【摘要】 目的 研究 滋补肾阴方药对d-半乳糖（d-gal）所致衰老小鼠自由基代谢及免疫功能的 影响 。 方法 采用d-gal复制衰老小鼠模型。测定衰老小鼠血清中丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性，胸腺指数和脾指数，脾脏t淋巴细胞增殖活性及血清中白介素-2（il-2）水平，并观察滋补肾阴方药对上述指标的影响。结果滋补肾阴方药能明显提高血清中sod活性，降低血清中mda含量，并提高胸腺指数、脾指数，脾脏t淋巴细胞增殖活性和血清中il-2水平。结论抑制脂质过氧化反应，提高抗氧化酶活性，改善免疫功能可能是滋补肾阴方药延缓衰老的作用机制之一。
【关键词】 中医药疗法 衰老模型 自由基 免疫
自由基损伤和免疫功能低下是老化的重要机制之一。 目前 ，中医延缓衰老研究以补肾占居绝对优势，温补肾阳延衰的研究已取得了一些进展［1］，而滋补肾阴抗衰老的作用研究不多［2］。根据中医学阴阳互根，阴阳平衡的 理论 ，补肾阴、补肾阳应该具有同等重要的作用。左归饮是中医滋补肾阴的代表名方，由熟地、山药、枸杞、炙甘草、茯苓和山茱萸组成，具有延缓衰老的功效［3］，现已被用于临床 治疗 一些老年性疾病如冠心病、糖尿病等，效果较好。据此立滋补肾阴法作为延缓衰老治则，并观察经典方剂左归饮对d-半乳糖拟衰小鼠自由基代谢及免疫功能有关指标的影响。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物昆明种小鼠30只，2月龄，体重为(20±2.0)g，雌雄各半，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号为scxk（苏）2002-0018。
1.1.2 药品左归饮，由熟地、山药、枸杞、炙甘草、茯苓、山茱萸按9∶6∶6∶3∶4∶5比例组成。以上药物一次性购于安徽芜湖健康大药房，并经鉴定。上方常规水煎3次，合并滤液浓缩至生药含量0.577 5 g/ml，高压灭菌，4℃冷藏保存备用。
1.1.3 试剂与仪器d-半乳糖为上海试剂二厂产品。mda、sod测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。il-2检测盒为晶美生物工程有限公司产品。刀豆蛋白a（cona）、四甲基偶氮唑盐（mtt），华美生物工程公司出品。测定仪器为722分光光度计；550型酶联免疫检测仪。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与给药昆明种小鼠30只，适应性喂养1周后随机分为3组，即正常对照组、模型对照组、滋补肾阴组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，其余各组每只颈背皮下注射5％d-半乳糖0.5 ml，1次/d，连用6周，造成衰老模型。正常对照组颈背皮下注射同等剂量生理盐水。造模的同时，正常对照组和模型对照组每只每天灌服生理盐水0.5 ml，滋补肾阴组按5.5 g/(kg·d)剂量灌服左归饮煎液（相当于成人剂量的10倍）。
1.2.2 指标检测用药6周后，停药，禁食24 h，称重。无菌取脾脏和胸腺，同时摘眼球取血2 ml，3 000 r/min，离心5 min，分离血清。小鼠血清中mda含量、sod活性和il-2水平测定均严格按试剂盒说明书要求进行。
丙二醛（mda）测定：采用硫代巴比妥酸法测定血清中mda含量。
超氧化物歧化酶（sod）测定：采用黄嘌呤氧化酶法测定血清中sod活性。
胸腺指数和脾脏指数测定：称重后 计算 ，单位mg/g体重。
胸腺指数（%）=胸腺重量小鼠重量×100%
脾脏指数（%）= 脾脏重量小鼠重量×100%
脾脏t淋巴细胞增殖活性测定：采用mtt法测定，将各组小鼠断头处死，无菌摘取脾脏。常规制备脾细胞悬液，用rpmi-1640完全营养液调浓度为5×106/ml。于96孔培养板上，每孔加入100 μl脾细胞悬液，100 μl cona溶液（终浓度4 μg/ml），各3复孔，置37℃、5%co2及饱和湿度条件下，培养48 h，终止前4 h，每孔加mtt 10 μl，培养结束后弃上清，每孔
加入0.08 mol/l盐酸异丙醇100 μl /孔，轻轻振荡后，继续孵育1 h，酶标仪测570 nm od值。
【摘要】 目的 研究 滋补肾阴方药对d-半乳糖（d-gal）所致衰老小鼠自由基代谢及免疫功能的 影响 。 方法 采用d-gal复制衰老小鼠模型。测定衰老小鼠血清中丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性，胸腺指数和脾指数，脾脏t淋巴细胞增殖活性及血清中白介素-2（il-2）水平，并观察滋补肾阴方药对上述指标的影响。结果滋补肾阴方药能明显提高血清中sod活性，降低血清中mda含量，并提高胸腺指数、脾指数，脾脏t淋巴细胞增殖活性和血清中il-2水平。结论抑制脂质过氧化反应，提高抗氧化酶活性，改善免疫功能可能是滋补肾阴方药延缓衰老的作用机制之一。
【关键词】 中医药疗法 衰老模型 自由基 免疫
自由基损伤和免疫功能低下是老化的重要机制之一。 目前 ，中医延缓衰老研究以补肾占居绝对优势，温补肾阳延衰的研究已取得了一些进展［1］，而滋补肾阴抗衰老的作用研究不多［2］。根据中医学阴阳互根，阴阳平衡的 理论 ，补肾阴、补肾阳应该具有同等重要的作用。左归饮是中医滋补肾阴的代表名方，由熟地、山药、枸杞、炙甘草、茯苓和山茱萸组成，具有延缓衰老的功效［3］，现已被用于临床 治疗 一些老年性疾病如冠心病、糖尿病等，效果较好。据此立滋补肾阴法作为延缓衰老治则，并观察经典方剂左归饮对d-半乳糖拟衰小鼠自由基代谢及免疫功能有关指标的影响。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物昆明种小鼠30只，2月龄，体重为(20±2.0)g，雌雄各半，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号为scxk（苏）2002-0018。
1.1.2 药品左归饮，由熟地、山药、枸杞、炙甘草、茯苓、山茱萸按9∶6∶6∶3∶4∶5比例组成。以上药物一次性购于安徽芜湖健康大药房，并经鉴定。上方常规水煎3次，合并滤液浓缩至生药含量0.577 5 g/ml，高压灭菌，4℃冷藏保存备用。
1.1.3 试剂与仪器d-半乳糖为上海试剂二厂产品。mda、sod测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。il-2检测盒为晶美生物工程有限公司产品。刀豆蛋白a（cona）、四甲基偶氮唑盐（mtt），华美生物工程公司出品。测定仪器为722分光光度计；550型酶联免疫检测仪。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与给药昆明种小鼠30只，适应性喂养1周后随机分为3组，即正常对照组、模型对照组、滋补肾阴组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，其余各组每只颈背皮下注射5％d-半乳糖0.5 ml，1次/d，连用6周，造成衰老模型。正常对照组颈背皮下注射同等剂量生理盐水。造模的同时，正常对照组和模型对照组每只每天灌服生理盐水0.5 ml，滋补肾阴组按5.5 g/(kg·d)剂量灌服左归饮煎液（相当于成人剂量的10倍）。
1.2.2 指标检测用药6周后，停药，禁食24 h，称重。无菌取脾脏和胸腺，同时摘眼球取血2 ml，3 000 r/min，离心5 min，分离血清。小鼠血清中mda含量、sod活性和il-2水平测定均严格按试剂盒说明书要求进行。
丙二醛（mda）测定：采用硫代巴比妥酸法测定血清中mda含量。
超氧化物歧化酶（sod）测定：采用黄嘌呤氧化酶法测定血清中sod活性。
胸腺指数和脾脏指数测定：称重后 计算 ，单位mg/g体重。
胸腺指数（%）=胸腺重量小鼠重量×100%
脾脏指数（%）= 脾脏重量小鼠重量×100%
脾脏t淋巴细胞增殖活性测定：采用mtt法测定，将各组小鼠断头处死，无菌摘取脾脏。常规制备脾细胞悬液，用rpmi-1640完全营养液调浓度为5×106/ml。于96孔培养板上，每孔加入100 μl脾细胞悬液，100 μl cona溶液（终浓度4 μg/ml），各3复孔，置37℃、5%co2及饱和湿度条件下，培养48 h，终止前4 h，每孔加mtt 10 μl，培养结束后弃上清，每孔
加入0.08 mol/l盐酸异丙醇100 μl /孔，轻轻振荡后，继续孵育1 h，酶标仪测570 nm od值。