[摘要] 目的：研究汉黄芩素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和增殖的影响，同时观察汉黄芩素对MDA-MB-231细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响，进一步探讨其分子作用机制。方法：MTT法检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞生长的影响；Ki-67法检测汉黄芩素对细胞增殖的影响；划痕实验、黏附试验和侵袭小室法检测对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blotting检测对增殖和转移相关蛋白及相关信号通路的影响。结果：汉黄芩素能明显抑制MDA-MB-231细胞生长和增殖；低浓度情况下明显抑制乳腺癌细胞的迁移、黏附和侵袭能力；汉黄芩素有效抑制MDA-MB-231细胞Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白的表达。结论：汉黄芩素明显抑制乳腺癌细胞生长和增殖，并抑制MDA-MB-231细胞迁移、黏附、侵袭，其对MDA-MB-231细胞的侵袭和黏附影响可能与其降低ICAM-1，MMP-2，MMP-9表达有关。
[关键词] 汉黄芩素；凋亡；迁移；侵袭
[收稿日期] 2013-09-06
[基金项目] 福建省自然科学基金项目（2012D047）；厦门市科技项目（3502Z20134043）
[通信作者] 黄恺飞，博士，E-mail： [email protected]；刁勇，博士生导师，E-mail： [email protected]
汉黄芩素是植物黄芩的主要活性成分之一，是一种黄酮类化合物，主要存在于植物的根和茎中。汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护和抗病毒等[1]，尤其在抗肿瘤活性方面，成为国内外研究的一个热点。 目前研究表明，汉黄芩素对多种肿瘤细胞都具有抑制作用，其机制主要包括：上调p53，Bax/Bcl-2的比值，下调Survivin诱导细胞凋亡[2-4]；抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路[5]，阻滞细胞周期由G1期向G2期过渡[6]；下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），同时抑制血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的磷酸化，从而抑制肿瘤血管生成等[7-8]。本课题组同样发现汉黄芩素对肺癌、乳腺癌具有良好的抑制作用[4，9]。虽然汉黄芩素的抗肿瘤活性成为众多研究人员关注的热点，但是其研究广度与深度尚不足，其确切机制尚不清楚。本研究观察了汉黄芩素对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、增殖、迁移、侵袭的影响，为汉黄芩素在抗乳腺癌的临床应用及其作用机制的深入研究提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 细胞株、试剂和仪器 乳腺癌MDA-MB-231细胞由本实验室保存并提供。兔抗人细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1），MMP-9，MMP-2，Survivin，Bcl-2多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多克隆抗体均为武汉博士德生物工程有限公司产品；Ki-67检测试剂盒购自南京凯基生物公司；汉黄芩素（wogonin）购自Sigma公司（纯度>98%）。RPMI 1640 培养液干粉和小牛血清为Gibco公司产品；化学发光试剂盒、蛋白定量试剂盒、纤黏连蛋白（fibrinectin，FN）和层黏连蛋白（laminin，LM） 为Sigma公司产品；Thincert侵袭小室为Greiner公司产品。酶标仪为美国MD公司产品；倒置相差显微镜为Nikon公司产品；垂直电泳槽凝胶和成像仪及分析系统均为Bio-Rad 公司产品。
1.2 MTT 法检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞活力的影响 MDA-MB-231 细胞培养于含10%胎牛血清1640培养基中，将对数生长期的肿瘤细胞消化、计数，9×103个/孔铺于96孔板，过夜后加入以1640培养液配制的汉黄芩素至终浓度分别为10，20，40，80，160，320 μmol·L-1，对照组仅加入相应体积的培养液，每一浓度设6个平行孔，继续培养44 h，弃上清，每孔加入无血清1640培养液溶解的MTT（50 mg/孔），37 ℃，5%CO2细胞培养箱孵育4 h，弃上清，以DMSO溶解蓝紫色颗粒，于酶标仪570 nm处测吸光度，再计算细胞抑制率。
1.3 Ki-67流式细胞仪检测法观察对细胞增殖的影响 采用爬片法收集细胞，即将细胞接种于孔底放置了洁净盖玻片的6孔培养板中，每孔含1×105个细胞，置37 ℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞贴壁后加入汉黄芩素，分别为50，100，150 μmol·L-1 3个浓度，药物作用48 h后收集细胞，0.3 mL PBS 重悬细胞，慢慢加入0.7 mL预冷100%乙醇，4 ℃孵育1 h。离心沉淀细胞，加入0.5 mL 2 mol·L-1的HCl含0.5% Triton X-100，室温孵育30 min。沉淀细胞并且移去上清，用0.5 mL 0.1 mol·L-1四硼酸钠重悬细胞2 min，沉淀细胞。用150 μL PBS/1%BSA洗细胞1次，50 μL 0.5%聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯（tween-20）/1%BSA/PBS重悬细胞，加10～20 μL （1 μg/106个） Ki67（mAb，1∶100）在室温下孵育1 h。沉淀细胞用 150 μL PBS/1% BSA洗1次。沉淀细胞用50 μL 0.5% tween-20/1%BSA/PBS重悬，加5 μL（1 μg/106个），羊抗鼠二抗-FITC，室温下孵育30 min。沉淀细胞转移至FACS管子，流式细胞仪检测。 1.4 细胞黏附实验 分别将FN，LM各2.0 μg铺于96孔板，室温干燥后，用含1%的BSA培养液1640封闭过夜，PBS洗3次，以含0.1% BSA的无血清1640培养液悬浮MDA-MB-231细胞，每孔加入8×103个细胞，加药组同时加入以含0.1%BSA的无血清1640培养液配制的汉黄芩素至终浓度10，20，30 μmol·L-1，37 ℃，5% CO2细胞培养箱中孵育4 h，PBS轻轻吹打，洗去未黏附的细胞，弃去残余PBS，每孔加入100 μL无血清1640培养液溶解MTT（50 mg/孔），于细胞培养箱中继续培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，室温震荡10 min，充分混匀，酶标仪测定570 nm处吸光度。细胞黏附率以黏附细胞与总细胞570 nm的比值来表示。
1.5 细胞迁移实验 将MDA-MB-231细胞按6×104个/孔的密度接种到24孔培养板中，培养24 h，待细胞长成均匀单层后，用无菌的10 μL移液器枪头沿着细胞孔的中轴线轻轻划过。采用37 ℃于处理的PBS缓冲液冲洗，除去细胞残骸，加入含浓度为10，20，30 μmol·L-1的汉黄芩素的培养液，继续培养0.5～1 h后，以这一时间作为零时间点，分别在0，12，24，36 h这4个时间点，用倒置光学显微镜观察细胞迁移情况，并利用目镜刻度尺测量划痕宽度（S），每孔测量5处（即两端、中点、左1/4 处和右1/4 处），求平均值，每组细胞均设3个平行孔。按照如下公式计算细胞迁移率（migration rate，MR）=[（S零时间点-S对应时间点）/S零时间点]×100%。
1.6 细胞侵袭实验 取对数生长期的MDA-MB-231细胞用0.025%EDTA/PBS消化并重悬于含0.1% BSA的无血清RPMI 1640培养基中，调细胞浓度为2.5×105个/mL，向Transwell小室中加入200 μL含浓度为10，20，30 μmol·L-1汉黄芩素的单细胞悬液（即5.0×104个细胞）；24孔细胞培养板中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培养基，37 ℃温育24 h。取出Transwell小室，甲醇-冰醋酸（3∶1）混合液处理固定10 min，然后用10%姬姆萨染液染色15～30 min；将膜用蒸馏水漂洗干净后，在倒置光学显微镜下（200倍）随机选取6个视野（上、下、左、右各1个，中央2个）计数，阳性细胞呈紫色。
1.7 Western blotting检测增殖和迁移相关蛋白 采用浓度为50，100，150 μmol·L-1的汉黄芩素处理MDA-MB-231细胞24 h，以未加药组为对照组，离心收集细胞，提取细胞总蛋白，12% SDS-PAGE分离蛋白（100 V电流） 2 h，分离后的蛋白电转移至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上，用含10%脱脂奶粉的封闭液封闭后，加入兔抗人Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9多克隆抗体（1∶200 稀释），4 ℃反应过夜，用TBST缓冲液漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体，室温条件下反应2 h，最后采用化学发光法显色，其中以β-actin作为内对照。目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达灰度/内参蛋白表达灰度×100%。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计学软件进行分析。计量数据以±s表示，数据两两比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析，以P 2 结果
2.1 汉黄芩素对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长和增殖的影响 不同浓度（10，20，40，80，160，320 μmol·L-1）的汉黄芩素作用MDA-MB-231细胞24，48，72 h 后，随着汉黄芩素浓度的增加，细胞存活率降低，有明显的剂量依赖关系，汉黄芩素48，72 h IC50为（152±4.6），（108±2.6） μmol·L-1（图1）。Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，其表达量与细胞增殖呈正相关。当汉黄芩素作用于MDA-MB-231细胞48 h后，流式细胞仪检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞Ki-67蛋白的影响。空白组Ki-67阳性率为（84±5.2）%，50，100，150 μmol·L-1汉黄芩素作用后阳性率分别为（62±4.7）%，（21±3.8）%，（14±2.1）%（图2）。表明汉黄芩素明显抑制了MDA-MB-231细胞增殖，以上结果表明汉黄芩素可以有效抑制乳腺癌细胞生长和增殖。
2.2 汉黄芩素对MDA-MB-231细胞迁移、黏附、侵袭的影响 划痕实验表明，细胞在汉黄芩素10，20，30 μmol·L-1后，36 h内的迁移率表现出明显的降低（图3），表明汉黄芩素可以有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231二维迁移。MTT法检测不同浓度（10，20，30 μmol·L-1）的汉黄芩素对MDA-MB-231细胞与LM和FN黏附能力的影响。结果显示，汉黄芩对MDA-MB-231细胞和LM，FN的黏附能力均有明显的影响；汉黄芩浓度为30 μmol·L-1时对MDA-MB-231细胞的黏附抑制影响较为明显，与空白组比较，差异有统计学意义（P-1时，MDA-MB-231细胞从Thincert 侵袭小室上室穿过8 μm孔径的PET膜迁移到下室的细胞数目表现出轻微的减少， 细胞数目为（215±4） 个。当剂量增大到20，30 μmol·L-1时，迁移细胞数目逐渐减少，细胞数目分别为（98±3），（41±3） 个，对照组为（248±5） 个（图5）。表明汉黄芩素可以显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231在三维水平上的迁移。 2.3 汉黄芩素对乳腺癌细胞Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白表达的影响 汉黄芩素能导致人乳腺癌细胞MDA-MB-231中Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白表达明显下调，并随着汉黄芩素的浓度升高而降低，呈一定浓度依赖性。提示汉黄芩素可能通过抑制Survivin表达而抑制细胞增殖。同时减少ICAM-1，MMP-2，MMP-9基因表达而抑制乳腺癌细胞的黏附、转移和侵袭（图6）。
3 讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的7%～10%，全世界每年新发乳腺癌约150万例，死亡57万例，而且发病率目前有增高趋势，有可能超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤的首位[10]，寻找具有低毒、高效的抗乳腺癌药物成为广大科研人员的重要任务。
癌细胞脱离它们本身的细胞群而在别的器官上停留下来，在其他的部位形成新的肿瘤，这种现象称为癌细胞转移，肿瘤的转移使得肿瘤通过现有的方法治疗变得更加困难。因此，调控肿瘤细胞的迁移、转移也是治疗肿瘤的一种有效方法。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，是一种重要的表面黏附分子，它们往往在人体正常组织不表达或很少表达，而在一些恶性肿瘤中过度表达，因此，在肿瘤细胞的黏附和侵袭转移过程中其可能具有重要的作用。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能降解胞外基质的膜结合蛋白，在促进癌转移方面起重要作用。研究表明，在MMPs家族中，癌细胞分泌的明胶酶/四型胶原酶（MMP-2和MMP-9）在癌细胞侵袭和转移方面是十分重要的，因为肿瘤细胞要实现远端传播，必须穿过血管壁中富含四型胶原的基质膜。细胞凋亡是受基因控制的，存活素（survivin）是一种在人类众多恶性肿瘤组织中广泛表达而在正常终末分化组织中不表达或低表达的凋亡抑制蛋白，具有调控细胞凋亡和细胞周期的双重功能，其过度表达在人多种肿瘤的发生、发展及预后中具有重要作用[11]。
本研究表明，汉黄芩素能明显诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡并抑制其黏附、迁移和侵袭能力，降低乳腺癌细胞的转移；进一步研究发现其抑制增殖可能与降低Survivin表达有关，其抗肿瘤转移可能是通过抑制ICAM-1，MMP-2，MMP-9来实现。汉黄芩素抗肿瘤的分子机制颇为复杂，本研究将为汉黄芩素的抗肿瘤研究提供部分研究基础，有助于其进一步的新药开发研究。
[参考文献]
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[4] Huang K F， Zhang G D， Huang Y Q， et al. Wogonin induces apoptosis and down-regulates survivin in human breast cancer MCF-7 cells by modulating PI3K-AKT pathway[J]. Int J Immunopharmacol， 2012 （12）：334.
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[10] Jemal A， Siegel R， Xu J， et al. Cancer statisitics，2010[J]. Cancer J Clin， 2010， 60（5）：277.
[11] Altieri D C. Survivin， versatilemodulation of cell division and apoptosis in cancer[J]. Oncogene， 2003， 22（53）：8581.
Experimental study on inhibitory effect of wogonin on
proliferation and invasion of breast cancer cells
HUANG Kai-fei， ZHUANG Yuan， HUANG Yi-qi， DIAO Yong
（1.Institute of Molecular Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China；
2.Drug Research and Development Center， Xiamen Medicine Research Institute， Xiamen 361003， China）
[Abstract] Objective： To study the inhibitory effect of wogonin on the growth and proliferation of breast cancer cells MDA-MB-23， and observe its effect on the adhesion， migration and invasion of MDA-MB-23 cells， in order to further study its molecular mechanism. Method： MTT assay was used to detect the effect of wogonin on MDA-MB-23 cell growth. Ki-67 assay was adopted to test the effect of wogonin on cell proliferation. Scratch test， adherence test and invasion chamber assay were taken to detect the effect on the migration and invasion abilities of MDA-MB-231 cells. Proliferation and metastasis-related proteins and relevant signaling pathways were detected by Western blotting. Result： Wogonin could remarkably inhibit the growth and proliferation of MDA-MB-231 cells， significantly inhibit migration， adhesion and invasion abilities of breast cancer cells at a low concentration， and effectively inhibit the expression of Survivin， Bcl-2， ICAM-1， MMP-2， MMP-9 proteins of MDA-MB-231 cells. Conclusion： Wogonin could notably inhibit growth and proliferation of breast cancer cells， and inhibit migration， adhesion and invasion of MDA-MB-231 cells. Its invasive and adhesive effects on MDA-MB-231 cells may be related to the decrease in ICAM-1， MMP-2， MMP-9 expressions.
[Key words] wogonin； apoptosis； migration； invasion
doi：10.4268/cjcmm20140824
[责任编辑 张宁宁]
[摘要] 目的：研究汉黄芩素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和增殖的影响，同时观察汉黄芩素对MDA-MB-231细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响，进一步探讨其分子作用机制。方法：MTT法检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞生长的影响；Ki-67法检测汉黄芩素对细胞增殖的影响；划痕实验、黏附试验和侵袭小室法检测对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blotting检测对增殖和转移相关蛋白及相关信号通路的影响。结果：汉黄芩素能明显抑制MDA-MB-231细胞生长和增殖；低浓度情况下明显抑制乳腺癌细胞的迁移、黏附和侵袭能力；汉黄芩素有效抑制MDA-MB-231细胞Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白的表达。结论：汉黄芩素明显抑制乳腺癌细胞生长和增殖，并抑制MDA-MB-231细胞迁移、黏附、侵袭，其对MDA-MB-231细胞的侵袭和黏附影响可能与其降低ICAM-1，MMP-2，MMP-9表达有关。
[关键词] 汉黄芩素；凋亡；迁移；侵袭
[收稿日期] 2013-09-06
[基金项目] 福建省自然科学基金项目（2012D047）；厦门市科技项目（3502Z20134043）
[通信作者] 黄恺飞，博士，E-mail： [email protected]；刁勇，博士生导师，E-mail： [email protected]
汉黄芩素是植物黄芩的主要活性成分之一，是一种黄酮类化合物，主要存在于植物的根和茎中。汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护和抗病毒等[1]，尤其在抗肿瘤活性方面，成为国内外研究的一个热点。 目前研究表明，汉黄芩素对多种肿瘤细胞都具有抑制作用，其机制主要包括：上调p53，Bax/Bcl-2的比值，下调Survivin诱导细胞凋亡[2-4]；抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路[5]，阻滞细胞周期由G1期向G2期过渡[6]；下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），同时抑制血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的磷酸化，从而抑制肿瘤血管生成等[7-8]。本课题组同样发现汉黄芩素对肺癌、乳腺癌具有良好的抑制作用[4，9]。虽然汉黄芩素的抗肿瘤活性成为众多研究人员关注的热点，但是其研究广度与深度尚不足，其确切机制尚不清楚。本研究观察了汉黄芩素对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、增殖、迁移、侵袭的影响，为汉黄芩素在抗乳腺癌的临床应用及其作用机制的深入研究提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 细胞株、试剂和仪器 乳腺癌MDA-MB-231细胞由本实验室保存并提供。兔抗人细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1），MMP-9，MMP-2，Survivin，Bcl-2多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多克隆抗体均为武汉博士德生物工程有限公司产品；Ki-67检测试剂盒购自南京凯基生物公司；汉黄芩素（wogonin）购自Sigma公司（纯度>98%）。RPMI 1640 培养液干粉和小牛血清为Gibco公司产品；化学发光试剂盒、蛋白定量试剂盒、纤黏连蛋白（fibrinectin，FN）和层黏连蛋白（laminin，LM） 为Sigma公司产品；Thincert侵袭小室为Greiner公司产品。酶标仪为美国MD公司产品；倒置相差显微镜为Nikon公司产品；垂直电泳槽凝胶和成像仪及分析系统均为Bio-Rad 公司产品。
1.2 MTT 法检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞活力的影响 MDA-MB-231 细胞培养于含10%胎牛血清1640培养基中，将对数生长期的肿瘤细胞消化、计数，9×103个/孔铺于96孔板，过夜后加入以1640培养液配制的汉黄芩素至终浓度分别为10，20，40，80，160，320 μmol·L-1，对照组仅加入相应体积的培养液，每一浓度设6个平行孔，继续培养44 h，弃上清，每孔加入无血清1640培养液溶解的MTT（50 mg/孔），37 ℃，5%CO2细胞培养箱孵育4 h，弃上清，以DMSO溶解蓝紫色颗粒，于酶标仪570 nm处测吸光度，再计算细胞抑制率。
1.3 Ki-67流式细胞仪检测法观察对细胞增殖的影响 采用爬片法收集细胞，即将细胞接种于孔底放置了洁净盖玻片的6孔培养板中，每孔含1×105个细胞，置37 ℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞贴壁后加入汉黄芩素，分别为50，100，150 μmol·L-1 3个浓度，药物作用48 h后收集细胞，0.3 mL PBS 重悬细胞，慢慢加入0.7 mL预冷100%乙醇，4 ℃孵育1 h。离心沉淀细胞，加入0.5 mL 2 mol·L-1的HCl含0.5% Triton X-100，室温孵育30 min。沉淀细胞并且移去上清，用0.5 mL 0.1 mol·L-1四硼酸钠重悬细胞2 min，沉淀细胞。用150 μL PBS/1%BSA洗细胞1次，50 μL 0.5%聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯（tween-20）/1%BSA/PBS重悬细胞，加10～20 μL （1 μg/106个） Ki67（mAb，1∶100）在室温下孵育1 h。沉淀细胞用 150 μL PBS/1% BSA洗1次。沉淀细胞用50 μL 0.5% tween-20/1%BSA/PBS重悬，加5 μL（1 μg/106个），羊抗鼠二抗-FITC，室温下孵育30 min。沉淀细胞转移至FACS管子，流式细胞仪检测。 1.4 细胞黏附实验 分别将FN，LM各2.0 μg铺于96孔板，室温干燥后，用含1%的BSA培养液1640封闭过夜，PBS洗3次，以含0.1% BSA的无血清1640培养液悬浮MDA-MB-231细胞，每孔加入8×103个细胞，加药组同时加入以含0.1%BSA的无血清1640培养液配制的汉黄芩素至终浓度10，20，30 μmol·L-1，37 ℃，5% CO2细胞培养箱中孵育4 h，PBS轻轻吹打，洗去未黏附的细胞，弃去残余PBS，每孔加入100 μL无血清1640培养液溶解MTT（50 mg/孔），于细胞培养箱中继续培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，室温震荡10 min，充分混匀，酶标仪测定570 nm处吸光度。细胞黏附率以黏附细胞与总细胞570 nm的比值来表示。
1.5 细胞迁移实验 将MDA-MB-231细胞按6×104个/孔的密度接种到24孔培养板中，培养24 h，待细胞长成均匀单层后，用无菌的10 μL移液器枪头沿着细胞孔的中轴线轻轻划过。采用37 ℃于处理的PBS缓冲液冲洗，除去细胞残骸，加入含浓度为10，20，30 μmol·L-1的汉黄芩素的培养液，继续培养0.5～1 h后，以这一时间作为零时间点，分别在0，12，24，36 h这4个时间点，用倒置光学显微镜观察细胞迁移情况，并利用目镜刻度尺测量划痕宽度（S），每孔测量5处（即两端、中点、左1/4 处和右1/4 处），求平均值，每组细胞均设3个平行孔。按照如下公式计算细胞迁移率（migration rate，MR）=[（S零时间点-S对应时间点）/S零时间点]×100%。
1.6 细胞侵袭实验 取对数生长期的MDA-MB-231细胞用0.025%EDTA/PBS消化并重悬于含0.1% BSA的无血清RPMI 1640培养基中，调细胞浓度为2.5×105个/mL，向Transwell小室中加入200 μL含浓度为10，20，30 μmol·L-1汉黄芩素的单细胞悬液（即5.0×104个细胞）；24孔细胞培养板中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培养基，37 ℃温育24 h。取出Transwell小室，甲醇-冰醋酸（3∶1）混合液处理固定10 min，然后用10%姬姆萨染液染色15～30 min；将膜用蒸馏水漂洗干净后，在倒置光学显微镜下（200倍）随机选取6个视野（上、下、左、右各1个，中央2个）计数，阳性细胞呈紫色。
1.7 Western blotting检测增殖和迁移相关蛋白 采用浓度为50，100，150 μmol·L-1的汉黄芩素处理MDA-MB-231细胞24 h，以未加药组为对照组，离心收集细胞，提取细胞总蛋白，12% SDS-PAGE分离蛋白（100 V电流） 2 h，分离后的蛋白电转移至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上，用含10%脱脂奶粉的封闭液封闭后，加入兔抗人Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9多克隆抗体（1∶200 稀释），4 ℃反应过夜，用TBST缓冲液漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体，室温条件下反应2 h，最后采用化学发光法显色，其中以β-actin作为内对照。目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达灰度/内参蛋白表达灰度×100%。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计学软件进行分析。计量数据以±s表示，数据两两比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析，以P 2 结果
2.1 汉黄芩素对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长和增殖的影响 不同浓度（10，20，40，80，160，320 μmol·L-1）的汉黄芩素作用MDA-MB-231细胞24，48，72 h 后，随着汉黄芩素浓度的增加，细胞存活率降低，有明显的剂量依赖关系，汉黄芩素48，72 h IC50为（152±4.6），（108±2.6） μmol·L-1（图1）。Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，其表达量与细胞增殖呈正相关。当汉黄芩素作用于MDA-MB-231细胞48 h后，流式细胞仪检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞Ki-67蛋白的影响。空白组Ki-67阳性率为（84±5.2）%，50，100，150 μmol·L-1汉黄芩素作用后阳性率分别为（62±4.7）%，（21±3.8）%，（14±2.1）%（图2）。表明汉黄芩素明显抑制了MDA-MB-231细胞增殖，以上结果表明汉黄芩素可以有效抑制乳腺癌细胞生长和增殖。
2.2 汉黄芩素对MDA-MB-231细胞迁移、黏附、侵袭的影响 划痕实验表明，细胞在汉黄芩素10，20，30 μmol·L-1后，36 h内的迁移率表现出明显的降低（图3），表明汉黄芩素可以有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231二维迁移。MTT法检测不同浓度（10，20，30 μmol·L-1）的汉黄芩素对MDA-MB-231细胞与LM和FN黏附能力的影响。结果显示，汉黄芩对MDA-MB-231细胞和LM，FN的黏附能力均有明显的影响；汉黄芩浓度为30 μmol·L-1时对MDA-MB-231细胞的黏附抑制影响较为明显，与空白组比较，差异有统计学意义（P-1时，MDA-MB-231细胞从Thincert 侵袭小室上室穿过8 μm孔径的PET膜迁移到下室的细胞数目表现出轻微的减少， 细胞数目为（215±4） 个。当剂量增大到20，30 μmol·L-1时，迁移细胞数目逐渐减少，细胞数目分别为（98±3），（41±3） 个，对照组为（248±5） 个（图5）。表明汉黄芩素可以显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231在三维水平上的迁移。 2.3 汉黄芩素对乳腺癌细胞Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白表达的影响 汉黄芩素能导致人乳腺癌细胞MDA-MB-231中Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白表达明显下调，并随着汉黄芩素的浓度升高而降低，呈一定浓度依赖性。提示汉黄芩素可能通过抑制Survivin表达而抑制细胞增殖。同时减少ICAM-1，MMP-2，MMP-9基因表达而抑制乳腺癌细胞的黏附、转移和侵袭（图6）。
3 讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的7%～10%，全世界每年新发乳腺癌约150万例，死亡57万例，而且发病率目前有增高趋势，有可能超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤的首位[10]，寻找具有低毒、高效的抗乳腺癌药物成为广大科研人员的重要任务。
癌细胞脱离它们本身的细胞群而在别的器官上停留下来，在其他的部位形成新的肿瘤，这种现象称为癌细胞转移，肿瘤的转移使得肿瘤通过现有的方法治疗变得更加困难。因此，调控肿瘤细胞的迁移、转移也是治疗肿瘤的一种有效方法。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，是一种重要的表面黏附分子，它们往往在人体正常组织不表达或很少表达，而在一些恶性肿瘤中过度表达，因此，在肿瘤细胞的黏附和侵袭转移过程中其可能具有重要的作用。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能降解胞外基质的膜结合蛋白，在促进癌转移方面起重要作用。研究表明，在MMPs家族中，癌细胞分泌的明胶酶/四型胶原酶（MMP-2和MMP-9）在癌细胞侵袭和转移方面是十分重要的，因为肿瘤细胞要实现远端传播，必须穿过血管壁中富含四型胶原的基质膜。细胞凋亡是受基因控制的，存活素（survivin）是一种在人类众多恶性肿瘤组织中广泛表达而在正常终末分化组织中不表达或低表达的凋亡抑制蛋白，具有调控细胞凋亡和细胞周期的双重功能，其过度表达在人多种肿瘤的发生、发展及预后中具有重要作用[11]。
本研究表明，汉黄芩素能明显诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡并抑制其黏附、迁移和侵袭能力，降低乳腺癌细胞的转移；进一步研究发现其抑制增殖可能与降低Survivin表达有关，其抗肿瘤转移可能是通过抑制ICAM-1，MMP-2，MMP-9来实现。汉黄芩素抗肿瘤的分子机制颇为复杂，本研究将为汉黄芩素的抗肿瘤研究提供部分研究基础，有助于其进一步的新药开发研究。
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Experimental study on inhibitory effect of wogonin on
proliferation and invasion of breast cancer cells
HUANG Kai-fei， ZHUANG Yuan， HUANG Yi-qi， DIAO Yong
（1.Institute of Molecular Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China；
2.Drug Research and Development Center， Xiamen Medicine Research Institute， Xiamen 361003， China）
[Abstract] Objective： To study the inhibitory effect of wogonin on the growth and proliferation of breast cancer cells MDA-MB-23， and observe its effect on the adhesion， migration and invasion of MDA-MB-23 cells， in order to further study its molecular mechanism. Method： MTT assay was used to detect the effect of wogonin on MDA-MB-23 cell growth. Ki-67 assay was adopted to test the effect of wogonin on cell proliferation. Scratch test， adherence test and invasion chamber assay were taken to detect the effect on the migration and invasion abilities of MDA-MB-231 cells. Proliferation and metastasis-related proteins and relevant signaling pathways were detected by Western blotting. Result： Wogonin could remarkably inhibit the growth and proliferation of MDA-MB-231 cells， significantly inhibit migration， adhesion and invasion abilities of breast cancer cells at a low concentration， and effectively inhibit the expression of Survivin， Bcl-2， ICAM-1， MMP-2， MMP-9 proteins of MDA-MB-231 cells. Conclusion： Wogonin could notably inhibit growth and proliferation of breast cancer cells， and inhibit migration， adhesion and invasion of MDA-MB-231 cells. Its invasive and adhesive effects on MDA-MB-231 cells may be related to the decrease in ICAM-1， MMP-2， MMP-9 expressions.
[Key words] wogonin； apoptosis； migration； invasion
doi：10.4268/cjcmm20140824
[责任编辑 张宁宁]