抗菌药物筛选的实验方法与技术
博哥
(中山大学化学与化学工程学院，广州 510275)
摘要 为了筛选出活性更好的抗菌药物，本实验采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC 50来评定药物活性。结果显示，样品1（环丙沙星）对二者有杀菌作用，最小抗菌浓度都为1.56 μmol ·L -1。样品30仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol ·L -1。样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺) ，IC 50值为1.72 μmol ·L -1。样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC 50值分别为11.04 μmol ·L -1 和24.44 μmol ·L -1。 关键词 抗菌药物筛选 体外实验 微量稀释法
1 引言
一个新的化合物或分离提取的有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实。一般采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用。药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。因此，体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。但是，体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。 本实验进行微生物培养基的配置、灭菌与接种等操作，以熟悉细菌培养的过程，并采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC 50来评定药物活性。
2实验部分
2.1药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、胰蛋白胨、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液、DMSO 以44种化合物(见表1) 。
表1 44种化合物与对应编号
2.2材料与仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、96孔板、酶标仪、恒温箱、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH 试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸。
2.3实验方法
2.3.1玻璃器皿的洗涤和包装
将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。培养皿由一盖一底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成—包、或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。(已由实验室完成)
2.3.2固体培养基的配制过程 表2 固体培养基药品与用量
药品 用量
牛肉膏 0.5g
蛋白胨 1g
NaCl 0.5g
琼脂 1.5-2g
水 100ml
pH 7.2
(1)称量及溶化：分别称取蛋白胨相NaCl 的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 (2)调pH ：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH 至7.2。 (3)定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 (4)固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。 (5)分装、加塞、包扎。
(6)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 2.3.3棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎
制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不室过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。 2.3.4培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa 灭菌20min 。灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。 2.3.5斜面和平板的制作
(1)斜面的制作：将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面，斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应
垂直放置至冷凝。
(2)平板的制作：将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷李50°C 左右倾入无菌培养皿中。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12 ml的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。 2.3.6斜面培养基接种
(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别持菌种相待接种的培养基管，使菌种管口位前，待接种培养基管口位后，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结的水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。 (2)右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌，待冷。
(3)以有手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰灭菌。 (4)以灭菌并冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上沾取菌苔少许，退出菌种管，再迅速移入待接种的培养基管，自斜面底部轻轻向顶端婉蜒划线或在斜面作上下轻轻涂布，切勿划破培养基表面。沾菌的接种环进出试管时，均不应触及试管内壁及管口。
(5)接种完毕，重新烧红接种环灭菌后插入试管架上。两管管口迅速通过火焰2-3次，塞回棉塞。 (6)将接种管置37℃温箱培养18-24小时后观察生长情况。 2.3.7微量稀释法体外抗菌实验 (1) 抗菌化合物的初步筛选
选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，取96孔培养板一块，在超净工作台内，酒精灯下，用无菌的连续移液器按表3加样，DMSO 的最终浓度保持在1%，样品最终浓度为200 μmol/L，每个样品设两个平行孔。震荡混合后37℃培养12h-18h, ，再用酶标仪630nm 侧吸光度。。 A B C D E F G H
1
培养液200μl 培养液200μl 培养液200μl 培养液200μl 菌对照(2μl DMSO) 菌对照(2μl DMSO) 菌对照(2μl DMSO) 菌对照(2μl DMSO)
表3 初步筛选加样方式 2 3 4 5 6 7
2 3 4 5 6 样品1
2 3 4 5 6 样品1
样品12 13 14 15 16 17 样品12 13 14 15 16 17 样品23 24 25 26 27 28 样品23 24 25 26 27 28 样品34 35 36 37 38 39 样品34 35 36 37 38 39
8 7 7 18 18 29 29 40 40
9 8 8 19 19 30 30 41 41
10 9 9 20 20 31 31 42 42
11 10 10 21 21 32 32 43 43
12 11 11 22 22 33 33 44 44
(2) 最小抑菌浓度或IC 50的测试
从上述筛选中选出11种抑制较好的化合物，用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC 50，培养板样品的加入方法与表3类似，第1列相同，第2列到12列为选出的11个化合物，以2倍进
行稀释
3结果分析与讨论
3.1数据记录
表4 大肠杆菌药物初步筛选结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.060 0.103 0.055 0.007 0.035 0.000 0.037 0.032 0.013 0.006 0.085 0.061 B -0.069 -0.064 0.047 0.001 0.054 -0.027 0.046 0.061 0.032 -0.001 0.048 0.031 C -0.100 -0.006 -0.010 -0.055 0.016 0.581 -0.001 -0.007 -0.063 -0.028 -0.025 -0.009 D -0.060 -0.003 0.061 0.049 0.284 -0.022 -0.043 -0.011 -0.053 -0.011 0.003 -0.015 E 0.069 -0.012 -0.049 0.017 -0.047 -0.024 -0.027 -0.015 -0.065 -0.052 0.067 0.002 F 0.048 -0.035 -0.055 -0.027 -0.043 0.038 -0.037 -0.009 -0.056 -0.057 0.017 0.008 G 0.088 0.004 0.057 0.026 -0.039 0.037 0.041 0.118 0.220 -0.025 -0.016 0.015 H 0.084 0.110 0.064 0.069 0.018 0.086 0.074 0.109 0.171 -0.065 0.109 0.039
表5 金黄色葡萄球菌药物初步筛选结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.087 0.059 0.002 -0.030 0.009 -0.049 0.010 0.009 -0.011 -0.022 0.012 0.022 B -0.092 0.064 0.007 0.017 0.008 0.053 0.043 -0.005 0.015 -0.007 0.008 0.119 C -0.117 -0.024 -0.013 0.029 -0.023 -0.017 -0.010 0.009 -0.078 -0.054 -0.002 0.034 D -0.083 -0.012 0.039 -0.001 0.025 -0.019 -0.062 -0.058 -0.066 -0.047 -0.008 0.006 E 0.048 0.027 -0.048 -0.007 -0.039 0.057 -0.043 -0.037 -0.079 -0.072 0.057 0.022 F 0.058 -0.032 -0.034 0.009 -0.002 -0.005 -0.047 -0.024 -0.069 -0.048 0.071 0.030 G 0.149 0.021 0.049 -0.034 -0.017 0.023 -0.011 0.219 0.484 -0.075 0.107 0.034 H 0.123 0.149 0.144 0.093 0.081 0.089 0.086 0.101 0.067 -0.077 0.039 0.413
根据初步筛选结果，对大肠杆菌有较好抑制活性的化合物有样品1、17、19、20、23、24、26、28、30、31和42，对金黄色葡萄球菌有较好抑制活性的化合物有样品1、9、17、19、20、24、26、28、30、31和42，将选出的化合物用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC 50。
表6 大肠杆菌最小抑菌浓度或IC 50的测试
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.030 -0.026 0.049 0.008 0.049 0.023 -0.046 0.039 -0.043 -0.036 0.009 -0.055 B -0.045 -0.044 0.042 -0.030 -0.014 0.117 -0.055 0.009 -0.047 -0.033 -0.018 -0.075 C -0.107 -0.105 -0.067 -0.092 -0.069 -0.098 -0.107 -0.055 -0.081 -0.077 -0.047 0.360 D -0.038 -0.038 -0.009 -0.023 -0.012 -0.023 -0.033 -0.032 -0.039 -0.031 -0.013 0.025 E 0.050 -0.043 -0.002 -0.026 -0.022 -0.024 -0.035 -0.042 -0.050 -0.024 -0.009 0.115 F 0.035 -0.057 0.049 0.048 0.022 0.014 -0.014 -0.015 -0.034 -0.018 -0.010 0.027 G 0.069 -0.038 0.058 0.055 0.041 0.006 0.010 0.009 -0.005 -0.021 -0.003 0.064 H 0.066 -0.067 0.000 0.043 0.088 0.107 0.012 0.045 -0.009 -0.020 0.010 0.052
表7 金黄色葡萄球最小抑菌浓度或IC 50的测试
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.025 -0.016 0.031 0.044 0.006 0.050 -0.031 0.078 0.025 0.018 0.016 -0.030 B -0.046 -0.032 0.017 0.003 0.000 0.019 -0.010 0.050 0.033 0.015 -0.011 -0.038 C -0.093 -0.093 -0.048 -0.063 -0.043 -0.046 -0.059 -0.022 -0.010 -0.035 -0.020 -0.035 D -0.042 -0.034 -0.003 -0.028 -0.016 -0.031 -0.035 -0.026 -0.033 -0.046 0.003 0.029 E 0.048 -0.035 0.001 -0.011 0.012 -0.018 -0.038 -0.030 -0.042 -0.039 -0.005 0.014 F 0.039 -0.052 -0.001 -0.052 -0.052 -0.027 -0.003 -0.037 -0.032 -0.042 0.005 0.018 G 0.051 -0.033 0.061 -0.045 -0.043 0.033 0.054 0.036 0.017 0.012 0.014 0.011 H 0.065 -0.059 0.097 -0.069 -0.062 0.111
0.129 0.080 0.094 0.015 0.044 0.085
3.2数据处理与分析
3.2.1 大肠杆菌药物筛选
从表6中可以看出第2组(样品1) 和第10组(样品30) 的数据全是负值且与空白值接近，证明在每一个浓度下，大肠杆菌都不能生长，所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L，如果需要找出更准确的最小抑菌浓度，样品需要进一步稀释。其他组化合物，不同稀释浓度样品测试结果出现规律性上升，因此作图找出IC 50。由于第6、11、12组数据波动较大，剔除。数据处理如下： 1．将（菌对照值 - 培养液值）/100 定为100%
2．样品抑菌率 = [1-（样品1值 - 培养液值）/（菌对照值 - 培养液值）] × 100
3．用样品浓度为横坐标，样品抑菌率为纵坐标作图，可以求出抑菌率为一半时的样品浓度IC 50.
表8 大肠杆菌药物筛选抑菌率与IC 50
浓度/μmol ·L -1
200 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5625
样品17 5.455 11.818 110.909 58.182 51.818 5.455 -2.727 50.000
样品19 42.727 77.273 133.636 70.909 73.636 6.364 0.000 10.909
样品20 5.455 62.727 112.727 60.909 70.000 30.000 12.727 -30.000
样品24 91.818 100.000 147.273 80.000 81.818 62.727 40.909 39.091
样品26 14.545 41.818 100.000 79.091 88.182 63.636 41.818 9.091
样品28 89.091 92.727 123.636 85.455 95.455 80.909 54.545 58.182
b a c t e r i c i d e r a t e
b a c t e r i c i d e r a t e
c/μmol·L c/
μmol·L -1
b a c t e r i c i d e r a t e
c/μmol·L -1
图1 大肠杆菌抑菌率-浓度曲线
3.2.2 金黄色葡萄球菌药物筛选
从表7中可以看出第2组(样品1) 数据全是负值且与空白值接近，证明在每一个浓度下，大肠杆菌都不能生长，所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L，如果需要找出更准确的最小抑菌浓度，样品需要进一步稀释。11、12组化合物，不同稀释浓度样品测试结果出现规律性上升，因此作图找出IC 50。
数据处理步骤与3.2.1相同，结果如下：
表9 金黄色葡萄球菌药物筛选抑菌率 浓度/μmol ·L -1
200 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5625
样品31 33.333 59.804 68.627 46.078 53.922 44.118 35.294 5.882
样品42 78.431 86.275 83.333 20.588 35.294 31.373 38.235 -34.314
b a c t e r i c i d e r a t e
c/μmol·L -1
图2 金黄色葡萄球菌抑菌率-浓度曲线
表10 抗菌药物筛实验结果
样品1 (环丙沙星)
样品17 (苯甲基-N-苯基亚胺) 样品19 (4-羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺)
样品20 (2-羟基苯甲基-N-3,5-二苯基亚胺)
样品24 (苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
样品26 (4-羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
样品28 (2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
样品30 (2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺) 样品31 (4-羟基苯甲基-N-3-羟基苯基亚胺)
样品42 (4-硝基-2',5'-二羟基偶氮苯)
----
----
----
24.44
----
----
----
11.04
1.56
----
----
----
----
1.72
----
----
----
4.72
----
----
----
5.19
----
----
----
22.71
----
----
大肠杆菌最小抑
-1
大肠杆菌
---- 15.84 12.06
金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度/μmol ·L
1.56 ----
-1
金黄色葡萄球菌IC 50
---- ---- ----
菌浓度/μmol ·L IC 50
1.56 ---- ----
3.2讨论
实验数据的波动教大，部分组数据并没有规律，可能由以下原因造成：
1. 实验由多个同学完成，每个同学操作不习惯不一样，造成的误差不同，导致的误差。 2. 操作不当，或无菌环境不够彻底，导致的细菌污染。 3. 微量稀释时操作不当，导致样品、酶液、细菌量不准确。
4结论
采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC 50。结果显示，样品1（环丙沙星）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol ·L -1。样品30（2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺）仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol ·L -1。样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺) ，IC 50值为1.72 μmol ·L -1。样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC 50值分别为11.04 μmol ·L -1 和24.44 μmol ·L -1。
5感想与体会
通过这次实验学到了很多化学生物学方面知识，例如，培养基的制作，灭菌，细菌的接种和培养等，还学习了如何通过体外实验快速，经济地筛选出具有较好活性的抗菌药物。抗菌药物筛选操作过程，对于无菌环境要求非常严格，要避免其他菌种干扰实验，此外对于细菌的状态也有要求，必须是处于对数生长期，否则实验结果不准确。当然，操作的准确性也影响着实验结果，这是每次实验都必不可少的。在这次实验中还使用了一些以前未使用过的仪器，例如，酶标仪，超净工作台等，丰富了见识。相信通过这次实验，能丰富我们化学生物学方面的知识，对于药物的筛选也有更深入了解。
参考文献
1．化学生物学讲义-现代1抗菌药物筛选的实验方法与技术
抗菌药物筛选的实验方法与技术
博哥
(中山大学化学与化学工程学院，广州 510275)
摘要 为了筛选出活性更好的抗菌药物，本实验采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC 50来评定药物活性。结果显示，样品1（环丙沙星）对二者有杀菌作用，最小抗菌浓度都为1.56 μmol ·L -1。样品30仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol ·L -1。样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺) ，IC 50值为1.72 μmol ·L -1。样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC 50值分别为11.04 μmol ·L -1 和24.44 μmol ·L -1。 关键词 抗菌药物筛选 体外实验 微量稀释法
1 引言
一个新的化合物或分离提取的有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实。一般采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用。药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。因此，体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。但是，体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。 本实验进行微生物培养基的配置、灭菌与接种等操作，以熟悉细菌培养的过程，并采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC 50来评定药物活性。
2实验部分
2.1药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、胰蛋白胨、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液、DMSO 以44种化合物(见表1) 。
表1 44种化合物与对应编号
2.2材料与仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、96孔板、酶标仪、恒温箱、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH 试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸。
2.3实验方法
2.3.1玻璃器皿的洗涤和包装
将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。培养皿由一盖一底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成—包、或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。(已由实验室完成)
2.3.2固体培养基的配制过程 表2 固体培养基药品与用量
药品 用量
牛肉膏 0.5g
蛋白胨 1g
NaCl 0.5g
琼脂 1.5-2g
水 100ml
pH 7.2
(1)称量及溶化：分别称取蛋白胨相NaCl 的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 (2)调pH ：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH 至7.2。 (3)定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 (4)固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。 (5)分装、加塞、包扎。
(6)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 2.3.3棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎
制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不室过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。 2.3.4培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa 灭菌20min 。灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。 2.3.5斜面和平板的制作
(1)斜面的制作：将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面，斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应
垂直放置至冷凝。
(2)平板的制作：将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷李50°C 左右倾入无菌培养皿中。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12 ml的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。 2.3.6斜面培养基接种
(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别持菌种相待接种的培养基管，使菌种管口位前，待接种培养基管口位后，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结的水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。 (2)右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌，待冷。
(3)以有手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰灭菌。 (4)以灭菌并冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上沾取菌苔少许，退出菌种管，再迅速移入待接种的培养基管，自斜面底部轻轻向顶端婉蜒划线或在斜面作上下轻轻涂布，切勿划破培养基表面。沾菌的接种环进出试管时，均不应触及试管内壁及管口。
(5)接种完毕，重新烧红接种环灭菌后插入试管架上。两管管口迅速通过火焰2-3次，塞回棉塞。 (6)将接种管置37℃温箱培养18-24小时后观察生长情况。 2.3.7微量稀释法体外抗菌实验 (1) 抗菌化合物的初步筛选
选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，取96孔培养板一块，在超净工作台内，酒精灯下，用无菌的连续移液器按表3加样，DMSO 的最终浓度保持在1%，样品最终浓度为200 μmol/L，每个样品设两个平行孔。震荡混合后37℃培养12h-18h, ，再用酶标仪630nm 侧吸光度。。 A B C D E F G H
1
培养液200μl 培养液200μl 培养液200μl 培养液200μl 菌对照(2μl DMSO) 菌对照(2μl DMSO) 菌对照(2μl DMSO) 菌对照(2μl DMSO)
表3 初步筛选加样方式 2 3 4 5 6 7
2 3 4 5 6 样品1
2 3 4 5 6 样品1
样品12 13 14 15 16 17 样品12 13 14 15 16 17 样品23 24 25 26 27 28 样品23 24 25 26 27 28 样品34 35 36 37 38 39 样品34 35 36 37 38 39
8 7 7 18 18 29 29 40 40
9 8 8 19 19 30 30 41 41
10 9 9 20 20 31 31 42 42
11 10 10 21 21 32 32 43 43
12 11 11 22 22 33 33 44 44
(2) 最小抑菌浓度或IC 50的测试
从上述筛选中选出11种抑制较好的化合物，用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC 50，培养板样品的加入方法与表3类似，第1列相同，第2列到12列为选出的11个化合物，以2倍进
行稀释
3结果分析与讨论
3.1数据记录
表4 大肠杆菌药物初步筛选结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.060 0.103 0.055 0.007 0.035 0.000 0.037 0.032 0.013 0.006 0.085 0.061 B -0.069 -0.064 0.047 0.001 0.054 -0.027 0.046 0.061 0.032 -0.001 0.048 0.031 C -0.100 -0.006 -0.010 -0.055 0.016 0.581 -0.001 -0.007 -0.063 -0.028 -0.025 -0.009 D -0.060 -0.003 0.061 0.049 0.284 -0.022 -0.043 -0.011 -0.053 -0.011 0.003 -0.015 E 0.069 -0.012 -0.049 0.017 -0.047 -0.024 -0.027 -0.015 -0.065 -0.052 0.067 0.002 F 0.048 -0.035 -0.055 -0.027 -0.043 0.038 -0.037 -0.009 -0.056 -0.057 0.017 0.008 G 0.088 0.004 0.057 0.026 -0.039 0.037 0.041 0.118 0.220 -0.025 -0.016 0.015 H 0.084 0.110 0.064 0.069 0.018 0.086 0.074 0.109 0.171 -0.065 0.109 0.039
表5 金黄色葡萄球菌药物初步筛选结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.087 0.059 0.002 -0.030 0.009 -0.049 0.010 0.009 -0.011 -0.022 0.012 0.022 B -0.092 0.064 0.007 0.017 0.008 0.053 0.043 -0.005 0.015 -0.007 0.008 0.119 C -0.117 -0.024 -0.013 0.029 -0.023 -0.017 -0.010 0.009 -0.078 -0.054 -0.002 0.034 D -0.083 -0.012 0.039 -0.001 0.025 -0.019 -0.062 -0.058 -0.066 -0.047 -0.008 0.006 E 0.048 0.027 -0.048 -0.007 -0.039 0.057 -0.043 -0.037 -0.079 -0.072 0.057 0.022 F 0.058 -0.032 -0.034 0.009 -0.002 -0.005 -0.047 -0.024 -0.069 -0.048 0.071 0.030 G 0.149 0.021 0.049 -0.034 -0.017 0.023 -0.011 0.219 0.484 -0.075 0.107 0.034 H 0.123 0.149 0.144 0.093 0.081 0.089 0.086 0.101 0.067 -0.077 0.039 0.413
根据初步筛选结果，对大肠杆菌有较好抑制活性的化合物有样品1、17、19、20、23、24、26、28、30、31和42，对金黄色葡萄球菌有较好抑制活性的化合物有样品1、9、17、19、20、24、26、28、30、31和42，将选出的化合物用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC 50。
表6 大肠杆菌最小抑菌浓度或IC 50的测试
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.030 -0.026 0.049 0.008 0.049 0.023 -0.046 0.039 -0.043 -0.036 0.009 -0.055 B -0.045 -0.044 0.042 -0.030 -0.014 0.117 -0.055 0.009 -0.047 -0.033 -0.018 -0.075 C -0.107 -0.105 -0.067 -0.092 -0.069 -0.098 -0.107 -0.055 -0.081 -0.077 -0.047 0.360 D -0.038 -0.038 -0.009 -0.023 -0.012 -0.023 -0.033 -0.032 -0.039 -0.031 -0.013 0.025 E 0.050 -0.043 -0.002 -0.026 -0.022 -0.024 -0.035 -0.042 -0.050 -0.024 -0.009 0.115 F 0.035 -0.057 0.049 0.048 0.022 0.014 -0.014 -0.015 -0.034 -0.018 -0.010 0.027 G 0.069 -0.038 0.058 0.055 0.041 0.006 0.010 0.009 -0.005 -0.021 -0.003 0.064 H 0.066 -0.067 0.000 0.043 0.088 0.107 0.012 0.045 -0.009 -0.020 0.010 0.052
表7 金黄色葡萄球最小抑菌浓度或IC 50的测试
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A -0.025 -0.016 0.031 0.044 0.006 0.050 -0.031 0.078 0.025 0.018 0.016 -0.030 B -0.046 -0.032 0.017 0.003 0.000 0.019 -0.010 0.050 0.033 0.015 -0.011 -0.038 C -0.093 -0.093 -0.048 -0.063 -0.043 -0.046 -0.059 -0.022 -0.010 -0.035 -0.020 -0.035 D -0.042 -0.034 -0.003 -0.028 -0.016 -0.031 -0.035 -0.026 -0.033 -0.046 0.003 0.029 E 0.048 -0.035 0.001 -0.011 0.012 -0.018 -0.038 -0.030 -0.042 -0.039 -0.005 0.014 F 0.039 -0.052 -0.001 -0.052 -0.052 -0.027 -0.003 -0.037 -0.032 -0.042 0.005 0.018 G 0.051 -0.033 0.061 -0.045 -0.043 0.033 0.054 0.036 0.017 0.012 0.014 0.011 H 0.065 -0.059 0.097 -0.069 -0.062 0.111
0.129 0.080 0.094 0.015 0.044 0.085
3.2数据处理与分析
3.2.1 大肠杆菌药物筛选
从表6中可以看出第2组(样品1) 和第10组(样品30) 的数据全是负值且与空白值接近，证明在每一个浓度下，大肠杆菌都不能生长，所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L，如果需要找出更准确的最小抑菌浓度，样品需要进一步稀释。其他组化合物，不同稀释浓度样品测试结果出现规律性上升，因此作图找出IC 50。由于第6、11、12组数据波动较大，剔除。数据处理如下： 1．将（菌对照值 - 培养液值）/100 定为100%
2．样品抑菌率 = [1-（样品1值 - 培养液值）/（菌对照值 - 培养液值）] × 100
3．用样品浓度为横坐标，样品抑菌率为纵坐标作图，可以求出抑菌率为一半时的样品浓度IC 50.
表8 大肠杆菌药物筛选抑菌率与IC 50
浓度/μmol ·L -1
200 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5625
样品17 5.455 11.818 110.909 58.182 51.818 5.455 -2.727 50.000
样品19 42.727 77.273 133.636 70.909 73.636 6.364 0.000 10.909
样品20 5.455 62.727 112.727 60.909 70.000 30.000 12.727 -30.000
样品24 91.818 100.000 147.273 80.000 81.818 62.727 40.909 39.091
样品26 14.545 41.818 100.000 79.091 88.182 63.636 41.818 9.091
样品28 89.091 92.727 123.636 85.455 95.455 80.909 54.545 58.182
b a c t e r i c i d e r a t e
b a c t e r i c i d e r a t e
c/μmol·L c/
μmol·L -1
b a c t e r i c i d e r a t e
c/μmol·L -1
图1 大肠杆菌抑菌率-浓度曲线
3.2.2 金黄色葡萄球菌药物筛选
从表7中可以看出第2组(样品1) 数据全是负值且与空白值接近，证明在每一个浓度下，大肠杆菌都不能生长，所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L，如果需要找出更准确的最小抑菌浓度，样品需要进一步稀释。11、12组化合物，不同稀释浓度样品测试结果出现规律性上升，因此作图找出IC 50。
数据处理步骤与3.2.1相同，结果如下：
表9 金黄色葡萄球菌药物筛选抑菌率 浓度/μmol ·L -1
200 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5625
样品31 33.333 59.804 68.627 46.078 53.922 44.118 35.294 5.882
样品42 78.431 86.275 83.333 20.588 35.294 31.373 38.235 -34.314
b a c t e r i c i d e r a t e
c/μmol·L -1
图2 金黄色葡萄球菌抑菌率-浓度曲线
表10 抗菌药物筛实验结果
样品1 (环丙沙星)
样品17 (苯甲基-N-苯基亚胺) 样品19 (4-羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺)
样品20 (2-羟基苯甲基-N-3,5-二苯基亚胺)
样品24 (苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
样品26 (4-羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
样品28 (2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
样品30 (2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺) 样品31 (4-羟基苯甲基-N-3-羟基苯基亚胺)
样品42 (4-硝基-2',5'-二羟基偶氮苯)
----
----
----
24.44
----
----
----
11.04
1.56
----
----
----
----
1.72
----
----
----
4.72
----
----
----
5.19
----
----
----
22.71
----
----
大肠杆菌最小抑
-1
大肠杆菌
---- 15.84 12.06
金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度/μmol ·L
1.56 ----
-1
金黄色葡萄球菌IC 50
---- ---- ----
菌浓度/μmol ·L IC 50
1.56 ---- ----
3.2讨论
实验数据的波动教大，部分组数据并没有规律，可能由以下原因造成：
1. 实验由多个同学完成，每个同学操作不习惯不一样，造成的误差不同，导致的误差。 2. 操作不当，或无菌环境不够彻底，导致的细菌污染。 3. 微量稀释时操作不当，导致样品、酶液、细菌量不准确。
4结论
采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC 50。结果显示，样品1（环丙沙星）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol ·L -1。样品30（2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺）仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol ·L -1。样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺) ，IC 50值为1.72 μmol ·L -1。样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC 50值分别为11.04 μmol ·L -1 和24.44 μmol ·L -1。
5感想与体会
通过这次实验学到了很多化学生物学方面知识，例如，培养基的制作，灭菌，细菌的接种和培养等，还学习了如何通过体外实验快速，经济地筛选出具有较好活性的抗菌药物。抗菌药物筛选操作过程，对于无菌环境要求非常严格，要避免其他菌种干扰实验，此外对于细菌的状态也有要求，必须是处于对数生长期，否则实验结果不准确。当然，操作的准确性也影响着实验结果，这是每次实验都必不可少的。在这次实验中还使用了一些以前未使用过的仪器，例如，酶标仪，超净工作台等，丰富了见识。相信通过这次实验，能丰富我们化学生物学方面的知识，对于药物的筛选也有更深入了解。
参考文献
1．化学生物学讲义-现代1抗菌药物筛选的实验方法与技术