抗菌实验方法

一、抗菌实验

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(一) 体外抗菌实验

1. 实验前的准备工作

(1) 培养基的准备: 肉汤琼脂培养基、真菌琼脂培养基等均可按药典规定的方法配制。

(2) 药液的准备: 一般采用中草药水煎液,经滤过浓缩成1:10~1:1的浓度,试验前的药液需灭菌,以免污染影响结果。

(3) 试验菌株的选择及制备:一般使用典型的菌株,或从临床分离经鉴定后取得的菌株,如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、链球菌、肺炎双球菌、白色念珠菌、酵母菌及真菌等。

细菌菌液的制备: 将斜面菌种接种于普通肉汤培养基中,肺炎双球菌及溶血性链球菌须在上述培养基中加入5%~10%血清,或加入25%(V/V)或20%猪血水,37℃培养6~8小时或16~18小时。

真菌菌液的制备:将菌种接种于大试管中,并在22℃~25℃培养24小时或7天(视菌种及生长速度而定) ,然后用灭菌生理盐水10mL 洗脱制成混悬液。

菌液的浓度一般先采用培养液,如不显示抗菌作用,可再稀释成一定浓度。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌可用1:1000浓度,肺炎双球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、酵母菌可用1:10或1:100浓度。

2. 实验方法

(1) 平碟法:取熔化后的培养基,每平碟(培养皿) 倒入15mL ,待凝固后,在培养基表面划线接种试验菌株,在划线的中间位置安放一个灭菌的不锈钢圈,在圈内滴入试验药液。也可采用打洞法,即在凝固的培养基上用已灭菌的打孔器打孔挖去琼脂块,将药液滴在洞内。用灭菌陶盖盖好,细菌在37℃、真菌在22℃~25℃培养18~20小时,观察细菌生长情况,如全线生长则认为该浓度的药液无抗菌作用,如细菌或真菌划线为药液所切断,则认为该浓度药液有抗菌作用。

(2) 平碟稀释法:先将中药药液2mL 加入平碟内,再加入已溶化的培养基8mL ,充分摇匀,待凝固后,划线接种菌株,同时用水2mL 代替药液制作空白对照平碟,方法同样,接种后,将平碟倒置,在37℃ (真菌在22℃~25℃) 培养18~20小时,观察结果。如对照碟长菌、药液碟不长菌,则认为有抗菌作用。

(3) 试管法:取试管12支,在每一试管中加入培养基5mL ,于第1管中加被试药液5mL ,混合均匀,吸出5mL 加到第2管中,混合均匀,再吸5mL 加到第3管中,依次操作,直到第 10管,将第10管混合均匀后吸出5mL 弃去,其药液稀释依次为1:2,1:4,1:8,……1: 1024,再于前11管中各加入适当浓度的菌液0.1mL ,第11管作为菌液对照,第12管不加菌液,加被试药液0.1mL ,作为药液对照。将其全部在37℃(真菌22℃~25℃) 培养16~24小时(真菌24~72小时) ,观察各管菌株生长情况。如菌液对照管浑浊,表示菌株生长良好; 药液对照管澄明,表示药液没有染菌。再将试验管与对照

管比较,以溶液澄明无菌生长为有抗菌作用,其中以药液稀释度最大管的药液浓度为最小抗菌浓度。如欲了解药液的抗菌作用是抑菌(MIC )还是杀菌(MBC ),可将上述不长菌试管中的溶液,用接种环转种到肉汤培养基中,经37℃培养 16~20小时 (真菌则在22℃~25℃培养24~72小时) ,如仍不长菌,表示药液有杀菌作用。(?)

(二) 动物体内抗菌实验

1. 实验前的准备工作

(1) 菌液的制备:将选定的菌种,用接种环从斜面培养基上接种于肉汤培养基中,在37℃ 培养18小时后,再用培养基转种一次,培养18小时后,取出备用。将上述菌液用生理盐水按10倍顺序稀释成不同浓度,每一浓度菌液分别注射给5只小白鼠,观察4天,以能使80% ~100%小鼠感染死亡的菌液供正式实验用。

(2) 药物的配制及选择剂量: 先将药物配成一定浓度的溶液,再用二倍稀释法配成三种浓度的溶液,通过动物毒性预试,确定其半数致死量和最大耐受量。以LD 50的1/3~1/5或最大耐受量的1/2为实验治疗剂量的起点,可再选2~3个剂量,同时分组实验。例如某药物的 LD 50药为500mg/kg,则实验治疗剂量可选用100、50、25mg/kg三个剂量。

2. 实验治疗

(1) 小鼠腹腔感染:取小鼠分4组,每组10只(体重17~20g) ,一组给生理盐水做对照,其他组分别给几种浓度的药液,1小时后,各组小鼠均腹腔注射适当稀释的菌液0.5mL ,感染后1小时及6小时,必要时在24小时再给药液或生理盐水1次,观察4天,记录各组小鼠死亡的时间和死亡率。

(2) 小鼠静脉感染:取小鼠分为5组,每组10只,一组为生理盐水对照,一组为已知药物对照,其余三组为实验药物组,各组小鼠由尾静脉注射适当稀释的菌液0.2mL ,然后每天给药2次,共给7天,观察3周,记录各组小鼠死亡数,计算死亡率。

实验结果分析 在腹腔或静脉感染时,如果对照组死亡率达80%~100%,实验组死亡率比对照组少25%以上,表示该药有抗菌作用; 如实验组与对照组死亡率相近似,说明该药在现用剂量下无抗菌作用,可适当增加剂量重试; 如实验组死亡率大于对照组,且死亡时间也快,说明药物的毒性影响疗效观察,应适当降低药物剂量后再试; 如对照组死亡率低于50%,表示感染菌株毒力太小,应增加感染菌液量或另选毒力大的菌株。

,将装入试管内的称为“斜面琼脂培养基”,一般用于菌种的培养或保藏;将装入锥形烧瓶或培养皿内的称为“平板琼脂培养基”,多用于菌种分离。

培养皿倒放,可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下,冲散菌落。

一、抗菌实验

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(一) 体外抗菌实验

1. 实验前的准备工作

(1) 培养基的准备: 肉汤琼脂培养基、真菌琼脂培养基等均可按药典规定的方法配制。

(2) 药液的准备: 一般采用中草药水煎液,经滤过浓缩成1:10~1:1的浓度,试验前的药液需灭菌,以免污染影响结果。

(3) 试验菌株的选择及制备:一般使用典型的菌株,或从临床分离经鉴定后取得的菌株,如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、链球菌、肺炎双球菌、白色念珠菌、酵母菌及真菌等。

细菌菌液的制备: 将斜面菌种接种于普通肉汤培养基中,肺炎双球菌及溶血性链球菌须在上述培养基中加入5%~10%血清,或加入25%(V/V)或20%猪血水,37℃培养6~8小时或16~18小时。

真菌菌液的制备:将菌种接种于大试管中,并在22℃~25℃培养24小时或7天(视菌种及生长速度而定) ,然后用灭菌生理盐水10mL 洗脱制成混悬液。

菌液的浓度一般先采用培养液,如不显示抗菌作用,可再稀释成一定浓度。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌可用1:1000浓度,肺炎双球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、酵母菌可用1:10或1:100浓度。

2. 实验方法

(1) 平碟法:取熔化后的培养基,每平碟(培养皿) 倒入15mL ,待凝固后,在培养基表面划线接种试验菌株,在划线的中间位置安放一个灭菌的不锈钢圈,在圈内滴入试验药液。也可采用打洞法,即在凝固的培养基上用已灭菌的打孔器打孔挖去琼脂块,将药液滴在洞内。用灭菌陶盖盖好,细菌在37℃、真菌在22℃~25℃培养18~20小时,观察细菌生长情况,如全线生长则认为该浓度的药液无抗菌作用,如细菌或真菌划线为药液所切断,则认为该浓度药液有抗菌作用。

(2) 平碟稀释法:先将中药药液2mL 加入平碟内,再加入已溶化的培养基8mL ,充分摇匀,待凝固后,划线接种菌株,同时用水2mL 代替药液制作空白对照平碟,方法同样,接种后,将平碟倒置,在37℃ (真菌在22℃~25℃) 培养18~20小时,观察结果。如对照碟长菌、药液碟不长菌,则认为有抗菌作用。

(3) 试管法:取试管12支,在每一试管中加入培养基5mL ,于第1管中加被试药液5mL ,混合均匀,吸出5mL 加到第2管中,混合均匀,再吸5mL 加到第3管中,依次操作,直到第 10管,将第10管混合均匀后吸出5mL 弃去,其药液稀释依次为1:2,1:4,1:8,……1: 1024,再于前11管中各加入适当浓度的菌液0.1mL ,第11管作为菌液对照,第12管不加菌液,加被试药液0.1mL ,作为药液对照。将其全部在37℃(真菌22℃~25℃) 培养16~24小时(真菌24~72小时) ,观察各管菌株生长情况。如菌液对照管浑浊,表示菌株生长良好; 药液对照管澄明,表示药液没有染菌。再将试验管与对照

管比较,以溶液澄明无菌生长为有抗菌作用,其中以药液稀释度最大管的药液浓度为最小抗菌浓度。如欲了解药液的抗菌作用是抑菌(MIC )还是杀菌(MBC ),可将上述不长菌试管中的溶液,用接种环转种到肉汤培养基中,经37℃培养 16~20小时 (真菌则在22℃~25℃培养24~72小时) ,如仍不长菌,表示药液有杀菌作用。(?)

(二) 动物体内抗菌实验

1. 实验前的准备工作

(1) 菌液的制备:将选定的菌种,用接种环从斜面培养基上接种于肉汤培养基中,在37℃ 培养18小时后,再用培养基转种一次,培养18小时后,取出备用。将上述菌液用生理盐水按10倍顺序稀释成不同浓度,每一浓度菌液分别注射给5只小白鼠,观察4天,以能使80% ~100%小鼠感染死亡的菌液供正式实验用。

(2) 药物的配制及选择剂量: 先将药物配成一定浓度的溶液,再用二倍稀释法配成三种浓度的溶液,通过动物毒性预试,确定其半数致死量和最大耐受量。以LD 50的1/3~1/5或最大耐受量的1/2为实验治疗剂量的起点,可再选2~3个剂量,同时分组实验。例如某药物的 LD 50药为500mg/kg,则实验治疗剂量可选用100、50、25mg/kg三个剂量。

2. 实验治疗

(1) 小鼠腹腔感染:取小鼠分4组,每组10只(体重17~20g) ,一组给生理盐水做对照,其他组分别给几种浓度的药液,1小时后,各组小鼠均腹腔注射适当稀释的菌液0.5mL ,感染后1小时及6小时,必要时在24小时再给药液或生理盐水1次,观察4天,记录各组小鼠死亡的时间和死亡率。

(2) 小鼠静脉感染:取小鼠分为5组,每组10只,一组为生理盐水对照,一组为已知药物对照,其余三组为实验药物组,各组小鼠由尾静脉注射适当稀释的菌液0.2mL ,然后每天给药2次,共给7天,观察3周,记录各组小鼠死亡数,计算死亡率。

实验结果分析 在腹腔或静脉感染时,如果对照组死亡率达80%~100%,实验组死亡率比对照组少25%以上,表示该药有抗菌作用; 如实验组与对照组死亡率相近似,说明该药在现用剂量下无抗菌作用,可适当增加剂量重试; 如实验组死亡率大于对照组,且死亡时间也快,说明药物的毒性影响疗效观察,应适当降低药物剂量后再试; 如对照组死亡率低于50%,表示感染菌株毒力太小,应增加感染菌液量或另选毒力大的菌株。

,将装入试管内的称为“斜面琼脂培养基”,一般用于菌种的培养或保藏;将装入锥形烧瓶或培养皿内的称为“平板琼脂培养基”,多用于菌种分离。

培养皿倒放,可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下,冲散菌落。


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