ基因，降低其毒性和用表达的重组十ＢＧＴ研究乙酰胆碱受体提供了有效的途径．
是可行的。且融合表达效率高，具有较好的可溶性．得到的重组毒素蛋白具有一定的生物活性。并与天然的蛋白有相似的免疫原性．但表达的重组｝ＢＧＴ、ｐＢＧＴ与天然的蛋白相比生物活性有所降低．这可能是因为ａ－ＢＧＴ、ｐ－ＢＧＴ都具有多对二硫键，从而造成无论真核还是原核表达都不能完全正确折叠恢复成天然构象，也可能是在表达纯化的过程中一些试剂的影响，使部分蛋白构象改变而导致生物活性降低。但融合表达．
５银环蛇毒素的应用
酰胆碱受体结构的理想探针，可用于显示完整细胞膜表面乙酰胆碱受体的分布和密度，观察各种药物、毒物和其他致病因子对乙酰胆碱受体动力学变化的影响．也是从组织中分离和纯化乙酰胆碱受体的重要工具‘…．
测ｎＡｃｈＲ的数量对阐明重症肌无力（ｍｙａｓｔｈｅｒｎｉａｇｒａｖｉｓ，
有较大困难．而野生银环蛇也由于过度捕猎使银环蛇种群数量逐年下降，加上目前银环蛇也列入国家一级保护野生动毒中分离纯化得到足够数量的ａ－ＢＧＴ、ｐ－ＢＧＴ以供科学研究ｐＢＧＴ成为一条很好的途径．
增编码争银环蛇毒素Ａ链的ｃＤＮＡ．克隆并测定了一个新的８－ＢＧＴ－ｃＤＮＡ全序列，命名为Ａ７链。编码含有２７个氨基酸银环蛇毒素Ａ链一样，具有１３个位置固定的半胱氨酸，而且ＮＡ亚克隆到表达载体ｐＭＡＬ－ｐ２上，转化大肠杆菌ＢＬ２１菌株，得到高效的可溶性融合蛋白．表达产物经ｘ口因子酶切后
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ＭＧ）的发病机制起了极大的作用。ＭＧ是ｎＡｅｈＲ自身免疫性疾病．利用ａ－ＢＧＴ纯化的ｎＡｃｈＲ作为抗原。免疫接种于动物．可制成自身免疫性重症肌无力的模型．为免疫调节诊疗的研究提供了必不可少的工具．莫雪安等［３ｆ］利用ａ－ＢＧＴ能特异性地不可逆地与突触后膜乙酰胆碱受体结合，争ＢＧＴ能特异性地不可逆地与突触前膜的相应蛋白质结合的特性．将ａ－ＢＧＴ和｝ＢＧＴ混合一起包被酶标板，结合随后加的肌肉提取液中相应蛋白质为抗原。以ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ法检测重症肌无力病人血清中混合的抗乙酰胆碱受体抗体（ＡｃｈＲａｂ）和抗突触前膜受体抗体（ＰｓｍＲａｂ），称为抗突触受体抗体。结果ｔ７５名正常人均阴性．８０例临床对照组中，除２例运动神经元疾病和１例多发性肌炎阳性外，其余均阴性。本组１２２例重症肌无力病人中９８例阳性（８０．３％，其中全身型阳性８７．５％）．阳性率明显高于单独检测ＡｃｈＲａｂ（Ｐ＜０．００１）．创建了重症肌无力诊断的一个阳性率较高的实验室指标。
蛇毒神经毒索能抑制中枢神经系统，尤其是延髓呼吸中枢ｍ】。对周围神经系统的作用主要是阻断神经－肌肉接头处冲动的传导，导致骨骼肌尤其是呼吸肌瘫痪．林鲁萍等口３】采用小鼠化学法镇痛试验表明，重组｝银环蛇毒索有一定的镇痛药效，在外周镇痛作用中呈一定的量效关系．于是人们根据蛇毒铲神经毒素这一性质开发出了不成瘾的新型镇痛药，用于镇痛、麻醉和戒毒［３”．神经毒素的镇痛作用与阿片类镇痛药物相比起效较慢，一般肌肉注射或腹腔注射的起效
时同在１ｈ以上，３－－－－５ｈ达高峰Ｈ０１．
ｐ银环蛇毒素主要用予医学药理学和分子免疫学，制备单克隆抗体，在蛇毒的检测、蛇咬伤中毒的预防和救治等方面具有重要意义“¨．通过研究ＰＬＡ２酶活性可以帮助了解磷脂在生理生化过程中的作用。利用ｐＢＣ－Ｔ还可以研究突触前神经递质传递的机制．
６展望
目前．我国对银环蛇蛇毒活性成分的分离、基因克隆和生理、病理学方面进行了一定的研究．如在研究清楚各神经毒素的作用机制的基础上根据不同目的对天然蛇毒神经毒紊基因进行改造．则有可能得到毒性低、疗效好，用于治疗神经传导性疾病的药物，以及低成瘾性、高镇痛效果的镇痛药物Ｉ同时通过研究银环蛇毒素的毒理，可以设计制备针对各个毒性抗原决定簇的新型抗体，从而可准确鉴别不同种属的毒蛇咬伤。为正确应用抗蛇毒血清起到关键的指导作用．同时新型抗体的应用在银环蛇咬伤治疗中也可大于异源蛋白的输入量的同时起到高效的治疗作用。随着研究的不断深入、技术的不断成熟和完善．银环蛇毒素的研究和应用将会越来越广．
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ｔｏｘｉｎ
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２０１０年第２２卷第２期
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Ｖ０１．２２Ｎｏ．２．２０１０
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Ｐｉｎｌ与肿瘤关系
郑东林，陈远能
（广西医科大学。广西南宁５３００２１）
［关麓词］多肽脯氨酰基顺反异构酶；Ｐｉｎｌｌ肿瘤
［中圈分类号］Ｒ７３０．１［文献标识码】Ａ［文章编号］１００１－－５６３９（２０１０）０２－－０１３６－－０４
蛋白质脯氨酸前的丝氨酸／苏氨酸磷酸化修饰在细胞的生命过程中起重要作用，参与多种细胞信号转导通路的调节．Ｐｉｎｌ是一种高度保守的、特异的多肽脯氨酰基顺反异构酶（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ
ｃｉｓｔｒａｎｓ
３９个氨基酸残基组成，以两个恒定的色氨酸为特征，形成独特的兜状结构．是一个特异性的磷酸化丝氨酸／苏氨酸模体基序的连接区．介导Ｐｉｎｌ结合于底物中磷酸化的蛋白质ｌ另一个是Ｃ端的肽酰脯氨酰异构酶活性区，由１２０个氨基酸残基组成，此区包含活化位点．具有ＲＮＡ聚合酶的功能．以上两区由一个可变氨基酸序列连接，它们共同构成一个双监测
机制‘卜盯．
２
ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＰＩａｓｅ），能特异性地
催化磷酸化的丝／苏一脯氨酸基序发生顺反异构。影响磷酸化
蛋白的功能．
１
Ｐｉｎｌ基因与Ｐｌｎｌ蛋白结构
Ｐｉｎｌ基因定位于１９ｐ１３．编码核蛋白Ｐｉｎｌ由１６３个氨基酸残基组成，相对分子质量为１８×１０３的ＰＰｌａｓｅ．其含有两个功能结构区；一个是Ｎ端的色氨酸一色氨酸中心区（Ｗｗ）。由
】３６
Ｐｉｎｌ的功能
丝／苏一脯氨酸基序是细胞周期中许多关键的蛋白激酶
（包括周期素依赖的激酶、丝裂原激活的蛋白激酶、糖原合成
万方数据