实验二十三 凝胶层析分离血红蛋白和核黄素
【目的】
1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2. 熟悉凝胶层析的操作过程。
【原理】
凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时, 由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用, 分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。
【器材】
分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶 、刻度吸管 、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸 、铅笔 、玻璃棉或海绵垫。
【试剂】
1．葡聚糖凝胶SephadexG-25 或SephadexG-50
2．核黄素饱和水溶液
3．生理盐水
4．甲苯
5．血红蛋白溶液
取抗凝血2ml 置离心管中，2000r/min离心10min ，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4ml ，振摇洗涤，2000r/min离心10min ，弃去上清液，共洗涤三次。向沉淀加入蒸馏水2ml ，混匀，再加入甲苯1 ml，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。2000r/min离心10min ，取上清血红蛋白溶液备用。
6．0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）
取0．1mol/L磷酸氢二钠720ml 和0．1mol/L磷酸二氢钠280ml, 混匀。
【操作】
1. 凝胶准备
称取SephadexG-25 5g或SephadexG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml ，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时），用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。
2. 装柱
取直径0.8～1.2cm 长25～30cm 的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm 高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm 时为止。关闭层析柱出口，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm 高的缓冲液。
3. 样品制备
将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比) 混匀。
4. 加样
打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5ml, 在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液，约1cm 高。加样不可过多，以免分离不完全。
5. 洗脱
将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口，使细玻璃管的下端插入液面，但不可接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使其略高于层析柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密闭状态。打开下口瓶出口，然后打开层析柱出口, 使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4～6滴/min的流速。洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。
6. 收集
随着层析的进行，凝胶床将出现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，核黄素区带在上。当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约1ml ，直到流出液变为无色为止，约需收集5～6管；以同样方法收集核黄素。
7. 测定
在540nm 波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋白和核黄素各管吸光度。
【结果及分析】
以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。分析实验结果并说明原因。
【思考题】
1．比较凝胶层析与分配层析在实验原理上的区别。
2．要使凝胶床达到实验要求，需注意哪些操作？
实验二十三 凝胶层析分离血红蛋白和核黄素
【目的】
1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2. 熟悉凝胶层析的操作过程。
【原理】
凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时, 由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用, 分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。
【器材】
分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶 、刻度吸管 、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸 、铅笔 、玻璃棉或海绵垫。
【试剂】
1．葡聚糖凝胶SephadexG-25 或SephadexG-50
2．核黄素饱和水溶液
3．生理盐水
4．甲苯
5．血红蛋白溶液
取抗凝血2ml 置离心管中，2000r/min离心10min ，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4ml ，振摇洗涤，2000r/min离心10min ，弃去上清液，共洗涤三次。向沉淀加入蒸馏水2ml ，混匀，再加入甲苯1 ml，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。2000r/min离心10min ，取上清血红蛋白溶液备用。
6．0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）
取0．1mol/L磷酸氢二钠720ml 和0．1mol/L磷酸二氢钠280ml, 混匀。
【操作】
1. 凝胶准备
称取SephadexG-25 5g或SephadexG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml ，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时），用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。
2. 装柱
取直径0.8～1.2cm 长25～30cm 的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm 高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm 时为止。关闭层析柱出口，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm 高的缓冲液。
3. 样品制备
将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比) 混匀。
4. 加样
打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5ml, 在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液，约1cm 高。加样不可过多，以免分离不完全。
5. 洗脱
将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口，使细玻璃管的下端插入液面，但不可接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使其略高于层析柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密闭状态。打开下口瓶出口，然后打开层析柱出口, 使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4～6滴/min的流速。洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。
6. 收集
随着层析的进行，凝胶床将出现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，核黄素区带在上。当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约1ml ，直到流出液变为无色为止，约需收集5～6管；以同样方法收集核黄素。
7. 测定
在540nm 波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋白和核黄素各管吸光度。
【结果及分析】
以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。分析实验结果并说明原因。
【思考题】
1．比较凝胶层析与分配层析在实验原理上的区别。
2．要使凝胶床达到实验要求，需注意哪些操作？