好实沃乳酸菌专栏
鸡源粪肠球菌的分离鉴定
杜志琳尹望
北京好实沃生物技术有限公司，北京101399
张艳萍
李雪平
试验选择9日龄健康肉仔鸡的肠道内容物，利用肠球菌琼脂培养基分离获得12株疑似肠球菌
的细菌。通过对12株菌的生态特征、培养和生理生化特征的测定，筛选3株疑似粪肠球菌的菌株进行16S
摘
要
rDNA分子鉴定，最终获得3株粪肠球菌，命名为HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12。为禽用微生态制剂的研制提供菌种来源。
关键词
粪肠球菌；分离鉴定；益生菌
文献标志码：A
文章编号：1002－2813（2015）15－0008－03
中图分类号：S858.31
DOI编号：10.13557/j.cnki.issn1002－2813.2015.15.003随着人们对抗生素滥用的弊端日益重视，益生菌的研制得到了人们的关注和欢迎。在饲料、农业、食品和医药保健等领域均有广泛应用，有着“患病治病，未病防病，无病保健”的优点，且绿色、安全及无残留，发展前景十分广阔。
研制益生菌制剂关键问题在于菌株筛选，粪肠球菌作为动物和人类肠道内的常居菌，通过长期进化与宿主形成共生关系，能够更好的适应动物体内环境，维持动物肠道菌群平衡，达到防治疾病的效1999）。1989年，粪肠球菌就被美国果（杨洁彬等，
FDA公布为可直接作用于动物的菌种之一。我国农业部2008年颁布的饲料添加剂品种目录中，粪肠球菌也包含在内。相对于严格厌氧的双歧杆菌，兼性厌氧的粪肠球菌更适合生产与应用（李梅等，2007）。粪肠球菌代谢分泌大量乳酸，可降低肠道pH，还能产生细菌素等抑菌物质，抑制沙门菌及大肠杆菌等致病菌的生长，改善肠道环境（王锂韫等，2006），保持机体健康。试验从健康肉仔鸡肠道内容物中筛选分离鸡源粪肠球菌，为禽用微生态饲料添加剂的研制奠定基础。
收稿日期：2015－06－29
第一作者：张艳萍，E－mail：[email protected]通信作者：尹望，E－mail：yinwang2010@163.
com
1
1.1
材料与方法
试验材料分离材料
1.1.1
9日龄健康肉仔鸡取自北京某养鸡场。1.1.2菌种
粪肠球菌HEW－A102由北京好实沃生物技术有限公司提供，作为生理生化鉴定中的模式菌株，在MＲS培养基上培养。1.1.3主要培养基和试剂
细菌基因组DNA提取试剂十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）及三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱等均为进口试剂，粪肠球菌16SrDNAPCＲ扩展引物PrimedA：5'－AGAGTTT-GATCATGGCTCAG－3'和PrimedB：5'－TAGGGT-TACCTTGTTACGACTT－3'由上海生工生物工程有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶均购自上海生工生物工程有限公司；肠球菌琼脂，MＲS培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，LB培养基等；其他试剂均为国产分析纯试剂。1.1.4
试验仪器
JA2003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HZC－250型恒温振荡培养箱（江苏省太
仓市实验设备厂）；PB－10型数字酸度计（德国赛
8
饲料研究FEEDＲESEAＲCHNO．15，2015
好实沃乳酸菌专栏
多利斯科学仪器（北京）有限公司）；MG48+型PCＲ仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；T－42K型高速冷冻离心机（德国KONTＲON公司）；GelDoc－It200型自动凝胶图像分析系统（Ultra－VioletProd-uctsLtd公司）。1.21.2.1
试验方法
粪肠球菌的分离纯化
取健康9日龄肉仔鸡肠道内容物，剖开，用无
分离，获得12株疑似肠球菌的菌株，并对这12株菌分别编号为HEW－S01、HEW－S02、……、HEW－S11和HEW－S12。以上12株细菌在MＲS平板上的菌落形态基本一致：乳白色，圆形，表面隆起，边缘整齐，直径0.5～1.5mm。革兰染色均呈阳性，无芽孢，菌体呈卵圆形，单个、成对或短链排列。图1为HEW－S05的菌落特征及显微形态
。
菌棉拭子从肠道内壁采集样品，用灭菌氯化钠注射
－5－3－4
液10倍逐级稀释到10，分别取10、10和10－5各100μL涂布于肠球菌琼脂培养基平板上，37℃培养1～2d后，挑取带棕色环的棕黑色菌落，在MＲS平板上划线分离纯化。纯化后的菌株转接至MＲS斜面上纯培养，于4℃冰箱保存备用。1.2.2
生理生化鉴定
主要检测项目：革兰染色，接触酶，精氨酸双
注：A为HEW－S05革兰染色形态，B为其在MＲS培养基上生长40h的单菌落形态。
图1
HEW－S05菌落特征及显微形态
水解酶，10、45和50℃生长，耐6.5%氯化钠，耐0.04%亚碲酸钾，葡萄糖氧化发酵及糖醇利用等生理生化试验。参照东秀珠等（2001）的《常见细菌系统鉴定手册》和布坎南等（1984）《伯杰氏系统鉴定手册》中的粪肠球菌的生理生化鉴定试验要求进行鉴定。
1.2.316SrDNA分子鉴定
参照姜云等（2012）的方法，采用CTAB法提取粪肠球菌基因组DNA。利用引物PrimedA和PrimedB对疑似粪肠球菌的16SrDNA基因片段进行PCＲ扩增分析，PCＲ反应体系（25μL）及扩增程序见表1，反应结束后，取5μLPCＲ产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，回收纯化所得PCＲ产物送往上海生工进行16SrDNA测序，利用BLAST分析所得16SrDNA序列的基因归属，并用MEGA5.0软件构建系统发育树对目的菌株进行分析。
表1
引物PrimedA引物PrimedBTaqDNA聚合酶10×TaqbufferMg2+（25mmoL/L）菌株基因组DNA
粪肠球菌的PCＲ反应体系及扩增程序
扩增程序
94℃预变性94℃变性53℃退火复性72℃延伸共30个循环72℃终延伸
5min1min1min1min30s10min
1.0μL1.0μL1.5U2.5μL1.5μL50ng
PCＲ反应体系（25μL）
2.2
生理生化鉴定结果
12株疑似肠球菌的菌株接触酶反应皆为阴性，
葡萄糖发酵不产气，均能在10和45℃生长，且可耐受6.5%氯化钠；详细的生理生化检测结果见表2。通过与粪肠球菌模式菌株对比，可初步鉴定HEW－S05、HEW－S09及HEW－S12为粪肠球菌。
表2
鉴定项目革兰染色接触酶10℃生长45℃生长50℃生长耐NaCl6.5%亚碲酸钾0.04%精氨酸双水解酶产气发酵葡萄糖乳糖蔗糖木糖棉籽糖蜜二糖鼠李糖甘油甘露醇山梨醇阿东醇
12株疑似肠球菌菌株的主要生理生化特征
粪肠
S01S02S03S04S05S06S07S08S09S10S11S12球菌+－++－+++－+++－－－++++－
+－++++－+－+++－－－－++－－
+－++－++－－+++++++－+－－
+－++－+－+－+++－－－－－++－
+－++－+－+－+++－－+－－++－
+－++－+++－+++－－－++++－
+－++++++－+++－－－－++－－
+－++－+++－+++－++－+++－
+－++++－+－+++－－－+－+－－
+－++－+++－+++－－－++++－
+－++－+－－－+++－++++++－
+－++++－+－+++－－－－－+－－
+－++－+++－+++－－－++++－
2
2.1
结果与分析
细菌形态特征
通过肠球菌琼脂对肉仔鸡肠道内容物进行细菌
饲料研究FEEDＲESEAＲCHNO．15，2015
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好实沃乳酸菌专栏
2.3
16SrDNA分子鉴定结果
通过CTAB法提取获得菌株HEW－S05、HEW－性能，必须经过竞争、定植和排斥等过程在动物体内存活，而内源微生物因其同源性，能够快速在肠道内定植，平衡肠道菌群，发挥益生效果。因此，优良的益生菌应是从动物体内分离获得，而每种动物的的肠道菌群也有所不同，从动物体内分离得到的益生菌，应使用在和其同源的动物身上，这样才1989；郭本恒，能发挥最大的益生效果（Fuller等，
2004）。试验通过肠球菌琼脂从健康肉仔鸡肠道内容物中分离获得12株疑似肠球菌的菌株，通过对其形态特征及生理生化鉴定得到3株疑似粪肠球菌的菌株，对这3株菌进行16SrDNA鉴定，最终获得3株粪肠球菌，分别命名为HEW－S05、HEW－S09及HEW－S12。待3株粪肠球菌的安全性能和益生效果验证后，可通过后处理加工，作为饲料添加剂添加到动物饲料中。
参考文献
［1］杨洁彬，郭兴华，张境，等．乳酸菌一生物学基础及M］．北京：中国轻工业出版，1999．应用［［2］李梅，李卫芬，姚江涛．猪源肠球菌的分离及鉴定［J］．上海畜牧兽医通讯，2007（3）：48－50．
［3］王锂韫，李少英，等．酸马奶酒中粪肠球菌贺银凤，J］．食品科技，2006（12）：15－18．抑菌特性的研究［
M］．［4］等．常见细菌系统鉴定手册［东秀珠，蔡妙英，2001．北京：科学出版社，
［5］Ｒ．E．布坎南，N．E．吉本斯，等．伯杰氏细菌鉴定
M］．北京：科学出版社，1984．手册［［6］姜云，尹望，陈长卿，等．人参内生可培养细菌16SrDNA－ＲFLP分析［J］．东北林业大学学报，2012，40（8）：34－39．
［7］FullerＲ．Areviewprobioticsinmanandanimals［J］．J．Appl．Bacteriol，1989（66）：365－378．［8］M］．北京：化学工业出版社，2004．郭本恒．益生菌［
通信地址：北京市海淀区高梁桥斜街59号中
坤大厦903号
100044
S09和HEW－S12的基因组DNA，利用引物PrimedA和PrimedB对3株菌的16SrDNA进行PCＲ扩增，获得菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12的16SrDNA片段，从图2可见：片段大小均在1500bp左右。对16SrDNA的PCＲ扩增产物进行测序得到菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12的16SrDNA序列，其长度分别为1459、1472和1436bp
。
注：M为DNAMarkerDM2000，1为粪肠球菌模式菌株，2为HEW－AS05，
3为HEW－AS09，4为HEW－S12。
图216SrDNA基因PCＲ扩增电泳结果
将测序获得的序列用MEGA5.0构建系统进化树（见图3）进行序列比较分析，可以看出菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12均与粪肠球菌（E.faecalis）聚于同一分支中，其同源性分别达到99%。通过菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12的形态特征、生理生化及16SrDNA鉴定结果，判定菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12均为粪肠球菌（E.faecalis）
。
图3粪肠球菌和其他参考株16SrDNA序列的系统进化树
3结论
益生菌主要在动物肠道内发生作用，但大多数益生菌都是体外筛选得到。动物体内和体外环境差异很大，体外筛选得到的外源微生物想要发挥益生
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鸡源粪肠球菌的分离鉴定
杜志琳尹望
北京好实沃生物技术有限公司，北京101399
张艳萍
李雪平
试验选择9日龄健康肉仔鸡的肠道内容物，利用肠球菌琼脂培养基分离获得12株疑似肠球菌
的细菌。通过对12株菌的生态特征、培养和生理生化特征的测定，筛选3株疑似粪肠球菌的菌株进行16S
摘
要
rDNA分子鉴定，最终获得3株粪肠球菌，命名为HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12。为禽用微生态制剂的研制提供菌种来源。
关键词
粪肠球菌；分离鉴定；益生菌
文献标志码：A
文章编号：1002－2813（2015）15－0008－03
中图分类号：S858.31
DOI编号：10.13557/j.cnki.issn1002－2813.2015.15.003随着人们对抗生素滥用的弊端日益重视，益生菌的研制得到了人们的关注和欢迎。在饲料、农业、食品和医药保健等领域均有广泛应用，有着“患病治病，未病防病，无病保健”的优点，且绿色、安全及无残留，发展前景十分广阔。
研制益生菌制剂关键问题在于菌株筛选，粪肠球菌作为动物和人类肠道内的常居菌，通过长期进化与宿主形成共生关系，能够更好的适应动物体内环境，维持动物肠道菌群平衡，达到防治疾病的效1999）。1989年，粪肠球菌就被美国果（杨洁彬等，
FDA公布为可直接作用于动物的菌种之一。我国农业部2008年颁布的饲料添加剂品种目录中，粪肠球菌也包含在内。相对于严格厌氧的双歧杆菌，兼性厌氧的粪肠球菌更适合生产与应用（李梅等，2007）。粪肠球菌代谢分泌大量乳酸，可降低肠道pH，还能产生细菌素等抑菌物质，抑制沙门菌及大肠杆菌等致病菌的生长，改善肠道环境（王锂韫等，2006），保持机体健康。试验从健康肉仔鸡肠道内容物中筛选分离鸡源粪肠球菌，为禽用微生态饲料添加剂的研制奠定基础。
收稿日期：2015－06－29
第一作者：张艳萍，E－mail：[email protected]通信作者：尹望，E－mail：yinwang2010@163.
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1.1
材料与方法
试验材料分离材料
1.1.1
9日龄健康肉仔鸡取自北京某养鸡场。1.1.2菌种
粪肠球菌HEW－A102由北京好实沃生物技术有限公司提供，作为生理生化鉴定中的模式菌株，在MＲS培养基上培养。1.1.3主要培养基和试剂
细菌基因组DNA提取试剂十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）及三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱等均为进口试剂，粪肠球菌16SrDNAPCＲ扩展引物PrimedA：5'－AGAGTTT-GATCATGGCTCAG－3'和PrimedB：5'－TAGGGT-TACCTTGTTACGACTT－3'由上海生工生物工程有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶均购自上海生工生物工程有限公司；肠球菌琼脂，MＲS培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，LB培养基等；其他试剂均为国产分析纯试剂。1.1.4
试验仪器
JA2003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HZC－250型恒温振荡培养箱（江苏省太
仓市实验设备厂）；PB－10型数字酸度计（德国赛
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饲料研究FEEDＲESEAＲCHNO．15，2015
好实沃乳酸菌专栏
多利斯科学仪器（北京）有限公司）；MG48+型PCＲ仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；T－42K型高速冷冻离心机（德国KONTＲON公司）；GelDoc－It200型自动凝胶图像分析系统（Ultra－VioletProd-uctsLtd公司）。1.21.2.1
试验方法
粪肠球菌的分离纯化
取健康9日龄肉仔鸡肠道内容物，剖开，用无
分离，获得12株疑似肠球菌的菌株，并对这12株菌分别编号为HEW－S01、HEW－S02、……、HEW－S11和HEW－S12。以上12株细菌在MＲS平板上的菌落形态基本一致：乳白色，圆形，表面隆起，边缘整齐，直径0.5～1.5mm。革兰染色均呈阳性，无芽孢，菌体呈卵圆形，单个、成对或短链排列。图1为HEW－S05的菌落特征及显微形态
。
菌棉拭子从肠道内壁采集样品，用灭菌氯化钠注射
－5－3－4
液10倍逐级稀释到10，分别取10、10和10－5各100μL涂布于肠球菌琼脂培养基平板上，37℃培养1～2d后，挑取带棕色环的棕黑色菌落，在MＲS平板上划线分离纯化。纯化后的菌株转接至MＲS斜面上纯培养，于4℃冰箱保存备用。1.2.2
生理生化鉴定
主要检测项目：革兰染色，接触酶，精氨酸双
注：A为HEW－S05革兰染色形态，B为其在MＲS培养基上生长40h的单菌落形态。
图1
HEW－S05菌落特征及显微形态
水解酶，10、45和50℃生长，耐6.5%氯化钠，耐0.04%亚碲酸钾，葡萄糖氧化发酵及糖醇利用等生理生化试验。参照东秀珠等（2001）的《常见细菌系统鉴定手册》和布坎南等（1984）《伯杰氏系统鉴定手册》中的粪肠球菌的生理生化鉴定试验要求进行鉴定。
1.2.316SrDNA分子鉴定
参照姜云等（2012）的方法，采用CTAB法提取粪肠球菌基因组DNA。利用引物PrimedA和PrimedB对疑似粪肠球菌的16SrDNA基因片段进行PCＲ扩增分析，PCＲ反应体系（25μL）及扩增程序见表1，反应结束后，取5μLPCＲ产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，回收纯化所得PCＲ产物送往上海生工进行16SrDNA测序，利用BLAST分析所得16SrDNA序列的基因归属，并用MEGA5.0软件构建系统发育树对目的菌株进行分析。
表1
引物PrimedA引物PrimedBTaqDNA聚合酶10×TaqbufferMg2+（25mmoL/L）菌株基因组DNA
粪肠球菌的PCＲ反应体系及扩增程序
扩增程序
94℃预变性94℃变性53℃退火复性72℃延伸共30个循环72℃终延伸
5min1min1min1min30s10min
1.0μL1.0μL1.5U2.5μL1.5μL50ng
PCＲ反应体系（25μL）
2.2
生理生化鉴定结果
12株疑似肠球菌的菌株接触酶反应皆为阴性，
葡萄糖发酵不产气，均能在10和45℃生长，且可耐受6.5%氯化钠；详细的生理生化检测结果见表2。通过与粪肠球菌模式菌株对比，可初步鉴定HEW－S05、HEW－S09及HEW－S12为粪肠球菌。
表2
鉴定项目革兰染色接触酶10℃生长45℃生长50℃生长耐NaCl6.5%亚碲酸钾0.04%精氨酸双水解酶产气发酵葡萄糖乳糖蔗糖木糖棉籽糖蜜二糖鼠李糖甘油甘露醇山梨醇阿东醇
12株疑似肠球菌菌株的主要生理生化特征
粪肠
S01S02S03S04S05S06S07S08S09S10S11S12球菌+－++－+++－+++－－－++++－
+－++++－+－+++－－－－++－－
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结果与分析
细菌形态特征
通过肠球菌琼脂对肉仔鸡肠道内容物进行细菌
饲料研究FEEDＲESEAＲCHNO．15，2015
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2.3
16SrDNA分子鉴定结果
通过CTAB法提取获得菌株HEW－S05、HEW－性能，必须经过竞争、定植和排斥等过程在动物体内存活，而内源微生物因其同源性，能够快速在肠道内定植，平衡肠道菌群，发挥益生效果。因此，优良的益生菌应是从动物体内分离获得，而每种动物的的肠道菌群也有所不同，从动物体内分离得到的益生菌，应使用在和其同源的动物身上，这样才1989；郭本恒，能发挥最大的益生效果（Fuller等，
2004）。试验通过肠球菌琼脂从健康肉仔鸡肠道内容物中分离获得12株疑似肠球菌的菌株，通过对其形态特征及生理生化鉴定得到3株疑似粪肠球菌的菌株，对这3株菌进行16SrDNA鉴定，最终获得3株粪肠球菌，分别命名为HEW－S05、HEW－S09及HEW－S12。待3株粪肠球菌的安全性能和益生效果验证后，可通过后处理加工，作为饲料添加剂添加到动物饲料中。
参考文献
［1］杨洁彬，郭兴华，张境，等．乳酸菌一生物学基础及M］．北京：中国轻工业出版，1999．应用［［2］李梅，李卫芬，姚江涛．猪源肠球菌的分离及鉴定［J］．上海畜牧兽医通讯，2007（3）：48－50．
［3］王锂韫，李少英，等．酸马奶酒中粪肠球菌贺银凤，J］．食品科技，2006（12）：15－18．抑菌特性的研究［
M］．［4］等．常见细菌系统鉴定手册［东秀珠，蔡妙英，2001．北京：科学出版社，
［5］Ｒ．E．布坎南，N．E．吉本斯，等．伯杰氏细菌鉴定
M］．北京：科学出版社，1984．手册［［6］姜云，尹望，陈长卿，等．人参内生可培养细菌16SrDNA－ＲFLP分析［J］．东北林业大学学报，2012，40（8）：34－39．
［7］FullerＲ．Areviewprobioticsinmanandanimals［J］．J．Appl．Bacteriol，1989（66）：365－378．［8］M］．北京：化学工业出版社，2004．郭本恒．益生菌［
通信地址：北京市海淀区高梁桥斜街59号中
坤大厦903号
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S09和HEW－S12的基因组DNA，利用引物PrimedA和PrimedB对3株菌的16SrDNA进行PCＲ扩增，获得菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12的16SrDNA片段，从图2可见：片段大小均在1500bp左右。对16SrDNA的PCＲ扩增产物进行测序得到菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12的16SrDNA序列，其长度分别为1459、1472和1436bp
。
注：M为DNAMarkerDM2000，1为粪肠球菌模式菌株，2为HEW－AS05，
3为HEW－AS09，4为HEW－S12。
图216SrDNA基因PCＲ扩增电泳结果
将测序获得的序列用MEGA5.0构建系统进化树（见图3）进行序列比较分析，可以看出菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12均与粪肠球菌（E.faecalis）聚于同一分支中，其同源性分别达到99%。通过菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12的形态特征、生理生化及16SrDNA鉴定结果，判定菌株HEW－S05、HEW－S09和HEW－S12均为粪肠球菌（E.faecalis）
。
图3粪肠球菌和其他参考株16SrDNA序列的系统进化树
3结论
益生菌主要在动物肠道内发生作用，但大多数益生菌都是体外筛选得到。动物体内和体外环境差异很大，体外筛选得到的外源微生物想要发挥益生
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