0514 分子排阻色谱法
子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过调节洗脱液
p H 值或离子强度可提高或降低洗脱液的洗脱能力；在洗脱
液内加人适当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善 色谱峰峰形。制备洗脱液的水应经过纯化处理，电阻率大 于18M n «c m 。使用的洗脱液需经脱气处理，常采用氦气 等惰性气体在线脱气的方法，也可采用超声、减压过滤或 冷冻的方式进行离线脱气。
•
(3) 检测器电导检测器是离子色谱常用的检测器，
其他检测器有安培检测器、紫外检测器、蒸发光散射检测
BE 益塗寺。
电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和 部分极性有机物，如羧酸等。离子色谱法中常采用抑制型 电导检测器，即使用抑制器将具有较髙电导率的洗脱液在 进入检测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电 导率的溶液，从而显著提高电导检测的灵敏度。
安培检测器用于分析解离度低、但具有氧化或还原性 质的化合物。直流安培检测器可以测定碘离子（r ) 、硫 氰酸根离子（s c n _) 和各种酚类化合物等。积分安培检 测器和脉冲安培检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化 合物。
紫外检测器适用于在髙浓度氯离子等存在下痕量的溴 离子
（Br **) 、亚
硝酸根离子（N 02—) 、硝酸根离子
(n o 3-) 以及其他具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍 生-紫外检测法常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属 离子等。
原子吸收光谱、原子发射光谱（包括电感耦合等离子 体原子发射光谱）、质谱（包括电感耦合等离子体质谱） 也可作为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检 测器或（和）质谱检测器等联用时，一般采用带有抑制器 的离子色谱系统。
2. 样品处理
对于基质简单的澄清水溶液一般通过稀释和经
0. 45pm 滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品，
可通过微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干扰 物后进样分析。
3. 系统适用性试验
照高效液相色谱法（通则0512) 项下相应的规定。
4. 测定法(1) 内标法(2) 外标法(3) 面积归一化法
上述（1) 〜(3) 法的具体内容均同髙效液相色谱法
(通则0512) 项下相应的规定。
(4) 标准曲线法按各品种项下的规定，精密称 (量）取对照品适量配制成贮备溶液。分别量取贮备溶液
配制成一系列梯度浓度的标准溶液。取上述梯度浓度的标 准溶液各适量注人色谱仪，记录色谱图，测量标准溶液中 待测组分的峰面积或峰髙。以标准溶液中待测组分的峰面 积或峰髙为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，固归计
通则26
中国药典2015年版
算标准曲线，其公式为：
式中A R 为标准溶液中待测组分的峰面积或峰高；
CR 为标准溶液的浓度； a 为标准曲线的斜率；6为标准曲线的截距。
再取各品种项下供试品溶液适量，注人色谱仪，记录 色谱图，测量供试品溶液中待测组分的峰面积或峰高。按 下式计算其浓度：
cs 一= A -----s— 6
a
式中八5为供试品溶液中待测组分的峰面积或峰高；
cs 为供试品溶液的浓度；a 、6符号的意义同上。
上述测定法中，以外标法和标准曲线法最为常用。
0514分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离 的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶 色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经过 修饰的凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex ) 和琼脂糖凝胶
(Sepharose)等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同孔
径尺寸的孔，药物分子进人色谱柱后，它们中的不同组分 按其分子大小进人相应的孔内，大于所有孔径的分子不能 进人填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流 动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的 分子能自由进人填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留 时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小 依次被洗脱。
1. 对仪器的一般要求
分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色 谱法（通则0512) ，液相色谱泵一般分常压、中压和高压 泵。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中， 通常采用高效分子排阻色谱法（H P S E C ) 。应选用与供试 品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为 水溶液或缓冲溶液，溶液的p H 值不宜超出填充剂的耐受 力，一般p H 值在2〜8范围。流动相中可加人适量的有 机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%，流速不宜过 快，一般为 0. 5〜1. Oml/min。
2. 系统适用性试验
分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数（《) 、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法（通则0512) 项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：
p _
二聚体的峰高
K —单体与二聚体之间的谷高
中国药典2015年版
除另有规定外，分离度应大于2.0。
3. 测定法
(1) 分子量测定法一般适用于蛋白质和多肽的分子
量测定。按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大 小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的标准物质，除另有 规定外，标准物质与供试品均需使用二硫苏糖醇（D T T ) 和十二烷基硫酸钠（S D S ) 处理，以打开分¥内和分子间 的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋 白质和多肽分子通常以线性形式分离，以标准物质分子量
(M w ) 的对数值对相应的保留时间（化）制得标准曲线的
线性回归方程lgMw
+ ，供试品以保留时间由标准
曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
(2) 生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有 分子大小不均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分 子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子 聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结构与 性质相同或相似的标准物质十分重要。
按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用 分子量标准物质和适宜的G P C 软件，以标准物质重均分 子量（A L ) 的对数值对相应的保留时间U R ) 制得标准 曲线的线性回归方程l g i ^=a + &R ，供试品采用适宜的
G P C 软件处理结果，并按下列公式计算出供试品的分子
量与分子量分布。
M w = 2
(RIM,) /^R l
D =M V J/Mn
式中为数均分子量；
八1为重均分子量；D 为分布系数；
尺/,为供试品在保留时间〗时的峰高；
M , 为供试品在保留时间〗时的分子量。
(3) 高分子杂质测定法高分子杂质系指供试品中含
有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在生产或贮存 过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能 产生过敏反应的高分子物质。
按各品种项下规定的色谱条件进行分离。定量方法
①主成分自身对照法同高效液相色谱法（通则
0512) 项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。
②面积归一化法同高效液相色谱法（通则0512) 项下规定^
③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小 于标准物质保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物 质的控制。
④自身对照外标法一般用于Sephadex 010凝胶色 谱系统中/? ■•内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离
0521气相色谱法
系统中，除部分寡聚物外，■内酰胺抗生素中高分子杂质 在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一 的色谱峰，以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品 中高分子杂质的相对百分含量。
【附注】Sephadex G-10的处理方法
色谱柱的填装装柱前先将约15g 葡聚糖凝胶
Sephadex G-10用水浸泡48小峙，使之充分溶胀，搅拌除
去空气泡，徐徐倾人玻璃或其他适宜材质的柱，一次性装 填完毕，以免分层，然后用水将附着玻璃管壁的Sephadex
G~10洗下，使色谱柱面平整，新填装的色谱柱要先用水
连续冲洗4〜6小时，以排出柱中的气泡。
供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直 接将供试品加在床的表面（此时，先将床表面的流动相吸 干或渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加 人，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗人固定 相后，再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3〜5m 丨流动相，以 洗下残留在色谱管壁的供试品溶液）。
0521气相色谱法
气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填 充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物 气化后，被载气带人色谱柱进行分离，各组分先后进人检 测器，用数据处理系统记录色谱信号。
1. 对仪器的一般要求
所用的仪器为气相色谱仪，由载气源、进样部分、色 谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。进样部 分、色谱柱和检测器的温度均应根据分析要求适当设定。
(1) 载气源气相色谱法的流动相为气体，称为载
气，氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体 发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速经过进 样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载 气，除另有规定外，常用载气为氮气。
(2) 进样部分进样方式一般可采用溶液直接进样、
自动进样或顶空进样。
溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流 装置的气化室进样；采用溶液直接进样或自动进样时，进 样口温度应髙于柱温30〜50°C;进样量一般不超过数微升； 柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以 免过载。
顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分 离和测定。将固态或液态的供试品制成供试液后，置于密 闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性 组分在液态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体 积的顶空气注人色谱柱中。
(3) 色谱柱色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的
材质为不锈钢或玻璃，内径为2〜4m m ，柱长为2〜4m ，
通则27
0514 分子排阻色谱法
子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过调节洗脱液
p H 值或离子强度可提高或降低洗脱液的洗脱能力；在洗脱
液内加人适当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善 色谱峰峰形。制备洗脱液的水应经过纯化处理，电阻率大 于18M n «c m 。使用的洗脱液需经脱气处理，常采用氦气 等惰性气体在线脱气的方法，也可采用超声、减压过滤或 冷冻的方式进行离线脱气。
•
(3) 检测器电导检测器是离子色谱常用的检测器，
其他检测器有安培检测器、紫外检测器、蒸发光散射检测
BE 益塗寺。
电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和 部分极性有机物，如羧酸等。离子色谱法中常采用抑制型 电导检测器，即使用抑制器将具有较髙电导率的洗脱液在 进入检测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电 导率的溶液，从而显著提高电导检测的灵敏度。
安培检测器用于分析解离度低、但具有氧化或还原性 质的化合物。直流安培检测器可以测定碘离子（r ) 、硫 氰酸根离子（s c n _) 和各种酚类化合物等。积分安培检 测器和脉冲安培检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化 合物。
紫外检测器适用于在髙浓度氯离子等存在下痕量的溴 离子
（Br **) 、亚
硝酸根离子（N 02—) 、硝酸根离子
(n o 3-) 以及其他具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍 生-紫外检测法常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属 离子等。
原子吸收光谱、原子发射光谱（包括电感耦合等离子 体原子发射光谱）、质谱（包括电感耦合等离子体质谱） 也可作为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检 测器或（和）质谱检测器等联用时，一般采用带有抑制器 的离子色谱系统。
2. 样品处理
对于基质简单的澄清水溶液一般通过稀释和经
0. 45pm 滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品，
可通过微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干扰 物后进样分析。
3. 系统适用性试验
照高效液相色谱法（通则0512) 项下相应的规定。
4. 测定法(1) 内标法(2) 外标法(3) 面积归一化法
上述（1) 〜(3) 法的具体内容均同髙效液相色谱法
(通则0512) 项下相应的规定。
(4) 标准曲线法按各品种项下的规定，精密称 (量）取对照品适量配制成贮备溶液。分别量取贮备溶液
配制成一系列梯度浓度的标准溶液。取上述梯度浓度的标 准溶液各适量注人色谱仪，记录色谱图，测量标准溶液中 待测组分的峰面积或峰髙。以标准溶液中待测组分的峰面 积或峰髙为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，固归计
通则26
中国药典2015年版
算标准曲线，其公式为：
式中A R 为标准溶液中待测组分的峰面积或峰高；
CR 为标准溶液的浓度； a 为标准曲线的斜率；6为标准曲线的截距。
再取各品种项下供试品溶液适量，注人色谱仪，记录 色谱图，测量供试品溶液中待测组分的峰面积或峰高。按 下式计算其浓度：
cs 一= A -----s— 6
a
式中八5为供试品溶液中待测组分的峰面积或峰高；
cs 为供试品溶液的浓度；a 、6符号的意义同上。
上述测定法中，以外标法和标准曲线法最为常用。
0514分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离 的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶 色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经过 修饰的凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex ) 和琼脂糖凝胶
(Sepharose)等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同孔
径尺寸的孔，药物分子进人色谱柱后，它们中的不同组分 按其分子大小进人相应的孔内，大于所有孔径的分子不能 进人填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流 动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的 分子能自由进人填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留 时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小 依次被洗脱。
1. 对仪器的一般要求
分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色 谱法（通则0512) ，液相色谱泵一般分常压、中压和高压 泵。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中， 通常采用高效分子排阻色谱法（H P S E C ) 。应选用与供试 品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为 水溶液或缓冲溶液，溶液的p H 值不宜超出填充剂的耐受 力，一般p H 值在2〜8范围。流动相中可加人适量的有 机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%，流速不宜过 快，一般为 0. 5〜1. Oml/min。
2. 系统适用性试验
分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数（《) 、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法（通则0512) 项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：
p _
二聚体的峰高
K —单体与二聚体之间的谷高
中国药典2015年版
除另有规定外，分离度应大于2.0。
3. 测定法
(1) 分子量测定法一般适用于蛋白质和多肽的分子
量测定。按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大 小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的标准物质，除另有 规定外，标准物质与供试品均需使用二硫苏糖醇（D T T ) 和十二烷基硫酸钠（S D S ) 处理，以打开分¥内和分子间 的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋 白质和多肽分子通常以线性形式分离，以标准物质分子量
(M w ) 的对数值对相应的保留时间（化）制得标准曲线的
线性回归方程lgMw
+ ，供试品以保留时间由标准
曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
(2) 生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有 分子大小不均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分 子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子 聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结构与 性质相同或相似的标准物质十分重要。
按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用 分子量标准物质和适宜的G P C 软件，以标准物质重均分 子量（A L ) 的对数值对相应的保留时间U R ) 制得标准 曲线的线性回归方程l g i ^=a + &R ，供试品采用适宜的
G P C 软件处理结果，并按下列公式计算出供试品的分子
量与分子量分布。
M w = 2
(RIM,) /^R l
D =M V J/Mn
式中为数均分子量；
八1为重均分子量；D 为分布系数；
尺/,为供试品在保留时间〗时的峰高；
M , 为供试品在保留时间〗时的分子量。
(3) 高分子杂质测定法高分子杂质系指供试品中含
有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在生产或贮存 过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能 产生过敏反应的高分子物质。
按各品种项下规定的色谱条件进行分离。定量方法
①主成分自身对照法同高效液相色谱法（通则
0512) 项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。
②面积归一化法同高效液相色谱法（通则0512) 项下规定^
③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小 于标准物质保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物 质的控制。
④自身对照外标法一般用于Sephadex 010凝胶色 谱系统中/? ■•内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离
0521气相色谱法
系统中，除部分寡聚物外，■内酰胺抗生素中高分子杂质 在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一 的色谱峰，以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品 中高分子杂质的相对百分含量。
【附注】Sephadex G-10的处理方法
色谱柱的填装装柱前先将约15g 葡聚糖凝胶
Sephadex G-10用水浸泡48小峙，使之充分溶胀，搅拌除
去空气泡，徐徐倾人玻璃或其他适宜材质的柱，一次性装 填完毕，以免分层，然后用水将附着玻璃管壁的Sephadex
G~10洗下，使色谱柱面平整，新填装的色谱柱要先用水
连续冲洗4〜6小时，以排出柱中的气泡。
供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直 接将供试品加在床的表面（此时，先将床表面的流动相吸 干或渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加 人，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗人固定 相后，再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3〜5m 丨流动相，以 洗下残留在色谱管壁的供试品溶液）。
0521气相色谱法
气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填 充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物 气化后，被载气带人色谱柱进行分离，各组分先后进人检 测器，用数据处理系统记录色谱信号。
1. 对仪器的一般要求
所用的仪器为气相色谱仪，由载气源、进样部分、色 谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。进样部 分、色谱柱和检测器的温度均应根据分析要求适当设定。
(1) 载气源气相色谱法的流动相为气体，称为载
气，氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体 发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速经过进 样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载 气，除另有规定外，常用载气为氮气。
(2) 进样部分进样方式一般可采用溶液直接进样、
自动进样或顶空进样。
溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流 装置的气化室进样；采用溶液直接进样或自动进样时，进 样口温度应髙于柱温30〜50°C;进样量一般不超过数微升； 柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以 免过载。
顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分 离和测定。将固态或液态的供试品制成供试液后，置于密 闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性 组分在液态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体 积的顶空气注人色谱柱中。
(3) 色谱柱色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的
材质为不锈钢或玻璃，内径为2〜4m m ，柱长为2〜4m ，
通则27